פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Summary

זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, כיצד תהליך דגימת זרע כדי להשיג באיכות טובה פלואורסצנטי באתרו הכלאה על בזרע אנושי. ההכנות שהושגו ניתן להשתמש להקרנה aneuploidy בהקשר של אבחנה קלינית.

Abstract

Aneuploidies הם פגמים בכרומוזומים השכיח ביותר בבני אדם. רוב הפרעות אלו נובעות שגיאות meiotic בתהליך gametogenic אצל ההורים. אצל גברים אנושיים, שגיאות אלה יכולים להוביל לייצור של זרע עם הפרעות כרומוזום מספריים המייצגים סיכון מוגבר להעברת אנומליות אלה לצאצאים.

מסיבה זו, את הטכניקה של הקרינה הכלאה באתרו (FISH) על גרעין הזרע הפך פרוטוקול שולבו נרחב בהקשר של אבחנה קלינית. בפועל זה מספק אומדן של תדרים של הפרעות כרומוזום מספריים הגמטות של המטופלים המבקשים ייעוץ גנטי הרבייה.

עד כה, את הכרומוזומים כללו לרוב בניתוח FISH הזרע הם כרומוזומי X, Y, 13, 18 ו - 21.

זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, איך לעבד ולתקן דגימת זרע אנושי, איך decondense ו לפגל הכרומטין זרע, כיצד להמשיך לקבל ההכנות FISH הזרע, וכיצד לחזות את התוצאות במיקרוסקופ. הערות מיוחדות הצעדים המשמעותיים ביותר ניתנים על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר.

Protocol

I. עיבוד המדגם קיבוע התא

1. השאירו את מדגם הזרע במכלים סטריליים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד עיבוי.
2. מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות ספין אותו 1000g במשך 5 דקות.
3. הוצא בעדינות וזורקים supernatant באמצעות פיפטה פסטר.
4. הוסף פתרון hypotonic (KCl, 0.075M) מחומם מראש על 37 ° C, טיפה אחר טיפה, תוך כדי ערבוב על מערבולת לקבל נפח סופי של 10 מ"ל.
5. מניחים את הצינור באמבטיה המים 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
6. צנטריפוגה ב 1000g במשך 5 דקות. בזהירות להתעלמות supernatant ידי יציקה, מבלי להפריע גלולה.
7. לאחר resuspending גלולה, להוסיף המוכן טרי (מתנול 03:01: חומצה אצטית) מקבע של Carnoy טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב על מערבולת לקבל נפח הסופי של 8 מ"ל.
8. חזור נקודות 6 ו -7 פעמים רבות ככל הדרוש כדי להשיג גלולה לבנה.
9. הוסף מתנול מוכן טרי: חומצה אצטית (03:01) טיפה אחר טיפה כדי לכוונן את עוצמת הריכוז הסופי הסלולר הנדרש לקבלת תא טובה מתפשטת (באותם מקרים עם כדורית קטנה, כמה טיפות יספיקו ואילו דגימות עם כמות גבוהה הזרע התאוששה, הנפח הסופי יכול להגיע 1-2 מ"ל). שקופית הבדיקה יכולה להתבצע על ידי הטלת המדגם resuspended לשקופית משומנת ובוחן אותו תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. זה יאפשר לבדוק את פיזור הסלולר שהושג יאפשר תיקון זה, אם יש צורך, על שקופיות נוספות.
10. כדי להפוך את הרחבות, ירידה מגובה מינימלי של 40 ס"מ שתיים או שלוש טיפות של השעיה תא למרכז שקופיות unfrosted (מאוחסן בעבר ב -20 מעלות צלזיוס מתנול כדי degrease אותם). כדי לאפשר את מיקומו של המדגם לאורך הפרוטוקול, לסמן את האזור המכיל את הזרע הרחבה בצד השני של השקופית באמצעות עיפרון היהלומים.
11. אחסן את השקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.
    הערה: תוספת של מתנול: חומצה אצטית (03:01) טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב היא צעד חשוב מאוד כדי למנוע היווצרות של אגרגטים הזרע.

