الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

Summary

نحن تصف العملية باستخدام الليزر التقاط microdissection لعزل واستخلاص الحمض النووي الريبي من السكان خلية واحدة متجانسة ، العصبونات الهرمية ، في الثالث من طبقة التلفيف الصدغي العلوي في العقول بعد الوفاة الإنسان. نحن في وقت لاحق تضخيم خطي (T7 على أساس) مرنا ، ويهجن العينة إلى ميكروأري Affymetrix X3P الإنسان.

Abstract

اقترحنا للتحقيق في الحد من المادة الرمادية في التلفيف الصدغي العلوي ينظر في مرضى الفصام ، من خلال استجواب ملامح التعبير الجيني للخلايا العصبية الهرمية في الطبقة الثالثة. ومن المعروف أن قشرة الدماغ هي بنية متجانسة بشكل استثنائي يضم مختلف المناطق والطبقات وأنواع الخلايا ، كل منها يتميز متميزة التراكيب الخلوية والجزيئية وبالتالي الفرق ملامح التعبير الجيني. للتحايل على آثار الخلط من التجانس الأنسجة ، واستخدمنا الليزر التقاط microdissection (LCM) من أجل عزل لدينا خلية معينة من نوع الخلايا العصبية أي الهرمي.

تم القبض على ما يقرب من 500 العصبونات الهرمية ملطخة Histogene حل التلوين باستخدام نظام أركتوروس LCM XT. ثم تم عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا والقبض على خضع جولتين من T7 المستندة إلى تضخيم الخطية باستخدام النعش / الجزيئية أجهزة مجموعات. أشار LabChip Experion (بيو راد) هلام ومخطط رحلاني نوعية جيدة الحمض النووي الريبي (م) ، ويبلغ طوله نص تمديد 600nt الماضية اللازمة لميكروأرس. وبلغ متوسط ​​كمية مرنا الحصول 51μg ، مع نقاء مقبول متوسط ​​العينة على النحو المبين في النسبة A260/280 ، من 2.5. وعرضت لمحة الجينات البشرية باستخدام مسبار GeneChip X3P مجموعة من Affymetrix.

Protocol

1) الأنسجة sectioning :

حصلنا على الأنسجة الضرورية (السيطرة ن = 9 ، والفصام ن = 9) من مركز هارفارد الموارد الدماغ الأنسجة ، مطابقة لفترة العمر ، والجنس ، وبعد الوفاة (PMI) (الجدول 1). وكانت كتل بخار النيتروجين السائل 3mm سميكة تقريبا اتخذت من منطقة Brodmann في 42 (التلفيف الصدغي العلوي).

قبل بداية تلون الخلايا العصبية الهرمية ، لا بد من تحسين شروط من أجل الحصول على أفضل الأنسجة "رفع" وذات جودة عالية الحمض النووي الريبي. نسيج "رفع" يصف عملية الليزر أثناء التقاط microdissection ، حيث تميز لالتقاط الخلايا العصبية التمسك الغطاء ويتم فصل بينما يتم ترك الأنسجة المتبقية وراءهم.

الأمثلية :

1. من أجل الحد من ريبونوكلياز النشاط ، الذي التنازلات RNA الجودة ، ويتعامل مع جميع السطوح ، بما في ذلك مجال العمل ، والشرائح sectioning شفرة بمحلول تطهير ريبونوكلياز ، مثل زاب ريبونوكلياز ، بالإضافة إلى مسح أسفل مع الإيثانول بنسبة 100 ٪.
2. قسم الأنسجة مع ناظم البرد وضعت في -17 درجة مئوية. هذا يقلل من الانحدار في درجة الحرارة بين درجة حرارة الغرفة (شرائح) ، ناظم البرد ، والثلج الجاف (انظر العملية برمتها أدناه). إذا كانت درجة الحرارة أقل من -20 درجة مئوية ، وأقسام الأنسجة تميل إلى تمزيقها ، مما يجعلها غير صالحة للاستعمال. أعلى ، وزيادة التدرج في درجة الحرارة ، والتي يمكن أن تمس سلامة الحمض النووي الريبي.
3. وينبغي أن تكون المقاطع 8μm سميكة ، وأكثر سمكا المقاطع وسطا في النهاية نسيج "رفع". كما يتيح هذا سمك التحديد الصحيح للخلايا العصبية الهرمية للاعتقال.
4. استخدام الزجاج العادي الشرائح بدون تهمة (على سبيل المثال Histogene LCM الشرائح) وهذه لا تتعارض مع "رفع" الأنسجة أثناء عملية القبض على الليزر. ويمكن أيضا أن تستخدم الشرائح الغشاء ، ولكن هذه هي أكثر ملاءمة لعزل هياكل أنسجة كبيرة ، كما يميل إلى رفع الغشاء طفيفة خلال عملية القبض على الليزر ، وبالتالي زيادة الأشعة تحت الحمراء بقعة الليزر (IR) وخفض حجم خصوصية الخلية.
5. جبل قسمين لكل شريحة من الزجاج ، وأكثر من قسمين في الشريحة يمكن أن تضر الحمض النووي الريبي جودة بسبب الاختلاف المستمر في درجة الحرارة خلال عملية sectioning.
6. بعد sectioning ، ضع الشرائح على الفور في خانة الشريحة الصغيرة على الجليد الجاف من أجل الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بعد ذلك يتم تخزين علب الشريحة التي تحتوي على أقسام الدماغ عند -80 درجة مئوية حتى معالجتها.

