مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Summary

هذا الفيديو المقالة ، خطوة خطوة ، وكيفية معالجة عينة السائل المنوي لتحقيق نوعية جيدة من مضان في الموقع التهجين على الحيوانات المنوية البشرية. يمكن استخدامها للكشف عن الاستعدادات التي تم الحصول عليها عدم توازن الصبغيات في سياق التشخيص السريري.

Abstract

[أنيوبلويدي] هي شذوذ الكروموسومات الأكثر شيوعا لدى البشر. معظم هذه التشوهات الناتجة عن أخطاء أثناء عملية الانتصافي مكون للأعراس في الآباء. في الذكور الإنسان ، يمكن لهذه الأخطاء تؤدي الى انتاج الحيوانات المنوية مع شذوذ الكروموسومات العددية التي تمثل زيادة مخاطر انتقال هذه الحالات الشاذة في النسل.

لهذا السبب ، أصبح أسلوب التهجين مضان في الموضع (FISH) في نواة الحيوان المنوي بروتوكول أدرجت على نطاق واسع في سياق التشخيص السريري. هذه الممارسة توفر تقديرا للترددات شذوذ صبغي العددي في الأمشاج من المرضى التي تسعى للحصول على المشورة الإنجابية الوراثية.

حتى الآن ، فإن الكروموسومات في معظم الأحيان المدرجة في تحليل FISH الحيوانات المنوية هي الكروموسومات X ، Y ، 13 ، 18 و 21.

هذا الفيديو المقالة ، خطوة خطوة ، وكيفية معالجة وإصلاح عينة السائل المنوي البشري ، وكيفية decondense وتفسد لونين الحيوانات المنوية ، وكيفية المضي قدما للحصول على الاستعدادات السمكية الحيوانات المنوية ، وكيفية تصور النتائج في المجهر. وترد ملاحظات خاصة من الخطوات الأكثر ملاءمة لتحقيق أفضل النتائج.

Protocol

أولا تجهيز العينات وتثبيت الخلية

1. ترك عينة السائل المنوي في حاويات معقمة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقائق حتى تسييل.
2. نقل العينة إلى أنابيب الطرد المركزي وانها تدور في 1000g لمدة 5 دقائق.
3. إزالة بلطف وتجاهل طاف به ماصة باستور.
4. إضافة محلول ناقص التوتر (بوكل ، 0.075M) قبل تسخينها عند 37 درجة مئوية ، قطرة قطرة ، في حين أن الاختلاط في دوامة الحصول على الحجم النهائي من 10 مل.
5. وضع الأنبوب في حمام مائي عند 37 لمدة 30 دقائق درجة مئوية.
6. الطرد المركزي في 1000g لمدة 5 دقائق. تجاهل بعناية من قبل طاف إبانة ، دون الإخلال بيليه.
7. بعد إعادة التعليق على بيليه ، إضافة الطازجة Carnoy لتثبيتي (الميثانول 03:01 : حامض الخليك) قطرة قطرة في حين خلط في دوامة الحصول على الحجم النهائي من 8 ملم.
8. كرر النقاط 6 و 7 عدة مرات حسب الضرورة للحصول على بيليه الأبيض.
9. إضافة الميثانول الطازجة : حمض الخليك (3:1) قطرة قطرة لضبط الحجم النهائي للتركيز الخلوية المطلوبة للحصول على الخلايا الجيدة تنتشر (في تلك الحالات مع بيليه الصغيرة ، وسوف يكون كافيا قطرات قليلة بينما العينات مع كمية عالية تعافى من الحيوانات المنوية ، يمكن أن تصل إلى الحجم النهائي 1-2 مل). ويمكن إجراء اختبار الشريحة من خلال إسقاط نموذج معلق على شريحة غير مدهون وتفحص تحت المجهر مرحلة التباين. وسيتيح هذا للتحقق من التشتت الخلوية التي تم الحصول عليها ، وسيسمح تصحيح ذلك ، إذا كان ذلك ضروريا ، في شرائح أخرى.
10. لجعل التمديد ، تسقط من على ارتفاع لا يقل عن 40 سم اثنين أو ثلاث قطرات من التعليق الخلية في وسط الشرائح unfrosted (المخزنة سابقا في الميثانول في -20 درجة مئوية إلى أزل الشحم منهم). لتمكين الموقع من العينة في جميع أنحاء البروتوكول ، بمناسبة منطقة تحتوي على الحيوانات المنوية التمديد على الجانب الآخر من الشريحة باستخدام قلم الماس.
11. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
    ملاحظة : إضافة الميثانول : حمض الخليك (3:1) قطرة قطرة بينما الاختلاط هو خطوة مهمة جدا لتجنب تشكيل الحصى الحيوانات المنوية.

