Получение высокого качества РНК от единичных клеточных популяций в тканях человека Мозг Посмертные

Резюме

Мы опишем процесс с использованием лазерного захвата микродиссекции, чтобы изолировать и экстракта РНК из однородной популяции клеток, пирамидных нейронов в слое III в верхней височной извилины в посмертных человеческий мозг. Впоследствии мы линейно усиливать (T7-основе) мРНК, и гибридизации образца Affymetrix человека X3P микрочипов.

Аннотация

Мы предложили расследовать серый снижение вещества в верхней височной извилине видели у больных шизофренией, на допрос профили экспрессии генов пирамидных нейронов в слое III. Хорошо известно, что кора головного мозга является исключительно гетерогенной структуры, содержащей различных регионов, уровней и типов клеток, каждый из которых характеризуется определенными клеточные и молекулярные композиции и, следовательно, дифференциальное профили экспрессии генов. Чтобы обойти смешанных эффектов гетерогенности ткани, мы использовали лазер-захвата микродиссекции (LCM), чтобы изолировать наши конкретные камерного типа, т.е. пирамидных нейронов.

Около 500 пирамидных нейронов окрашивали решение окрашивания Histogene были получены с помощью Арктур ​​XT LCM системы. РНК затем выделяют из захваченных клеток и прошли два раунда T7 основе линейного усиления использованием Арктур ​​/ Молекулярная комплектов устройств. Experion LabChip (Bio-Rad) гель и electropherogram указано хорошего качества (м) РНК, с расшифровкой длина расширения прошлом 600nt необходимых для микрочипов. Количество мРНК получены усредненные 51μg, с приемлемой средней чистоты образца, как указано A260/280 соотношение 2,5. Экспрессия генов был профилированный использованием прав X3P GeneChip зонд массив из Affymetrix.

протокол

1) ткань срезов:

Мы получили необходимые ткани (контроль п = 9, шизофрения п = 9) от тканей Гарвардского ресурсный центр мозга, подобранных по возрасту, полу и посмертных интервал (PMI) (табл. 1). Жидкий азот пара блоков было примерно 3 мм толщиной были взяты из области Бродмана в 42 (верхней височной извилины).

Перед началом окрашивания пирамидных нейронов, условия должны быть оптимизированы с целью получения оптимального ткани "лифт" и высокое качество РНК. Ткань "лифт" описывает процесс при лазерном захвата микродиссекции, где нейроны помечены для захвата придерживаться крышкой и разделены, а остальные ткани остались позади.

Оптимизация:

1. В целях снижения активности РНКазы, что компрометирует РНК качества, относиться ко всем поверхностям, в том числе рабочей зоны, секционирования лезвие и слайды с решением обеззараживания РНКазы, таких как РНКазы ун-та, в дополнение к протирки со 100% этанола.
2. Раздел ткани с криостат установлен на уровне -17 ° С. Это уменьшает градиент температуры между комнатной температуре (слайды), криостат, и сухой лед (см. весь процесс ниже). Если температура ниже -20 ° С, срезах тканей, как правило, лоскуток, что делает их непригодными для использования. Все выше, и увеличивается градиент температуры, которая может поставить под угрозу целостность РНК.
3. Разделы должны быть 8мкм толстые, как толстый разделов, в конечном счете компромисс ткани "лифт". Такая толщина позволяет также правильно определить пирамидных нейронов для захвата.
4. Используйте простой незаряженных стеклянные пластинки (например, Histogene LCM слайды), поскольку они не влияют на ткани "лифт" во время лазерной процессе захвата. Мембранные слайдами также могут быть использованы, но они больше подходят для изоляции больших тканевых структур, как мембрана имеет тенденцию поднять немного во время лазерной процесс захвата, тем самым увеличивая инфракрасные (ИК) лазерного пятна размером ячейки и снижения специфичности.
5. Горы две секции на предметное стекло, так как более двух секций на слайд может поставить под угрозу качество РНК в связи с постоянным изменением температуры во время процесса секционирования.
6. После секционирования, место слайды сразу в микро окна скользят по сухим льдом, чтобы сохранить целостность РНК. Слайд коробки, содержащие мозга разделы впоследствии хранится при температуре -80 ° C до обработки.