لقد عقدنا العزم على الخلايا العصبية في وقت سابق ان الهرمية ، 500 خلية لكل حالة كافية من أجل الحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لتهجين ميكروأري. وهناك حاجة إلى ما يقرب من أربعة أقسام لكل حالة ، ويرجع ذلك أساسا إلى sectioning وتلطيخ التحف.

2) تلون الخلايا العصبية الهرمية :

ويتحقق تحديد الخلايا العصبية الهرمية مع تلوين Histogene حل سريع وعدة ، لأنها تتيح لنا تصور هذه الخلايا العصبية ، من دون التعرض لفترات طويلة إلى المحاليل المائية ، وبالتالي الحفاظ على الحمض النووي الريبي.

1. التحضير لإجراء تلطيخ بإضافة 1μl ريبونوكلياز المانع في 100μl حل تلطيخ (مثل Promega) من أجل الحد من نشاط ريبونوكلياز. أربعة أقسام (2 شرائح) ، تتطلب من 4μl المانع ريبونوكلياز إضافة إلى 400μl من Histogene حل تلطيخ في أنبوب microcentrifuge 1.5ml (حافظ على الجليد). لكل مقطع ، ونحن نستخدم 97μl هذا الحل ، الذي يعطي لنا وصمة عار كافية لتحديد الخلايا العصبية الهرمية.
2. إعداد سلسلة الجفاف والزيلين : 25ml قسامة من ethanols المناسبة في الجرار تلطيخ قدمت مع عدة Histogene ، أي 2x75 ٪ ، 95 ٪ ، 100 ٪ و 2 من الجرار ريبونوكلياز خالية من المياه. إخضاع جميع الجرار في دلو الثلج ، باستثناء واحد جرة 75 ٪ ، والتي كنت مكان في الثلاجة -20 درجة مئوية. تحت غطاء الدخان ، إضافة المناخل الجزيئية في جرة الزيلين لإزالة المياه الزائدة ، والتي يمكن أن تضر الأنسجة "رفع".
3. التبديل على بالحمام المائي (أو كتلة الحرارة) مع درجة الحرارة إلى 42 مجموعة درجة مئوية ، ووضع أنبوب فالكون 50ml يدعمه في رف بالحمام المائي.
4. إزالة شريحتين من -80 درجة مئوية ، وتذويب لهم على KimWipe لنحو 30 ثانية ، أو حتى مجرد زوايا الشرائح بدء الصقيع.
5. الإصلاح لفترة وجيزة الشرائح في الايثانول 75 ٪ لمدة 30 ثانية في الثلاجة -20 درجة مئوية. نقل الشرائح بين الجرار التلوين باستخدام الملقط ريبونوكلياز - تمريرها للحد من التلوث.
6. بعد 30 ثانية في غسل nuclease خالية من المياه ، قد تكون المقاطع المذكورة مع PAP القلم الحاجز من اجل التركيز على حل هذا الباب ، ولكن مع شرائح الزجاج العادي هذا ليس ضروريا على الاطلاق.
7. وصمة عار على الأبواب الأربعة مع Histogene حل تلطيخ لمدة 20 ثانية ، مع 97μl المانع من وصمة عار / ريبونوكلياز في المقطع. لاحقا ، يذوى المقاطع في ethanols أعدت مسبقا على الجليد ، لمدة 30 ثانية لكل خطوة. ينبغي تمديد الخطوة النهائية الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 3 دقائق، من أجل تحقيق الجفاف كافية لمناسبة "رفع" الأنسجة والقبض على القمم LCM.
8. تزج الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق والهواء الجاف في غطاء الدخان ، لمدة 5 دقائق قبل القبض عليه.

يجب فقط أن يتم تنفيذ الخطوات تلطيخ إذا الليزر اسر بعد ذلك على الفور. وينبغي تغيير كل الحلول لكل شرائح 4-6 وذلك لمنع التلوث والجفاف لضمان المناسبة.

3) خلية واحدة ليزر التقاط microdissection :

بعد التلوين ، تتم إزالة الخلايا العصبية الهرمية الثالث من طبقة باستخدام الليزر التقاط microdissection ، مع نظام XT النعش والبرمجيات. لفترة وجيزة ، ويعمل النظام عن طريق النبض قابل للتعديل ليزر الأشعة تحت الحمراء قوة من خلال فيلم لدن يقع في قاعدة قبعة ، مما أدى إلى تمديد / انتفاخ من الفيلم مباشرة على خلايا الفائدة. عندما يتم رفع الغطاء من الأنسجة ، والخلايا تبقى اسر / أسير على الغطاء. ويرد موجز التصويرية في الشكل 1.

قبل البدء في هذا الإجراء ، فمن المهم أن نميز بين نوعين من القبعات المتاحة مع هذا النظام. في حين تستخدم عادة غطاء CapSure ماكرو لالتقاط أكبر هياكل الأنسجة ، مصممة القبعات HS CapSure للقبض على أعداد صغيرة من الخلايا الفردية ، وبالتالي هذه القبعات على مساحة صغيرة لالتقاط سطح معين. القمم HS كما القضبان التي تحول دون غطاء من كونها على اتصال مباشر مع قسم الأنسجة ، في حين أن الحد الأقصى للماكرو لا. هذه القضبان تقليل تأثير طي الأنسجة التي قد تؤثر أو حث تباين حجم البقعة (من نبضة ليزر) وغطاء ماكرو يجلس مباشرة على الأنسجة ، مطوية متفاوتة. لإجراءاتنا ، استخدمنا القبعات HS للاستفادة من قدرتها على الحد من تأثير طي الأنسجة ، لكنها أبقت على سقف ماكرو إعدادات البرنامج من أجل تحقيق أقصى قدر من المنطقة التي احتلتها ونحن التقاط عدد كبير من الخلايا.