II. Decondensation

1. الشرائح المخزنة في -20 درجة مئوية ويجب أن تواصل مطلق مع بروتوكول (تركها في درجة حرارة الغرفة).
2. ضع الشريحة في علبتين coplin متتالية مع 2X حل سيترات الصوديوم المالحة (2xSSC) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
3. نقل الشريحة من خلال سلسلة من يغسل الايثانول لمدة 2 دقيقة في كل جرة coplin. تبدأ الايثانول 70 ٪ ، اتبع بنسبة 90 ٪ وتنتهي مع 100 ٪. تجف الشريحة تركها في درجة حرارة الغرفة.
4. احتضان الشريحة في حل dithiothreitol (1،4 - dithiothreitol 5mm ، و 1 ٪ تريتون X - 100 ، 2 - الأمينية - 2 - (hydroxymethyl) -1،3 - propanediol 50mM) عند 37 درجة مئوية في الحاضنة لdecondense لونين. هذا المنتج يعمل عن طريق كسر جسور ثاني كبريتيد لفائف protamines أن الحمض النووي في نواة الحيوانات المنوية. هذه خطوة مهمة جدا ليتم ضغط كبير على الحمض النووي في نواة الحيوان المنوي. ولا بد من تعديل فترة حضانة الشرائح في حل dithiothreitol (DTT) وفقا لنموذج التفاعل لهذا المنتج. عادة ، وهذا الوقت هو حوالي 8 دقائق ، على الرغم من أنه يمكن أن تختلف من 2 إلى 15 دقيقة.
5. على الفور ، ونقل الشريحة لعلبتين coplin متتالية مع 2xSSC لمدة 3 دقائق في كل coplin.
6. تواصل من خلال وضع الشريحة من خلال سلسلة من يغسل الايثانول لمدة 2 دقيقة في كل جرة coplin (70 ٪ ، 90 ٪ و 100 ٪ الايثانول). اسمحوا الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة : التعرض المفرط لDTT شأنه أن يؤدي إلى تفريق إشارات السمكية في نهاية هذا الإجراء ، في حين أن التعرض قصير جدا من شأنه أن يؤدي إلى نقص في بعض الاشارات.

III. تهجين

1. تفسد الحمض النووي الحيوانات المنوية التي يحتضنها الشريحة في جرة coplin formamide مع الحل (70 ٪ Formamide/2xSSC) عند 73 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
2. نقل الشريحة من خلال حلول الايثانول لمدة 1 دقيقة لكل جرة coplin (تبدأ الايثانول 70 ٪ ، 85 ٪ وتنتهي ب 100 ٪). ترك الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة.
3. مباشرة إضافة 5 لتر من المقابلة الجاهزة للاستخدام خليط تحقيق لزلة غطاء 15x15 (AneuVysion دقق الفحص لوحة متعددة الألوان : CEP 18/X/Y أو LSI 13/21).
4. كما هو مبين في الفيديو ، بدقة مكان الشريحة على زلة لتغطي مجتمعة في المنطقة المستهدفة ، والخليط التحقيق. الختم مع الاسمنت المطاطي.
5. مكان الانزلاق الى ما قبل 37 درجة مئوية درجة حرارة الغرفة التهجين (HYBrite ™) وذلك في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 6-24 ساعات.
   ملاحظة : لما كان تمسخ من عينة الحيوانات المنوية غير إلزامية ، ويتحدد على ضرورة تغيير طبيعة تحقيقات من قبل الشركة المصنعة. ومخاليط التحقيق المستخدمة في هذا البروتوكول تكون جاهزة للاستخدام ، وفي هذه الحالة ، ليس مطلوبا تمسخ التحقيق.
   فإن حجم الخليط التحقيق تختلف وفقا لحجم المساحة المهجنة.