Ранее мы уже определили, что для пирамидных нейронов, 500 клеток на случай адекватны, чтобы приобрести достаточно РНК для микрочипов гибридизации. Около четырех разделов необходимы в случае, в основном за счет секционирования и окрашивания артефактов.

2) Окрашивание пирамидных нейронов:

Идентификация пирамидных нейронов достигается с Histogene быстрое решение окрашивания и комплект, так как она позволяет визуализировать эти нейроны, без длительного воздействия водных растворов, тем самым сохраняя РНК.

1. Подготовка к процедуре окрашивания, добавляя 1 мкл ингибитора РНКазы в 100 мкл красящим раствором (например, Promega), чтобы ограничить активность РНКазы. Четыре секции (2 слайда), требуют 4μl РНКазы ингибитор добавляется 400μl решения Histogene окрашивание в 1,5 мл трубки микроцентрифужных (держится на льду). Для каждого раздела, мы используем 97μl этого решения, что дает нам адекватное пятна определить пирамидных нейронов.
2. Подготовка обезвоживания серии и ксилол: аликвоту 25 мл соответствующего ethanols в окрашивании банки обеспечены комплектом Histogene, т.е. 2x75%, 95%, 100% и 2 банки РНКазы без воды. Поместите все банки в ведерке со льдом, за исключением одного 75% банку, который вы поместите в морозильник -20 ° C. Под вытяжным шкафом, добавьте молекулярных сит в Ксилол банку, чтобы удалить лишнюю воду, которая может поставить под угрозу ткани "лифт".
3. Включите водяной бане (или тепла блок) с заданной температуры до 42 ° C и место 50мл Сокол трубки поддерживается стойкой в ​​водяную баню.
4. Удалите два слайда от -80 ° С и размораживания их на KimWipe в течение примерно 30 секунд, или только до угла слайды начинают размораживания.
5. Кратко исправить слайдов в 75% этаноле в течение 30 секунд в морозильной камере -20 ° C. Передача слайдов между окрашиванием банки использованием РНКазы всесильный щипцы для снижения загрязнения.
6. После 30 секунд промыть в нуклеазы без воды, разделы могут быть очерчены с пером барьер PAP, чтобы сконцентрироваться решение разделе, однако с равнины предметное стекло это не абсолютно необходимо.
7. Пятно четырех разделов с решением Histogene окрашивания в течение 20 секунд, с 97μl пятна / ингибитор РНКазы в разделе. Впоследствии, обезвоживают секций в заранее подготовленные ethanols на льду, в течение 30 секунд за один шаг. Окончательный 100% этанола шаг должен быть продлен до 3 минут, Для достижения достаточной обезвоживания адекватного ткани "лифт" и захвата на шапки LCM.
8. Погрузите слайды в ксилоле в течение 5 минут и воздушно-сухой в вытяжного шкафа в течение еще 5 минут до начала захвата.

Окрашивание шаги должны быть выполнены только при лазерной съемки сразу после этого. Все решения следует менять каждые 4-6 слайдов в целях предотвращения загрязнения и обеспечения надлежащего обезвоживания.

3) одной ячейки лазерного захвата микродиссекции:

После окрашивания, пирамидных нейронов из слоя III происходит с помощью лазерного захвата микродиссекции, с системой Арктур ​​XT и программное обеспечение. Одним словом, система работает по пульсирующей регулируемые силы ИК-лазера через термопластичной пленки расположена у основания крышки, что приводит к расширению / растяжение пленки непосредственно на клетки интерес. Когда крышка снята с ткани, клетки остаются захваченные / плен на колпачке. Живописные резюме приведено на рис 1.

