Name: neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Författarna uppskattar råd och tekniskt stöd tillhandahålls av Dr Richard Konz och personal vid flödescytometrisystem Core Facility vid University of Massachusetts Medical School. Kärna resurser som stöds av Diabetes Endokrinologi Research Center Grant DK032520 användes också. Detta arbete stöds av anslag från National Institute of Mental Health (NIMH), National Institute of Drug Abuse (Nida) och National Institute of Child Health and Human Development.

Nuclei Extraktion <ol><li> Sätt 250 mg frysta obduktion hjärnvävnad i 5 ml lyseringsbuffert 1 i en douncer och placera den på is. För att ta emot ca 5 miljoner kärnor efter FACS sortering, använder vi oftast 1000 mg av vävnad per prov. </li><li> När vävnad har tinat, dounce vävnaden i 1 minut medan på is. </li><li> Ta det homogeniserade vävnad och placera den i en 15 ml klar ultracentrifugen rör. Sätt röret på is. </li><li> Ta 9 mL sackaroslösning 2 med en pipett, placera pipett ...

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

Protokollet presenteras här bör vara särskilt användbart för studier fokuserade på epigenetiska förändringar av neuronala kromatin och mer allmänt, om den molekylära fenotyp av den neuronala kärnan, under normal utveckling och åldrande, eller i neurologisk eller psykiatrisk sjukdom. Metoden är särskilt fördel när cellulära heterogenitet hjärnvävnad, inklusive eventuella förändringar i neuron till Glia ranson under åldrande eller på grund av sjukdom är ett bekymmer 1. Till exempel genom att kombinera de nuv...

Reagens: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lyseringsbuffert </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Sackaros </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetat) 2 </td><td> 150 l </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 l </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 l </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 l </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Justera volymen till 50 ml med autoklaverad vatten </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Sackaroslösning </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sackaros </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetat) 2 </td><td> 150 l </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 l </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 l </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Justera volymen till 50 ml med autoklaverad vatten </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce buffert </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mm </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Justera pH till 7,5 och volymen till 200 ml med autoklaverad vatten </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Nervceller i den mänskliga hjärnan blir postmitotic till stor del under prenatal utveckling och därmed bibehålla sin kärnor genom hela livslängd. Dock är lite känt om förändringar i neuronala kromatin och kärnkraft organisation under utveckling och åldrande, eller kronisk neuropsykiatriska sjukdomar. Men hittills mest kromatin och DNA baserade analyser (andra än fiskar) saknar en enda cell upplösning. I detta syfte ställer stora cellulära heterogena hjärnvävnaden en betydande begränsning, eftersom det vanligtvis olika subpopulationer av nervceller samsas med olika typer av Glia och andra icke-neuronala celler. En möjlig lösning skulle vara att växa celltyp specifika kulturer, men de flesta CNS-celler, även neuroner, är ex vivo hållbara, i bästa fall endast ett par veckor och därmed skulle ge en ofullständig modell för epigenetiska mekanismer kan vara verksamma över hela livslängden . Här ger vi ett protokoll för att extrahera och rena kärnor från fryst (aldrig fast) mänskliga döden hjärnan. Metoden innebär extraktion av kärnor i hypoton lyseringsbuffert, följt av ultracentrifugering och immunotagging med anti-Neun antikropp. Märkta neuronala kärnor sedan samlas in separat med hjälp av fluorescens-aktiverade sortering. Denna metod bör tillämpas på alla hjärnan region i ett brett spektrum av arter och lämpar sig för kromatin immunoprecipitation studier med plats-och ombyggnad specifika anti-histon antikroppar, samt för DNA-metylering och andra analyser.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Det cellulära heterogenitet av hjärnvävnad utgör en betydande begränsning för studier av epigenetiska märkningar i kromatin eftersom de flesta analyser saknar enda cell upplösning. Nervceller vanligtvis samsas med Glia och andra icke-neuronala celler. Vi erbjuder ett protokoll för att hämta och samla neuronala kärnor från mänskliga hjärnan.

Neuronal Nuclei Isolering från Human obduktion hjärnvävnad

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

En kromatin-analys för mänskliga hjärnvävnaden

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Erhålla hög kvalitet RNA från Single cellpopulationer i Human obduktion hjärnvävnad

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinitetsbaserade Isolering av Tagged Kärnor från<em&gt; Drosophila</em&gt; Vävnader för Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolering från mus Pankreas: En Ribonuclease rika Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Berikar avkastningen av mänskliga melanocyter från vuxna hudvävnader

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Kärnorolering från helvävnad med hjälp av ett rengöringsmedel och enzymfri metod

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kvantitativt proteomikarbetsflöde med hjälp av flera reaktionsövervakningsbaserade detektion av proteiner från mänsklig hjärnvävnad

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Kärnisolering från vuxen musnjure för RNA-sekvensering med en kärna

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering och terapeutisk tillämpning av extracellulära vesiklar från odlade humana mesenkymala stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...