رابعا. يغسلبعد التهجين

1. اخراج الشريحة من غرفة التهجين.
2. إزالة المطاط والأسمنت سحب بعناية زلة تغطية الانزلاق برفق إلى الجانب.
3. للقضاء على إشارات التهجين غير محدد مكان الشريحة لمدة 2 دقيقة في وعاء مع coplin 0.4xSSC/0.3 NP - 40 ٪ قبل حرارة بلغت 73 درجة مئوية في حمام مائي.
4. نقل الشريحة إلى حل 2xSSC/0.1 ٪ NP - 40 يغسل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. اسمحوا الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة.
5. إضافة منتج counterstaining الى المنطقة المستهدفة (8 لتر لتغطية زلة 18x18). المنتج الأكثر شيوعا هو 4 "،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي ، Vysis شركة).
6. كما هو مبين في الفيديو ، وتغطي المنطقة المهجنة مع انزلاق الغطاء (للحفاظ على تهجين يمكن اغلاق الغطاء زلة مع طلاء الأظافر).
7. تخزين الشرائح المهجنة في -20 درجة مئوية في الظلام حتى تحليل احتمال الخاصة بهم. ويمكن في ظل هذه الظروف يمكن تخزين الشرائح لمدة تصل إلى 12 شهرا دون فقدان كبير في شدة إشارة مضان.
   ملاحظة : ارتفاع درجة الحرارة أو وقت غسل المفرطة يمكن أن تؤدي إلى القضاء على بعض الإشارات ، في حين أن العكس لن تغسل التهجين المسبار غير محددة.
   فإن حجم الناتج counterstaining أضاف تختلف وفقا لحجم المنطقة لتغطية التهجين.

خامسا التصور

ويمكن تقييم التحضيرات تحت المجهر epifluorescence مجهزة تصفية ثلاثي الموجات للدابي / تكساس الأحمر / FITC والفرقة واحد المرشحات لأكوا ، FITC الأحمر وتكساس. يجب أن يتبع المعايير القياسية لتقييم التقييم الصحيح للنواة الحيوان المنوي ^1.

وينبغي إعداد المهجنة مع تحقيقات للكروموسومات X ، Y ، و 18 إشارة لعرض هذه الكروموسومات الثلاثة. يجب على كل الحيوانات المنوية طبيعية تظهر إشارة واحدة زرقاء (المقابلة لكروموسوم 18) ، وإشارة خضراء (X - تحمل الحيوانات المنوية) أو إشارة حمراء (Y - تحمل الحيوانات المنوية).

وينبغي في إعداد تحقيقات عن تهجين مع الكروموسومات 13 و 21 ، اشارة خضراء لكروموسوم 13 و إشارة حمراء لكروموسوم 21 تكون متميزة في كل الحيوانات المنوية طبيعية.

Discussion

هذا البروتوكول توضح كيفية معالجة عينات السائل المنوي البشرية للحصول على الاستعدادات السمكية الحيوانات المنوية. باستخدام هذا البروتوكول أنه من الممكن لتحليل شذوذ الكروموسومات في الأمشاج الذكور. فحص الحيوانات المنوية وعدم توازن الصبغيات التطبيقات سواء في سياق البح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Material	Roche Group	10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Material	Roche Group	10708976001
Acetic acid	Material	Merck & Co., Inc.	100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit 20xSaline-Sodium Citrate 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II) CEP 18/X/Y DNA probe NP-40 LSI 13/21 DNA probe	Material	Vysis Inc.	32-161075 30-805850 30-804941 30-171077 30-804820 30-171078
Centrifuge 5804R	Tool	Eppendorf
Centrifuge tube	Material	Nalge Nunc international	347856
Coplin jar (glass)	Material	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)	Material	Deltalab	191087
Cover slips (15x15)	Material	Knittel Glaser	4600115
Cover slips (18x18)	Material	Knittel Glaser	4600118
Diamond pencil	Material	Hammacher	335117010
Ethanol	Material	Merck & Co., Inc.	100.983
Formamide	Material	Roche Group	11814320001
Freezer	Tool	Zanussi
Gloves	Material	Sanyo	101/3300
HYBrite™	Tool	Vysis Inc.
Immersion Oil	Material	Olympus Corporation	35505
Incubator	Tool	Heraeus Instruments
Methanol	Material	Merck & Co., Inc.	106.009
Micropipette	Material	Labsystems	Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip	Material	Daslab	16-2001
Nail varnish	Material	Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope	Tool	Olympus Corporation		Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.
Pasteur Pipette	Material	Rubilabor	211.0230
Phase contrast microscope	Tool	Nikon Instruments
Plastic pipette (3ml)	Material	Deltalab	200007
Potassium chloride (KCl)	Material	Fluka	60128
Rubber cement	Material	Best-test
Slides	Material	Knittel Glaser	4520022
Slide Saver Boxes	Material	Deltalab	19276.1
Sterile container	Material	Deltalab	409726
Syringe	Material	PentaFerte	002022300
Thermometer	Material	Comark Instruments, Inc	KM12
Tri-distilled water	Material
Triton X-100	Material	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tweezers	Material	B. Braun Medical	Aesculap (BD224R)
Vertical laminar flow hood	Tool	Burdinola	OR-ST 1500
Vortex mixer	Tool	Fisher Scientific	FB15012
Water bath	Tool	Raypa®