Прежде чем начать эту процедуру, важно различать два типа крышек доступны с этой системой. Хотя крышка Макрос CapSure как правило, используется для захвата большего тканей структур, CapSure HS колпачки предназначены для улавливания небольшого количества отдельных клеток и, следовательно, эти колпачки имеют меньшую площадь поверхности, предназначенные для захвата. HS шапки также рельсы, которые мешают крышка от того, в непосредственном контакте с срез ткани, в то время как крышка макросов нет. Эти рельсы уменьшить эффект складывания ткани, которые могут повлиять не побуждать изменчивости размера пятна (лазерного импульса) в качестве макросов шапка сидит прямо на сложенный, неровные ткани. Для нашей процедуре, мы использовали HS колпачки, чтобы воспользоваться их способностью уменьшать эффект тканевой складной, но все время настройки макросов шапку на программное обеспечение для того, чтобы максимально захватили район, как и мы захватив большое количество клеток.

1. Нагрузка слайды и кепки на аппарате Арктур ​​XT. Используйте CapSure HS шапки, но сохранить настройки программы на макро. Щелкните на кнопке "Загрузить с обзор», чтобы получить обзор фотографии каждого слайда.
2. Отрегулируйте яркость / фокус на увеличение 2x, для того, чтобы определить, какой раздел будет оптимальным для лазерных захвата. Избегайте срезов ткани с чрезмерным складывающиеся, а выбрать разделы, которые не повреждены, гладкая, и окрашивают хорошо, особенно вблизи интересующей нас области, т.е. слой III.
3. Затем место колпачок на общей площади, где мы будем собирать, убедившись в том, включать слой III. Еще в 2 раза увеличение, убедитесь, что крышка рельсы не останавливаются на какой-либо складок, так как это будет наклона крышки.
4. Далее, мы подтверждаем, расположение места ИК лазерным вручную в 40-кратном увеличении. Если пятно (красный луч) не коррелирует с синим крестом, это может быть скорректирована, щелкнув правой кнопкой на месте и выбрать "расположен ИК-пятно".
5. В 40х, мы можем приступить к определению пирамидных нейронов в соответствии со следующими критериями (1) клетки, которые пирамидальной формы и (2) проксимальная часть апикальной и / или базальных дендритов можно идентифицировать (рис. 1А).

Теперь регулировать мощность и длительность лазерного импульса, чтобы захватить пирамидальных нейронов. Это особенно важно, так как она определяет специфику ячейки захватили в дополнение к числу клеток в плен. Если импульс слишком слаб, не все выявленные нейроны будут захвачены, а если пульс слишком сильно она может захватить окружающую ткань / ячейки, кроме нейрона в покое. Как правило, с тканевой и клеточной спецификации занятых здесь, лазерная прочность (70mW) и продолжительности (16msec) приводят пятно размером 25 мкм, примерно в соответствии с пирамидальной размера нейрона (рис. 1б). Однако, эти параметры тонкой настройки к каждому разделу, чтобы получить примерно такой же размер пятна на случай. Если "поднять" находится под угрозой, всегда можно увеличить количество клеток захватили, чтобы сохранить количество РНК получить каждом случае сопоставимы. Тем не менее, не забудьте сохранить ваши время захвата включая изменение цвета до 1,5 часов, а дольше, чем это может поставить под угрозу РНК качества.