1. تحميل الشرائح والقبعات على جهاز XT النعش. استخدام HS CapSure القبعات ، ولكن الحفاظ على وضع برنامج على ماكرو. انقر على "تحميل مع نظرة عامة على" المربع للحصول على صورة عامة عن كل شريحة.
2. ضبط السطوع / التركيز على التكبير 2X ، من أجل تحديد القسم الذي سيكون الأمثل لالتقاط ليزر. أقسام الأنسجة مع تجنب الإفراط في للطي ، ولكن بدلا اختيار المقاطع التي يتم سليمة وسلسة ، وملون بشكل جيد ، وخاصة بالقرب من منطقة الطبقة الثالثة أي اهتمام.
3. ثم نضع سقفا فوق منطقة عامة حيث سنكون اسر ، والتأكد من أن تدرج طبقة الثالث. لا تزال في التكبير 2X ، تأكد من أن سقف القضبان لا تستند إلى أي الطيات ، حيث سيؤدي ذلك إلى إمالة الغطاء.
4. المقبل ، فإننا نؤكد على موقع بقعة الليزر IR يدويا في التكبير 40X. إذا كانت البقعة (شعاع أحمر) لا تتطابق مع الصليب الأزرق ، ويمكن تعديل هذا عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الفور واختيار "بقعة تقع تحت الحمراء".
5. في 40X ، يمكننا أن نبدأ في التعرف على الخلايا العصبية الهرمية وفقا للمعايير التالية (1) الخلايا التي هي في شكل هرمي و (2) في الجزء القريب من التشعبات قمية و / أو القاعدية يمكن تمييزها (الشكل 1A).

نحن الآن ضبط السلطة ومدتها نبضة ليزر من أجل القبض على الخلية العصبية الهرمية. هذا مهم بشكل خاص ، كما أنه يحدد خصوصية الخلية بالاضافة الى القبض على عدد من الخلايا الملتقطة. وإذا كان النبض ضعيفا للغاية لم يتم القبض على جميع الخلايا العصبية التي تم تحديدها ، بينما لو نبض قوي جدا يمكنها التقاط خلايا الأنسجة المحيطة / بخلاف الخلايا العصبية وحدها. عموما ، مع مواصفات الأنسجة والخلايا المستخدمة هنا ، وقوة الليزر (70mW) ومدته (16msec) النتيجة في حجم البقعة من 25μm ، تمشيا مع ما يقرب من حجم الخلايا العصبية الهرمية (الشكل 1B). ومع ذلك ، فإن هذه الإعدادات هي ضبطها على كل قسم من أجل الحصول على ما يقرب من حجم البقعة نفسها لكل حالة. إذا كان خطر "رفع" ، يمكن للمرء دائما زيادة عدد الخلايا والقبض من اجل الحفاظ على كمية من الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من كل حالة من الحالات المماثلة. ومع ذلك ، تأكد للحفاظ على وقتك بما في ذلك القبض على تلطيخ تحت 1.5 ساعة ، وأطول من هذه التسوية يمكن أن الحمض النووي الريبي الجودة.