השנייה. Decondensation

1. השקופיות המאוחסן -20 ° C חייב להיות מופשר להמשיך עם פרוטוקול (להשאיר אותם בטמפרטורת החדר).
2. מניחים את השקופית בשתי צנצנות coplin רצופים עם תמיסת מלח נתרן 2x ציטרט (2xSSC) למשך 3 דקות כל אחד.
3. העברת השקופית באמצעות סדרה של אתנול שוטף למשך 2 דקות בתוך צנצנת כל coplin. התחל עם 70% אתנול, פעל על ידי 90% ולסיים עם 100%. לייבש את השקופית להשאיר אותו בטמפרטורת החדר.
4. דגירה השקופית בתמיסה dithiothreitol (1,4-dithiothreitol 5mm, טריטון 1% X-100, 2-אמינו-2 (hydroxymethyl) -1,3-propanediol 50mm) בשעה 37 ° C בחממה כדי decondense הכרומטין. מוצר זה פועל על ידי שבירת גשרים דיסולפיד של protamines כי סליל ה-DNA בגרעין תא הזרע. זהו צעד חשוב מאוד כי ה-DNA בגרעין הזרע נדחס מאוד. זמן הדגירה של שקופיות פתרון dithiothreitol (DTT) חייב להיות מותאם על פי התגובה של מדגם למוצר זה. בדרך כלל, הפעם הוא סביב 8 דקות, למרות שזה יכול להשתנות 2-15 דקות.
5. מיד להעביר את השקופית שתי צנצנות ברציפות coplin עם 2xSSC במשך 3 דקות coplin כל אחד.
6. המשך על ידי הצבת את השקופית באמצעות סדרה של אתנול שוטף למשך 2 דקות בתוך צנצנת כל coplin (70%, 90% ו 100% אתנול). תנו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
   הערה: חשיפת יתר DTT תביא לפיזור אותות FISH בסוף ההליך, ואילו חשיפה קצר מדי יגרום לחוסר אותות מסוימים.

ג. הכלאה

1. לפגל את ה-DNA של הזרע דוגרים השקופית בצנצנת coplin עם פתרון לפוראמיד (70% Formamide/2xSSC) בשעה 73 ° C במשך 5 דקות.
2. העברת השקופית באמצעות פתרונות אתנול דקה 1 לכל coplin קנקן (להתחיל עם אתנול 70%, 85% ולסיים עם 100%). השאירו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
3. הוסף ישיר l של 5 המקביל מוכן לשימוש תערובת בדיקה לחמוק כיסוי 15x15 (Assay AneuVysion Multi-Probe צבע פאנל: CEP 18/X/Y או LSI 13/21).
4. כפי שזה מוצג הוידאו, בזהירות במקום להחליק על פתק את המכסה כדי להרכיב את אזור היעד את התערובת בדיקה. חותם זה במלט גומי.
5. מניחים את השקופית לתוך טרום חימם 37 ° C קאמרית הכלאה (HYBrite ™) ו דגירה אותו 37 מעלות צלזיוס למשך 6-24 שעות.
   הערה: בעוד denaturation המדגם הזרע היא חובה, את הצורך denaturing בדיקות נקבע על ידי היצרן. תערובות בדיקה השתמשו בפרוטוקול הזה מוכנים לשימוש, במקרה זה, denaturation בדיקה אינה נדרשת.
   נפח התערובת בדיקה ישתנה בהתאם לגודל האזור הכלאה.

IV. רוחצתלאחר הכלאה

1. קח את השקופית מהאולם הכלאה.
2. הסר את המלט גומי בזהירות לשלוף את הפתק מכסה מחליק בעדינות הצידה.
3. כדי למנוע את האותות הכלאה נוקבים במקום להחליק במשך 2 דקות בתוך צנצנת עם coplin% 0.4xSSC/0.3 NP-40 מראש התחמם ב 73 מעלות צלזיוס באמבט מים.
4. העברת שקופיות פתרון NP-40 לשטוף 2xSSC/0.1% בטמפרטורת החדר למשך דקה 1. תנו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
5. הוסף מוצר counterstaining לאזור היעד (8 l עבור להחליק לכסות 18x18). המוצר הנפוץ ביותר הוא 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc).
6. כפי שזה מוצג הוידאו, לכסות את אזור הכלאה עם תלוש כיסוי (כדי לשמר את ההכלאה להחליק לכסות יכול להיות חתום עם לכה מסמר).
7. חנות שקופיות הכלאה ב -20 ° C בחושך עד ניתוח הסיכוי שלהם. בתנאים אלה השקופיות ניתן לאחסן עד 12 חודשים ללא משמעותי לאיבוד עוצמת האות פלואורסצנטי.
   הערה: הטמפרטורה גבוהה או זמן לשטוף מופרז עלול לגרום לחיסול של אותות מסוימים, ואילו השני לא היה לשטוף את הכלאות בדיקה נוקבים.
   היקף המוצר counterstaining הוסיף ישתנה בהתאם לגודל האזור הכלאה לכסות.