1. Сначала сохраните положение крышки, нажав на знак плюс в позиции функции. Таким образом, если какой-либо причине мы должны снять шапку и тогда нужно, чтобы вернуть его на том же месте, шапка всегда будет возвращаться точно на том же месте, что вы регулировать размер пятна для.
2. Введите эти значения в блок управления: 70 к власти и 16 в срок. Снимите "авто двигаться этапе" вариант, и убедитесь, что право размер символа коррелирует с символом на панели справа.
3. Выберите опцию круга (внизу справа), чтобы выбрать нейрона, что вы хотели бы проверить захвата, а затем активировать лазер, щелкнувна "выборочная проверка ИК".
4. Место сделанные лазерным должен сначала иметь четкие темные кольца вокруг объекта в плен. Если это кольцо слишком светлое, клетка не был захвачен. Если есть темное пятно в середине темного кольца, то лазерная прочность / продолжительность слишком велико, и это может оказать негативное влияние на настоящее РНК в захваченных клеток. Убедитесь, что кольцо является достаточно большим, чтобы охватить клетки, но мало, что она не включает нежелательные ткани или другие клетки.
5. Повторите этот процесс на различных частях ткани в слой, который вы хотите захватить, чтобы проверить, что размер пятна не отличается в зависимости от местоположения. Отрегулируйте соответственно.
6. После лазерного пятна была скорректирована, и далее выявлять пирамидных нейронов для захвата. Мы выявляем около 500 клеток в образце, в результате чего примерно 500pg тотальной РНК на один образец. Мы также обычно используют только один раздел, чтобы уменьшить количество захватить время, как шапка должна быть скорректированы для каждого раздела. После того как вы определили все клетки вам нужно, нажмите кнопку лазерного захвата кнопку и все ваши клетки будут автоматически захватываются на колпачок (рис. 1в).
7. После того как все клетки были захвачены в плен, перенести шапку другой части слайда, который не содержит раздела. Возвращайтесь туда, где клетки были взяты в плен и убедитесь, что по крайней мере 90% нейронов были удалены. Если нет, то не пытайтесь вернуть те же клетки, но найти область, где большинство клеток были взяты в плен, а также захватить несколько ячеек в том же районе. Перемещение шапку QC станции.
8. Место шапку в 0,5 мл трубки микроцентрифужных от Applied Biosystems (кат. # N8010611), содержащий 50 мл буфера для экстракции (PicoPure РНК Изоляция комплект). Крышка была разработана, чтобы совершенно вписаться в этот конкретный трубки, чтобы предотвратить утечку буфера.
9. Включите сборки вверх дном, убедившись, что добыча буфера охватывает всю крышку, и поместить его в нижней части 50мл Сокол трубки уже присутствует в водяной бане установлена ​​на уровне 42 ° C. Нейроны инкубировали в течение 30 минут, чтобы удалить ткань от шляпки.
10. После этого, центрифуга трубки и крышки сборки в течение 2 минут при 800 г. Снимите крышку и сохранить оставшиеся экстракт камере -80 ° C до извлечения РНК. В качестве дополнительной предосторожности, вы можете пересмотреть шапки QC станции на лазерном аппарате захвата гарантировать, что все нейроны были удалены из крышки себя.

4) Получение РНК из отдельных нейронных популяций:

Можно перейти непосредственно от захвата к изоляции, или оттепель образец хранится в морозильной камере -80 ° C. В нашем эксперименте мы впервые собрали все необходимые образцы и хранить их при температуре -80 ° C до перехода к РНК изоляции.

РНК изоляция выполняется с помощью PicoPure Комплект изоляции, которая предназначена для изоляции небольшого количества клеток от LCM образцы и сохранить низким обилием мРНК. Как правило, мы следуем протоколу, который входит в комплект. Ниже мы даем общее описание процесса.

1. После оттаивания, добавить 70% этанола (входит в комплект) и центрифуги по заранее обусловленной очистки колонку, чтобы связать РНК в колонке фильтр.
2. После мытья лечения РНК с ДНКазы с тем чтобы обеспечить полное удаление ДНК, чтобы исключить риск ДНК помех. Этот шаг особенно важен в низовьях таких приложений, как в режиме реального времени QRT-PCR.
3. После ДНК переваривается, есть еще один мыть шаг. Убедитесь, что нет промывочного буфера остается в колонке прежде, чем перейти к другому микроцентрифужных трубки, как и любое наличие буфера в конечный образец приведет к меньшему, начиная РНК для усиления. Чтобы обеспечить это, мы центрифуги последний шаг мыть в течение 2,5 минут, а не 2 минуты, как предлагается в протоколе предусмотрено.
4. Наконец, элюции буфера и инкубируют на фильтр в колонке в течение 1 минуты с последующим центрифугированием, чтобы элюировать общей РНК.
5. Внесите 1.3ul каждого из образцов в 0,5 мл отдельных труб для запуска Experion HighSens LabChip. Замораживание остальных образцов при температуре -80 ° C.