1. أولا حفظ موقف الغطاء عن طريق النقر على علامة زائد في وظيفة الموقف. بهذه الطريقة ، إذا كان لأي سبب من الأسباب يجب علينا أن إزالة الغطاء ومن ثم الحاجة لوضعها من جديد على نفس الموقع ، فإن الحد الأقصى دائما العودة إلى بقعة على وجه التحديد نفسه الذي ضبط حجم البقعة لل.
2. إدخال هذه القيم في مربع عنصر التحكم : 70 و 16 الى السلطة في المدة. Unclick "التحرك السيارات المرحلة" الخيار ، وتأكد من أنه رمز الحق يرتبط حجم الرمز على اللوحة إلى اليمين.
3. حدد الخيار دائرة (يمين أسفل) لتحديد الخلايا العصبية التي ترغب في التقاط اختبار ، ومن ثم تفعيل ليزر عن طريق النقرفي "بقعة IR اختبار".
4. ينبغي للبقعة التي أدلى بها الليزر أولا حلقة هش الداكنة حول الكائن التقاطها. إذا كانت هذه العصابة هي خفيفة جدا ، لم يكن القبض على الخلية. إذا كان هناك بقعة مظلمة في منتصف الحلبة الظلام ، ثم قوة الليزر / مدة كبيرة جدا ، وربما يكون له تأثير سلبي على الحاضر RNA في الخلية التقاطها. تأكد من أن عصابة كبيرة بما يكفي ليشمل الخلية ، ولكن صغيرة بما يكفي أنه لا يشمل غير المرغوب فيها أو أنسجة الخلايا الأخرى.
5. كرر العملية على أجزاء مختلفة من الأنسجة داخل الطبقة التي ترغب في التقاط الصور ، للتأكد من أن حجم البقعة لا تختلف تبعا للموقع. تعديل وفقا لذلك.
6. مرة واحدة وقد تم تعديل بقعة الليزر ، ومواصلة تحديد الخلايا العصبية الهرمية للاعتقال. نحدد ما يقرب من 500 خلية لكل عينة ، والذي ينتج حوالي 500pg من الحمض النووي الريبي في مجموع العينة. علينا أيضا أن عادة استخدام مقطع واحد فقط من أجل الحد من مقدار الوقت الالتقاط ، كما يجب أن يكون الحد الأقصى لإعادة تعديل كل قسم. ذات مرة كنت قد حددت جميع الخلايا التي تحتاج إليها ، اضغط على زر الليزر ، وسيتم القبض على كل ما تبذلونه من الخلايا والقبض على الغطاء تلقائيا (الشكل 1C).
7. مرة واحدة وقد تم القبض على كافة الخلايا ، حرك الغطاء لجزء آخر من الشريحة التي لا تحتوي على الباب. نعود إلى حيث تم القبض على الخلايا وتأكد من أنه تم إزالة ما لا يقل عن 90 ٪ من الخلايا العصبية. إذا لم يكن كذلك ، لا في محاولة لاستعادة السيطرة على الخلايا نفسها ، ولكن تحديد موقع المنطقة حيث تم القبض على معظم الخلايا ، والاستيلاء على المزيد من الخلايا في نفس المنطقة. حرك الغطاء لمحطة مراقبة الجودة.
8. وضع قبعة في أنبوب microcentrifuge 0.5ml من النظم البيولوجية التطبيقية (الفئة N8010611 #) التي تحتوي على 50ml العازلة من استخراج (PicoPure عزل الحمض النووي الريبي الطقم). وقد تم تصميم غطاء لتناسب تماما في هذا الانبوب محددة لمنع تسرب العازلة.
9. بدوره الجمعية رأسا على عقب ، والتأكد من استخراج عازلة تغطي سقف بأكملها ، ووضعه في الجزء السفلي من الأنبوب فالكون 50ml موجودة بالفعل في المجموعة بالحمام المائي حوالي 42 درجة مئوية. يتم تحضين الخلايا العصبية لمدة 30 دقائق لإزالة الأنسجة من الغطاء.
10. بعد ذلك ، أجهزة الطرد المركزي وتجميع الأنبوب غطاء لمدة 2 دقيقة على 800 غرام. إزالة الغطاء وتخزين استخراج الخلايا المتبقية في استخراج الحمض النووي الريبي حتى -80 درجة مئوية. كإجراء وقائي إضافي ، يمكن إعادة النظر في سقف في محطة مراقبة الجودة على أجهزة الليزر اسر لضمان أن يتم نقل جميع الخلايا العصبية من الغطاء نفسه.

4) الحصول على الحمض النووي الريبي من السكان العصبية محددة :

يمكن للمرء ان يذهب مباشرة من التقاط إلى العزلة ، أو ذوبان الجليد العينة المخزنة في الثلاجة -80 درجة مئوية. في تجربتنا ، جمعنا أولا جميع العينات المطلوبة وتخزينها في -80 درجة مئوية قبل الشروع في الحمض النووي الريبي العزلة.

يتم تنفيذ عزل الحمض النووي الريبي باستخدام أدوات عزل PicoPure ، الذي يهدف إلى عزل أعداد صغيرة من الخلايا من عينات LCM والاحتفاظ منخفضة وفرة مرنا. عموما ، ونحن نتابع البروتوكول الذي تم تضمينه مع الطقم. أدناه ، فإننا نقدم وصفا الأساسية لهذه العملية.

1. بعد ذوبان الجليد ، إضافة الإيثانول 70 ٪ (المقدمة مع عدة) ، وأجهزة الطرد المركزي على عمود تنقية قبل مكيفة من أجل ربط الحمض النووي الريبي لتصفية العمود.
2. بعد الغسيل ومعالجة RNA مع الدناز من أجل ضمان إزالة كاملة من الحمض النووي للقضاء على خطر التدخل الحمض النووي. هذه الخطوة أهمية خاصة في تطبيقات مثل المصب في الوقت الحقيقي qRT - PCR.
3. بعد هضم الحمض النووي ، وهناك خطوة أخرى يغسل. تأكد من أن لا تبقى في المخزن غسل العمود قبل ان ينتقل الى آخر أنبوب microcentrifuge ، لأن أي وجود المخزن في العينة النهائية سوف يؤدي في أقل بدءا الحمض النووي الريبي لتضخيم. لضمان ذلك ، ونحن الطرد المركزي الخطوة النهائية لغسل 2.5 دقائق بدلا من دقيقة 2 على النحو المقترح في البروتوكول المقدمة.
4. أخيرا ، يضاف العازلة شطف وحضنت على تصفية في عمود لمدة 1 دقيقة تليها الطرد المركزي ، من أجل أزل الحمض النووي الريبي الإجمالي.
5. ماصة 1.3ul كل من العينات في أنابيب 0.5ml منفصلة لتشغيل HighSens Experion LabChip. تجميد بقية العينة عند -80 درجة مئوية.

مراقبة الجودة من المهم جدا عندما عزل الحمض النووي الريبي ، وخصوصا عندما كمية صغيرة والمبلغ المطلوب ، مثل لتجارب [ميكروأري (15μg) ، كبيرة. استخراج الحمض النووي الريبي لذلك يجب أن تخضع لمراقبة الجودة في مراحل زمنية مختلفة طوال العملية. الأول تحدث بعد الاستخراج. نقيم على سلامة الحمض النووي الريبي مجموع طريق الفحص الإجمالي للقمم 18S/28S من electropherograms وهلام الظاهرية التي تم إنشاؤها بواسطة Experion HighSens LabChip. هذا الأسلوب هو سريعة ويتيح سيلتين للقياسات للتحقق من جودة AN - RNA مخطط رحلاني وهلام الظاهرية (الشكل 2). إذا كانت نوعية من الحمض النووي الريبي مجموع جيد نسبيا (الشكل. 2A ، B مقابل C ، D) ، ونحن ننطلق بعد ذلك مع تضخيم خطيا ومرنا ، والتي تمثل حوالي 2 ٪ من مجموع الحمض النووي الريبي.