V. ויזואליזציה

ההכנות ניתן להעריך תחת מיקרוסקופ epifluorescence מצויד במסנן הלהקה משולשת עבור DAPI / טקסס אדום / FITC ו יחיד הלהקה מסננים עבור אקווה, FITC וטקסס האדום. קריטריונים להערכה סטנדרטית חייב להיות במעקב במשך הערכה נכונה של גרעיני זרע ^1.

הכנת הכלאה עם בדיקות של כרומוזומי X, Y ו 18 צריכים להציג אותות עבור שלושת הכרומוזומים. כל זרע נורמלית חייב להראות איתות כחול (המקביל ל כרומוזום 18), ואת אות ירוק (X נושאות זרע) או איתות אדום (Y נושאות זרע).

בהכנת הכלאה עם בדיקות של כרומוזומים 13 ו - 21, אות ירוק כרומוזום 13 ו סימן אדום על כרומוזום 21 יש להבחין בכל זרע נורמלית.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך דגימות זרע אנושי להשגת FISH ההכנות הזרע. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לנתח פגמים בכרומוזומים של גמטות זכריות. ההקרנה זרע aneuploidy יש יישומים גם בהקשר של מחקר בסיסי בייעוץ הרבייה שניתנה זכרים עקרים. למרות האבחנה הקלינית הכרומוזומים ביותר למד נרחב ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Material	Roche Group	10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Material	Roche Group	10708976001
Acetic acid	Material	Merck & Co., Inc.	100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit 20xSaline-Sodium Citrate 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II) CEP 18/X/Y DNA probe NP-40 LSI 13/21 DNA probe	Material	Vysis Inc.	32-161075 30-805850 30-804941 30-171077 30-804820 30-171078
Centrifuge 5804R	Tool	Eppendorf
Centrifuge tube	Material	Nalge Nunc international	347856
Coplin jar (glass)	Material	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)	Material	Deltalab	191087
Cover slips (15x15)	Material	Knittel Glaser	4600115
Cover slips (18x18)	Material	Knittel Glaser	4600118
Diamond pencil	Material	Hammacher	335117010
Ethanol	Material	Merck & Co., Inc.	100.983
Formamide	Material	Roche Group	11814320001
Freezer	Tool	Zanussi
Gloves	Material	Sanyo	101/3300
HYBrite™	Tool	Vysis Inc.
Immersion Oil	Material	Olympus Corporation	35505
Incubator	Tool	Heraeus Instruments
Methanol	Material	Merck & Co., Inc.	106.009
Micropipette	Material	Labsystems	Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip	Material	Daslab	16-2001
Nail varnish	Material	Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope	Tool	Olympus Corporation		Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.
Pasteur Pipette	Material	Rubilabor	211.0230
Phase contrast microscope	Tool	Nikon Instruments
Plastic pipette (3ml)	Material	Deltalab	200007
Potassium chloride (KCl)	Material	Fluka	60128
Rubber cement	Material	Best-test
Slides	Material	Knittel Glaser	4520022
Slide Saver Boxes	Material	Deltalab	19276.1
Sterile container	Material	Deltalab	409726
Syringe	Material	PentaFerte	002022300
Thermometer	Material	Comark Instruments, Inc	KM12
Tri-distilled water	Material
Triton X-100	Material	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tweezers	Material	B. Braun Medical	Aesculap (BD224R)
Vertical laminar flow hood	Tool	Burdinola	OR-ST 1500
Vortex mixer	Tool	Fisher Scientific	FB15012
Water bath	Tool	Raypa®