Контроль качества очень важно, когда выделения РНК, особенно, когда величина мала и количество, необходимое, например, для микрочипов экспериментов (15μg), велика. Извлеченные РНК, следовательно, должна пройти контроль качества на различные моменты времени в течение всего процесса. В первом случае после экстракции. Устанавливается общая целостность РНК с помощью валового рассмотрение 18S/28S пики электрофореграммы и виртуальных гель порожденных Experion HighSens LabChip. Этот метод быстр и обеспечивает два способа измерения и проверить качество РНК-electropherogram и виртуальных гель (рис. 2). Если качество общей РНК сравнительно хорошо (рис. 2A, B и C, D), мы затем продолжить с линейно усиливать мРНК, на долю которой приходится примерно 2% от общей РНК.

5) Линейные усиления:

Усиление РНК, выделенная из лазерной захватили ткани необходимо для того, чтобы произвести достаточное количество РНК для последующей гибридизации микрочипов и QRT-PCR эксперименты. Для того, чтобы свести к минимуму возможность потенциальных смешивает отметил с T7 основе линейного усиления, мы минимизировали количество раундов усиления необходимости за счет максимального количества начиная лазерной захватили материалы ткани.

Наши предварительные данные (не показаны) предполагают, что два раунда линейного усиления (RiboAmp HS ^ПЛЮС комплект) от общего числа РНК, выделенная из тканей, содержащих около 500 клеток будет производить около 50 мкг АРНА - достаточным для выполнения обоих микрочипов и QRT-PCR экспериментов. Если это возможно, избежать ненужных передачи образцов от 0,2 мл и 0,5 мл трубы с использованием 0,5 мл блока в термоциклер и 0,5 мл труб предусмотрено в комплекте.

Опять же, протокол следует это тот, поставляемые в наборе. Сокращенный вариант описан здесь.

1. Добавить 1 мкл грунтовки, предоставляемых общей выборки РНК (около 11μl) и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 5 минут, с последующим охлаждением при температуре 4 ° С в течение 1 минуты.
2. Добавить первой цепи кДНК компоненты вместе с индексом III обратной транскриптазы и инкубировать при 42 ° С в течение 1 часа.
3. После второй цепи кДНК синтеза, очистки результате кДНК через колонки при условии очистки. Здесь мы рекомендуем, чтобы при передаче образцов плюс обязательные буфер для очистки колонке, к центрифуге пробирок с образцами дважды - один раз после переноса образца в колонну, так как до 1 мкл образца остается на стенках труб после передачи.
4. Вымойте кДНК с мытья буферов и элюировать очищенной кДНК с элюции буфера.
5. Добавить в пробирке компонентов транскрипции и инкубировать в течение 6 часов при температуре 42 ° C.
6. После шага ДНКазы, очищают результате Арна с буферов, в конце концов элюированием его в общей сложности 12μl элюирования буфера.

РНК проходит очередной раунд линейного усиления (с отдельными грунтовки - см. комплект протокол), после чего несколько шагов контроля качества работают. Один мкл образец разбавляют до примерно 250ng/ul, чтобы определить длину мРНК стенограммы и концентрации с StdSens LabChip (Experion). Традиционные Affymetrix микрочипов технология требует мРНК, по меньшей мере 600 нуклеотидов в длину для того, чтобы быть обнаружены. Гель и electropherogram получена из LabChip поэтому изобразить это минимальная длина стенограммы мРНК (рис. 3).

Дополнительного контроля качества определяется с помощью анализа NanoDrop спектрофотометр, где соотношение из двух оптических плотностей, т.е. A260 и A280, определяет РНК чистоты. Образцы с оптической плотностью около 2,1 должны быть маркированы для генного анализа экспрессии, хотя отношения до 2,7 было показано, что сравнимо по качеству гибридизации. Концентрация должна быть в пределах от 800ng/μl-1μg/μl, а ниже, чем это привело к деградации РНК при хранении (даже при температурах ниже -80 ° С), а также привело к плохим результатам микрочипов.