5) التضخيم الخطي :

التضخيم من الحمض النووي الريبي المستخرج من الليزر التقاط الأنسجة هو ضروري من أجل إنتاج كمية كافية من الحمض النووي الريبي لتهجين والتجارب اللاحقة ميكروأري qRT - PCR. نحن في التقليل من أجل تقليل احتمال يفند المحتملة لاحظت مع T7 القائم على تضخيم الخطية ، وعدد جولات من التضخيم اللازمة من خلال تعظيم قيمة بدءا الليزر التي تم الاستيلاء عليها مواد النسيج.

بياناتنا الأولية (لا يظهر) تشير إلى أن مجموعتين من التضخيم الخطي (HS RiboAmp ^PLUS الطقم) من الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من الأنسجة التي تحتوي على ما يقرب من 500 الخلايا ستنتج 50μg آرنا تقريبا -- ما يكفي لأداء كل من وميكروأري qRT - PCR التجارب. إذا كان ذلك ممكنا ، تجنب نقل لا لزوم لها من بين العينة 0.2ml 0.5ml والأنابيب باستخدام كتلة 0.5ml في cycler الحرارية وأنابيب 0.5ml المنصوص عليها في الطقم.

مرة أخرى ، والبروتوكول المتبع هو واحد مع توفير عدة. يوصف صيغة مختصرة هنا.

1. إضافة 1μl من التمهيدي المقدمة إلى عينة الحمض النووي الريبي مجموع (حوالي 11μl) ، واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها تقشعر لها الأبدان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
2. إضافة مكونات الشكل الأول [كدنا] مع المنتسخة مرتفع عكس الثالث واحتضان حوالي 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
3. بعد تركيب الشق الثاني [كدنا] ، [كدنا] تنقية الناتجة من خلال عمود تنقية المقدمة. نحن هنا ننصح عند نقل العينة زائد العازلة ملزمة لتنقية العمود ، لأجهزة الطرد المركزي لأنابيب العينات مرتين -- مرة واحدة بعد نقل العينة إلى العمود ، وتصل إلى 1μl من العينة لا يزال على الجانبين من أنابيب نقل بعد.
4. يغسل [كدنا] مع مخازن غسل المقدمة وأزل [كدنا] المنقى مع شطف العازلة.
5. إضافة مكونات النسخ في المختبر ، واحتضان لمدة 6 ساعات إلى 42 درجة مئوية.
6. بعد خطوة الدناز ، تنقية آرنا الناتج مع المخازن المؤقتة المقدمة ، ويبلغ حجمه في نهاية المطاف في ما مجموعه 12μl العازلة للشطف.

الحمض النووي الريبي يخضع لجولة أخرى من التضخيم الخطي (مع الاشعال منفصلة -- انظر مجموعة بروتوكول) ، وبعدها يتم توظيف المزيد من الخطوات لمراقبة الجودة. غير المخفف احد المجاهدين من العينة إلى 250ng/ul تقريبا لتحديد طول النص مرنا والتركيز مع LabChip StdSens (Experion). Affymetrix ميكروأري التكنولوجيا التقليدية يتطلب أن يكون مرنا لا يقل عن 600 النيوكليوتيدات في الطول حتى يكون الكشف عنها. وينبغي أن جل مخطط رحلاني الحصول عليها من LabChip تصور بالتالي فإن هذا النص مرنا طول الحد الأدنى (الشكل 3).

يتم تحديد إضافية لمراقبة الجودة من خلال تحليل الطيف NanoDrop ، حيث نسبة تتكون من اثنين من كثافة ضوئية ، أي A260 A280 و، ويحدد RNA النقاء. وينبغي أن يكون المسمى مع عينات الكثافة البصرية حول 2.1 لتحليل التعبير الجيني ، وإن كانت قد أظهرت نسب تصل إلى 2.7 لمقارنة نوعية التهجين. وينبغي أن يكون هناك تركيز أيضا بين 800ng/μl-1μg/μl ، وأقل من ذلك قد أدى الى تدهور الحمض النووي الريبي في حين التخزين (حتى في درجة حرارة تقل عن -80 درجة مئوية) ، وأدى أيضا إلى نتائج ميكروأري الفقراء.

6) عينات مرنا البيوتين وضع العلامات للتحليل [ميكروأري Affymetrix :

يتم استخدام العلامات البيوتين TURBO طقم (النهاية وضع العلامات) من الأجهزة الجزيئية لتسمية آرنا الحصول على عينات من تضخم. وتعطى نسخة مختصرة من بروتوكول هنا.

1. ضبط مستوى الصوت من 20 ميكروغرام في كل عينة آرنا إلى إجمالي 13μl بإضافة nuclease خالية من الماء أو من خلال تركيز العينة في جهاز الطرد المركزي فراغ ، اعتمادا على تركيز الأولي. حتى ولو 15μg فقط ضروري لرقاقة Affymetrix المستخدمة ، نضيف 20μg إلى رد الفعل الأولي ، كما هو فقدان بعض الحمض النووي الريبي خلال الحضانة والطرد المركزي.
2. احتضان تفاعل البيوتين على 85 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ومن ثم فتور في 4 درجات مئوية.
3. إزالة التسمية البيوتين الزائدة عن طريق الطرد المركزي مع العمود المتخصصة المتوفرة مع الطقم. في بعض الحالات ، لا سيما مع تدهور مرنا مثل تلك التي تم الحصول عليها من FFPE (الفورمالين الثابتة ، جزءا لا يتجزأ من البارافين) العينات ، قد يكون من الحالة التي هي ليست كل eluted مرنا في خطوة واحدة الطرد المركزي. ثم نحن نوصي بإضافة ما بين 1 - 5μl nuclease المياه خالية إضافية إلى عمود مع خطوة اضافية الطرد المركزي لاحقة من 1 دقيقة. هذا يضمن أن يتم eluted معظم العينة وصفت.
4. الحجم النهائي هو 20μl ، مع تركيز 1μg/μl. وأضاف إذا كان خارج nuclease الماء الخالي ، والتركيز على العينات إلىحجم الصحيح مع جهاز للطرد المركزي فراغ. نوصي الحفاظ على تركيز قبل بدء تخزين أكثر من التهجين 800ng/μl ، إذ أننا وجدنا أن أقل من ذلك سيؤدي إلى تدهور أثناء و / أو تخزينها أو التهجين مما أدى إلى نتائج ميكروأري الفقراء.

ثم كان المهجنة آرنا والتعبير الجيني لمحة ، وذلك باستخدام مسبار الإنسان GeneChip X3P مجموعة من Affymetrix. كما تم تصميم هذه الرقاقة لآرنا أكثر المتدهورة ، واستخدمنا بدلا منها كاجراء احترازي ، وعوامل كثيرة لا يمكننا السيطرة يمكن أن تؤثر على نوعية الأنسجة بعد الوفاة. كما مختبرنا لم يكن لديها المرافق الملائمة لتهجين ، تم تنفيذ العملية في صميم شركاء مرفق الجينوم.

ممثل النتائج :

1 +2 +3 الأنسجة) sectioning ، وتلطيخ من العصبونات الهرمية وmicrodissection الليزر التقاط :

ينبغي للبروتوكول المبينة أعلاه يؤدي إلى شريحتين مع أربعة أقسام لكل شريحة. وينبغي أن يكون كل قسم على نحو سلس مع الحد الأدنى من تمزق وتشقق وقابلة للطي. مع التلوين الصحيح ، سيكون وصمة عار تلطخ تحديد الخلايا العصبية الهرمية بحزن حوالي 20 -- 25μm في الحجم مع شكل هرمي والتشعبات قمية مرئية. مع القبعات HS CapSure في ضبط الماكرو ، والتكيف الصحيح للقوة الليزر وقوة لكل مقطع ، يجب الحصول على حوالي 500-700 الخلايا في القسم / مما أدى إلى حالة على الأقل من الحمض النووي الريبي 500pg الإجمالي. حوالي 85 -- وسوف 100 ٪ من الخلايا العصبية التمسك الغطاء (الشكل 1).

4) الحصول على الحمض النووي الريبي من السكان العصبية محددة :

كما وصفها ، بعد العزلة الحمض النووي الريبي مجموع ، ونحن تحقق من نوعية عن طريق الحمض النووي الريبي لمخطط رحلاني وهلام الظاهري عبر Experion بيو راد. في مخطط رحلاني ، يجب أن تشاهد بين قمتين متميزة المقابلة ل18S 28S الريباسي وحدات الحمض النووي الريبي. مع الأنسجة بعد الوفاة ، ولكن ، ليس هذا هو الحال دائما ، كما قد تكون الأنسجة المتدهورة بسبب عوامل قبل sectioning. وسوف تشاهد عادة ما تشير إلى تدهور عثرة كبيرة ، وبلغت ذروتها كبيرة حول 18S ، وأصغر 28S الذروة (الشكل 2A ، B). طالما أن ملامح مخطط رحلاني قابلة للمقارنة عبر العينات ، ولقد تم العثور على هذا المبدأ أن يؤدي إلى نوعية جيدة مرنا بما فيه الكفاية لتنفيذ كل الدراسات RT - PCR وميكروأري (Imbeaud وآخرون ، 2005).

إذا كان هناك تدهور كثيرا -- كما هو مبين من خلال مساحة واسعة تحت منحنى مخطط رحلاني ، أو إذا قمم غير مرئية (الشكل 2C ، D) -- يجب أن يتم القبض على الخلايا مرة أخرى من الأنسجة. ونوصي أيضا القيام اختبار كشط الأنسجة ، حيث يتم استخراج الحمض النووي الريبي من شظايا كلها في باب (وليس فقط الخلايا) ، قبل استعادة الخلايا لتحديد ما إذا كانت كتلة الأنسجة نفسها المتدهورة.

5) التضخيم الخطي :

لاختبار جودة مرنا بعد جولتين من التضخيم الخطية ، التي نستخدمها كل من LabChip بيو راد StdSens Experion ومعمل NanoDrop. Affymetrix ميكروأري التكنولوجيا التقليدية يتطلب أن يكون مرنا لا يقل عن 600 النيوكليوتيدات في الطول حتى يكون الكشف ، والتي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول. في الواقع ، تم الكشف عن أطوال مرنا في نطاق 1000 - النوكليوتيدات. وهذا يعكس أيضا مخطط رحلاني مع قمم كبيرة تنازلي ببطء بوصفها وظيفة من الزمن (الشكل 3A ، B).

وأشارت القراءات NanoDrop بمتوسط ​​A260/A280 نسبة قدرها 2.5 في العينات ، مشيرا مرنا قابلة للحياة (الجدول 2).