6) Биотин маркировки мРНК образцов для анализа Affymetrix микрочипов:

TURBO маркировки Биотин комплект (на конец маркировки) из молекулярных устройств используется для обозначения Арна получена из усиленного образцов. Сокращенный вариант протокола приведен здесь.

1. Регулировка громкости 20 мкг каждого образца Арна к 13μl общего добавлением нуклеазы без воды или путем концентрации образца в вакуумной центрифуге, в зависимости от исходной концентрации. Хотя только 15μg необходимо для чипа Affymetrix использованы, мы добавляем 20 мкг на первоначальную реакцию, так как некоторые РНК теряется во время инкубации и центрифугирования.
2. Инкубируйте биотина реакции при 85 ° С в течение 30 минут, а затем охладите при 4 ° C.
3. Удалите избыток этикетке биотин путем центрифугирования со специализированными колонки обеспечиваются комплектом. В некоторых случаях, особенно при деградированных мРНК как, например, полученные из FFPE (формалин-фиксированных, парафин) образцов, это может быть так, что не все мРНК вымывается в один этап центрифугирования. Затем мы рекомендуем добавить между 1-5 мкл дополнительных нуклеазы без воды в колонну с последующим дополнительным шагом центрифугирования 1 минуту. Это гарантирует, что большинство меченых образцов вымывается.
4. Конечный объем 20 мкл, с концентрацией 1μg/μl. Если дополнительные нуклеазы без воды был добавлен, концентрат образцыправильный объем с вакуумной центрифуге. Мы рекомендуем держать хранения концентрации перед началом гибридизации более 800ng/μl, как мы выяснили, что меньше, чем это приведет к деградации во время хранения и / или гибридизации приводит к плохим результатам микрочипов.

Арна тогда гибридизированных и экспрессии генов профилированные, с использованием прав X3P GeneChip зонд массив из Affymetrix. Так как этот чип был разработан для более деградировали Арна, мы использовали его в качестве меры предосторожности, поскольку многие факторы мы не можем контролировать может повлиять на качество посмертных тканей. Поскольку наши лаборатории не имели надлежащие возможности для гибридизации, процесса была выполнена в основной объект Геномная Partners.

Представитель Результаты:

1 +2 +3) ткани срезов, окрашивание пирамидных нейронов и лазерно-захвата микродиссекции:

Протокол, описанный выше, должны привести к двух слайдов с четырьмя разделами на слайд. Каждая секция должна быть гладкой с минимальным разрывов, трещин и складные. При правильной окраске, пятно будет определять мрачно окрашенных пирамидных нейронов около 20 - 25 мкм в размере с пирамидальную форму и видимые апикальных дендритов. С CapSure шапки HS на макро-настройки и правильной настройки мощности лазера и силы для каждого раздела, вы должны получить около 500 - 700 клеток на разделе / ​​случай в результате чего по крайней мере 500pg от общего числа РНК. Примерно 85 - 100% нейронов будет придерживаться крышкой (рис. 1).

4) Получение РНК из отдельных нейронных популяций:

Как описано, после полной изоляции РНК, мы проверяем качество РНК с помощью electropherogram и виртуальных гель через Bio-Rad Experion. В electropherogram, вы должны увидеть две отдельные пики, соответствующие 18S и 28S рибосомных РНК единиц. С посмертной ткани, однако, это не всегда так, как ткань может ухудшиться из-за факторов до секционирования. Вы, как правило, видим большой удар указывает деградации, с большой пик в районе 18S и 28S меньше максимума (рис. 2а, б). Пока electropherogram профили сопоставимы между образцами, мы нашли настоящего руководства, приведет к мРНК качество достаточно хорошо, чтобы выполнять как RT-PCR и микрочипов исследований (Imbeaud и соавт., 2005).