نتائجنا تشير الى ان لهذا البروتوكول ، فإن كلا من كمية ونوعية الحصول على الحمض النووي الريبي غير جيدة بما فيه الكفاية لاستجواب الخلافات التعبير الجيني عن طريق GeneChip Affymetrix X3P الإنسان.

6) عينات مرنا البيوتين وضع العلامات للتحليل [ميكروأري Affymetrix :

بعد التهجين إلى GeneChip Affymetrix X3P الإنسان ، وحققنا في المئة من المكالمات في المتوسط ​​26.6 ٪ (الجدول 2) ، مشيرا إلى تهجين كافية وشدة التحقيق.

الجدول 1 : موجز الفوج

90

عينات	مجموعة	جنس	عمر	PMI
C1	CONTROL	F	79	15.00
C2	CONTROL	M	22	21.47
C4	CONTROL	M	75	20.25
C5	CONTROL	M	80	15.50
C6	CONTROL	F	58	21.08
C8	CONTROL	M	61	17.00
C10	CONTROL	F	71	20.50
C11	CONTROL	F	12.66
C12	CONTROL	F	86	6.92
MEAN		4M/5F	69.11	16.71
S1	SCHIZOPH.	F	93	6.92
S2	SCHIZOPH.	M	55	21.40
S3	SCHIZOPH.	F	67	21.80
S4	SCHIZOPH.	F	55	22.00
S5	SCHIZOPH.	M	36	17.97
S6	SCHIZOPH.	M	62	10.75
S8	SCHIZOPH.	F	92	17.80
S11	SCHIZOPH.	M	56	21.83
S12	SCHIZOPH.	F	88	13.33
MEAN		4M/5F	68.11	16.90

الاختصارات : F -- أنثى ، M -- ذكر ، PMI -- الفترة التالية للموت ، schizoph. -- الفصام.

الجدول 2 : ملخص النتائج التي تصور تركيز الحمض النووي الريبي ، والجودة والكفاءة التهجين

عينات	[مرنا] نانوغرام / UL	A260/A280	المسبار كثافة	دعوة في المئة
C1	1318،01	2.67	63	19.5
C2	2312،93	2.37	147	30.6
C4	1811،92	2.44	69	26.6
C5	1316،26	2.51	78	34.7
C6	1663،24	2.39	66	33.8
C8	633.05	2.54	101	15.2
C10	1326.4	2.47	92	32.5
C11	994.24	2.75	76	22.4
C12	817.23	2.7	56	15.2
S1	2560،88	2.47	78	25.0
S2	2169،61	2.43	76	26.5
S3	2067،32	2.52	87	22.1
S4	1563،89	2.75	82	28.1
S5	2071،44	2.44	88	28.2
S6	2532،59	2.34	72	30.7
S8	2189،22	2.5	62	31.8
S11	1669،89	2.47	41	27.3
S12	1739،35	2.47	42	28.0
MEAN	1708،75	2.51	76.44	26.57

الشكل 1 : موجز للعملية microdissection الليزر التقاط A) ويتم تحديد الخلايا العصبية هرمي شكليا. ب) بعد الليزر ونابض بالحرارة من خلال الفيلم ، فإن الخلايا الانضمام إلى غطاء ، وبالتالي فهي لم تعد على الشريحة ، تاركا وراء الأنسجة المحيطة. C) صورة مجهرية لخلية متجانسة السكان على الانضمام للرسملة CapSure الليزر بعد الالتقاط.

الشكل 2 : إجمالي مراقبة الجودة RNA A + B) يمثل مجموع RNA نوعية جيدة بعد العزلة ، بينما C + D) يوضح ما مجموعه RNA يجب أن لا تبدو بعد العزلة. أ) مع مخطط رحلاني 18/28S قمم واضحة تتناسب مع الظاهرية في هلام (B). ج) مخطط رحلاني تبين مساحة واسعة تحت المنحنى ، ولا تشير إلى قمم 18S/28S RNA التدهور. ويظهر ذلك أيضا في جل الظاهرية (D).

الشكل 3 : مرنا مراقبة الجودة A + B) مخطط رحلاني (أ) و هلام الظاهرية (B) التي تشير إلى نص مرنا وينغال (انتشار) اللازمة للدراسات ميكروأري ، وتمتد الماضي أي 600 النيوكليوتيدات (NT). C + D) مخطط رحلاني (C) والظاهرية هلام (D) تبين ما أدى إلى انتشار مرنا قد تبدو غير كافية ، كما مرنا طول النص لا يمتد 200nt الماضية.

Discussion

هنا ، ونحن نحاول تخصيص بروتوكول لاستخراج الخلايا متجانسة من السكان غير متجانسة نسيج المخ بعد الوفاة باستخدام نظام XT النعش ومجموعات ذات صلة استخراج الحمض النووي الريبي. على النحو المبين أعلاه ، أحرزنا بعض التعديلات على البروتوكولات الأصلية التي تقدمها الشركة ، من أجل تحقيق أقصى قدر من الحمض النووي الريبي النزاهة. واسر واحد من الخلايا الناجح يعتمد فقط على تحقيق الاستفادة المثلى من الخطوات السابقة لالتقاط من أجل تحقيق أقصى قدر من خلايا الحمض النووي الريبي جيدة. هذه الخطوات تشمل مختلف المعايير المرتبطة الأنسجة sectioning وتلطيخ. باختصار ، فيما يتعلق بإعداد هذه الأنسجة تشمل ما يلي : 1) خفض درجة الحرارة عند التدرج sectioning ، 2) وضع المقاطع فقط 2 لكل شريحة ، 3) القيام بجميع الخطوات الجفاف على الجليد ، 4) واضاف المانع ريبونوكلياز إلى 5 ، وصمة عار) زيادة مدة الجفاف في الإيثانول النهائي 100 ٪ لمدة 3 دقائق.

فيما يتعلق اسر ، فإننا نرى أن الجمع بين CapSure HS القبعات ، مع البرنامج على وضع ماكرو ، وينبغي ضمان تحقيق أفضل النتائج. بيئة الرطوبة التي تسيطر عليها أمر حاسم لالتقاط الخلايا واحد ، ويقلل من ارتفاع نسبة الرطوبة بشكل كبير الأنسجة "رفع". درجات الحرارة المرتفعة يمكن أيضا أن يكون لها تأثير سلبي على نوعية الحمض النووي الريبي.

خلال بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي مع عدة PicoPure ، هناك خطوات غسل اثنين. فمن المهم للتأكد من أن تتم إزالة كافة العازلة يغسل قبل ان ينتقل الى آخر لأنبوب microcentrifuge شطف الحمض النووي الريبي ، لأن أي وجود المخزن في عينتك النهائي ستؤدي في أقل RNA انطلاق لالتضخيم. لضمان ذلك ، ونحن الطرد المركزي الخطوة النهائية لغسل 2.5 دقائق بدلا من دقيقة 2 على النحو المقترح في البروتوكول المقدمة.

بالنسبة للجزء الاكبر ، وكان البروتوكول التضخيم خطي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ومع ذلك ، ينبغي أن تؤخذ نقطتين حاسمة في الاعتبار عند استخدام هذا البروتوكول : 1) في محاولة للحد من الخسائر عن طريق الحمض النووي الريبي نقل الفائض من بين عينات أنابيب ، وذلك فقط باستخدام أنابيب 0.5ml قدمت بالاشتراك مع كتلة 0.5ml في cycler الحرارية و 2) عند نقل العينة إلى العمود تنقية لتنقية [كدنا] ، ومن المؤكد ان تدور باستمرار أنابيب العينات بعد نقل الأولى. وهذا سيؤدي في 2ul - 1 إضافية من العينة إضافة إلى العمود تنقية ، وبالتالي يمكن أن تزيد من الانتعاش [كدنا].

عند الاستفادة من هذه المجموعة في نهاية الوسم TURBO البيوتين لوضع العلامات من العينات الخاصة بك آرنا محدودة ، فإننا نقترح إضافة ميكرولتر اضافية قليلة من الماء قبل خطوة الطرد المركزي ، لزيادة الغلة استخراج الحمض النووي الريبي من العمود المسمى. سيكون في الدقيقة إضافية من الطرد المركزي يساعد أيضا في هذا الصدد ، خصوصا إذا كنت تعمل مع الأنسجة المتدهورة ، مثل الأنسجة FFPE.

ونحن على ثقة من أن هذا البروتوكول سوف تمكن المستخدم لعزل هياكل صغيرة متجانسة ، مثل السكان خلية واحدة ، غير متجانسة داخل أنسجة الدماغ بعد الوفاة. هذا يقلل من آثار التخفيف من الهياكل المحيطة بها وغيرها من أنواع الخلايا ، الموجود في طبقات مختلفة داخل المخ ، مما يؤدي إلى النتائج المستهدفة نحو أنواع معينة من الخلايا قيد التحقيق. كما نوعية RNA الناتجة جيدة بما يكفي للدراسات ميكروأري ، يمكننا أن نبدأ في تحديد التوقيعات الجزيئية المحددة للسكان المتضررين في خلية معينة الحالات المرضية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4.5” Forceps	VWR international	82027-392
Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System	MDS Analytical Technologies	13821-00
CapSure™ HS LCM Caps	MDS Analytical Technologies	LCM 0214
CapSure® Macro LCM Caps	MDS Analytical Technologies	LCM 0211
Experion™ Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad	700-7001
Experion™ RNA HighSens Chips	Bio-Rad	700-7155	10 chips
Experion™ RNA HighSens Reagents	Bio-Rad	700-7156	10 chips
Experion™ RNA StdSens Chips	Bio-Rad	700-7153	10 chips
Experion™ RNA StdSens Reagents	Bio-Rad	700-7154	10 chips
Falcon® polypropylene Conical tube	BD Biosciences	352070
GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap	Applied Biosystems	N8010611
GeneChip® Human X3P array	Affymetrix	900516	6 chips
Histogene® LCM Frozen Section Staining kit	MDS Analytical Technologies	KIT0401	For staining solution, jars, ethanols and Xylene
Histogene™ LCM slides	MDS Analytical Technologies	12231-00
Micro Slide Box	VWR international	48444-004
Microm HM 505E cryostat	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22-050-350	Catalogue number for similar product as current product no longer available
Microprocessor Controlled 280 series Water bath	Thermo Fisher Scientific, Inc.	51221048	Model 282
Molecular Sieve	EMD Millipore	MX1583L-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	n/a	The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.
Nuclease-free water	Ambion	AM9932
PEN Membrane glass slides	MDS Analytical Technologies	LCM 0522
PicoPure® RNA Isolation kit	MDS Analytical Technologies	KIT0204
RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling	MDS Analytical Technologies	KIT0511B	12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit
RNase Zap®	Ambion	AM9780/2
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNasin® Plus	Promega Corp.	N261B
SuperScript™ III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080-044