Если есть слишком много деградации - о чем свидетельствует большая площадь под кривой electropherogram, или, если пики не видно (рис. 2, D) - клетки должны быть захвачены снова из ткани. Мы также рекомендуем делать ткани очистить теста, где РНК извлекается из целые куски разделе (а не только клетки), перед возвращением клетки определить, является ли сам блок ткани снижается.

5) Линейные усиления:

Для проверки качества мРНК после двух туров линейного усиления, мы использовали как Bio-Rad Experion StdSens LabChip и NanoDrop спектрофотометр. Традиционные Affymetrix микрочипов технология требует мРНК, по меньшей мере 600 нуклеотидов в длину для того, чтобы быть обнаружены, которая была получена с этим протоколом. На самом деле, мРНК длиной были обнаружены в 1000-нуклеотидных диапазона. Electropherogram также отражает это с большими пиками медленно сходил, как функция времени (рис. 3А, Б).

NanoDrop показания указанных A260/A280 соотношение среднем 2,5 через образцы, с указанием жизнеспособной мРНК (табл. 2).

Наши результаты показывают, что с этим протоколом, как количество и качество РНК получены достаточно хорошо, чтобы допросить экспрессии генов различия через Affymetrix человека X3P GeneChip.

6) Биотин маркировки мРНК образцов для анализа Affymetrix микрочипов:

После гибридизации Affymetrix человека X3P GeneChip, мы достигли процентов звонков в среднем 26,6% (табл. 2), что указывает на адекватную гибридизации и датчик интенсивности.

Таблица 1: Когорта резюме

90

Образцы	Группа	Секс	Возраст	PMI
C1	КОНТРОЛЬ	F	79	15,00
C2	КОНТРОЛЬ	М	22	21,47
C4	КОНТРОЛЬ	М	75	20,25
C5	КОНТРОЛЬ	М	80	15,50
C6	КОНТРОЛЬ	F	58	21,08
C8	КОНТРОЛЬ	М	61	17,00
C10	КОНТРОЛЬ	F	71	20,50
C11	КОНТРОЛЬ	F	12,66
C12	КОНТРОЛЬ	F	86	6,92
ОЗНАЧАЕТ		4M/5F	69,11	16,71
S1	SCHIZOPH.	F	93	6,92
S2	SCHIZOPH.	М	55	21,40
S3	SCHIZOPH.	F	67	21,80
S4	SCHIZOPH.	F	55	22,00
S5	SCHIZOPH.	М	36	17,97
S6	SCHIZOPH.	М	62	10,75
S8	SCHIZOPH.	F	92	17,80
S11	SCHIZOPH.	М	56	21,83
S12	SCHIZOPH.	F	88	13,33
ОЗНАЧАЕТ		4M/5F	68,11	16,90

Сокращения: Ж - женский, М - Мужчина, PMI - посмертный интервал, schizoph. - Шизофрения.

Таблица 2: Резюме результатов изображением РНК концентрации, качества и эффективности гибридизации

Образцы	[МРНК] нг / UL	A260/A280	Зонд Интенсивность	Процент вызовов
C1	1318,01	2,67	63	19,5
C2	2312,93	2,37	147	30,6
C4	1811,92	2,44	69	26,6
C5	1316,26	2,51	78	34,7
C6	1663,24	2,39	66	33,8
C8	633,05	2,54	101	15,2
C10	1326,4	2,47	92	32,5
C11	994,24	2,75	76	22,4
C12	817,23	2,7	56	15,2
S1	2560,88	2,47	78	25,0
S2	2169,61	2,43	76	26,5
S3	2067,32	2,52	87	22,1
S4	1563,89	2,75	82	28,1
S5	2071,44	2,44	88	28,2
S6	2532,59	2,34	72	30,7
S8	2189,22	2,5	62	31,8
S11	1669,89	2,47	41	27,3
S12	1739,35	2,47	42	28,0
ОЗНАЧАЕТ	1708,75	2,51	76,44	26,57

Рисунок 1:. Резюме лазерного захвата микродиссекции процесса) пирамидальные нейроны выявляются морфологически. B) После импульсного лазера через термопластичной пленки, клетки придерживаться колпачок и, следовательно, уже не на слайд, оставляя окружающую ткань позади. С) Микрофотография однородной популяции клеток придерживаясь на CapSure Cap после лазерной записи.

Рисунок 2:. Общее качество РНК контроль + B) Представляет хорошее качество общей РНК после изоляции, в то время как C + D) показано, что общая РНК не должна выглядеть после изоляции. ) Electropherogram с четкими 18/28S пики, соответствующие виртуальные гель (B). С) electropherogram показывает большую площадь под кривой и не 18S/28S пиков указывает РНК деградации. Это также отображаются в виртуальном гель (D).

Рисунок 3:. МРНК контроль качества A + B) Electropherogram () и виртуальных гель (B) с указанием мРНК стенограммы Ленгм (разворот), необходимых для исследования микрочипов, то есть расширение прошлых 600 нуклеотидов (нт). C + D) Electropherogram (C) и виртуальных гель (D) показывает, что недостаточное распространение мРНК будет выглядеть, как длина стенограммы мРНК не выходить за 200nt.

Обсуждение

Здесь мы пытаемся настроить протокол для извлечения однородной популяции клеток из разнородных тканей мозга посмертных использованием Арктур ​​XT системы и связанных с ними комплекты выделения РНК. Как отмечалось выше, мы сделали некоторые изменения в первоначальный протоколов, предоставляемых компанией, в целях максимизации РНК целостности. Успешный захват отдельных клеток зависит исключительно от оптимизации шагов до захвата в целях достижения максимальной клетки с хорошим РНК. Эти шаги включают в себя различные параметры, связанные с ткани срезов и окрашивание. Короче говоря, по отношению к ткани подготовки к ним относятся: 1) уменьшение градиента температур, когда секционирования, 2) только размещение 2 секции на слайд, 3) выполнение всех обезвоживания шаги на льду, 4) добавлением РНКазы ингибитора на пятно, 5) увеличение обезвоживания продолжительность в окончательном 100% этанола до 3 минут.

Что касается захвата, мы считаем, что сочетание CapSure HS шапки, с помощью программного обеспечения на макро-настройки, должна обеспечивать оптимальные результаты. С контролируемой влажностью среды имеет решающее значение для захвата отдельных клеток, так как высокая влажность резко снижает ткани "лифт". Высокая температура может также оказать негативное влияние на качество РНК.

В протоколе РНК изоляции с комплектом PicoPure, Есть два этапа стирки. Важно убедиться, что все промывочного буфера удаляется прежде, чем перейти к другому микроцентрифужных трубка для элюции РНК, как и любое наличие буфера в конечный образец приведет к меньшему, начиная РНК для усиления. Чтобы обеспечить это, мы центрифуги последний шаг мыть в течение 2,5 минут, а не 2 минуты, как предлагается в протоколе предусмотрено.

По большей части, линейного усиления протокол был в соответствии с инструкциями производителя. Тем не менее, два важных момента должны быть приняты во внимание при использовании этого протокола: 1) попытаться ограничить потери РНК с помощью избыточной передачи образцов между трубками, используя лишь 0,5 мл труб проводить в сочетании с 0,5 мл блока в термоциклер и 2) при передаче образца очистки колонки для очистки кДНК, убедитесь, что для замедления вращения пробирок с образцами после первой передачи. Это приведет к дополнительным 1-2UL образца, чтобы добавить к очистке колонку и, следовательно, может увеличить кДНК восстановления.

Когда использованием TURBO конце маркировки комплект для биотин-маркировки ограниченной образцы Арна, мы предлагаем добавить несколько лишних мкл в воды перед центрифугированием шаг, чтобы увеличить выход меченой РНК извлекается из колонки. Дополнительная минута центрифугирования также поможет в этом отношении, особенно если вы работаете с деградированных ткани, такие как FFPE ткани.

Мы уверены, что этот протокол позволит пользователю выделять небольшие однородные структуры, такие как единый клеточные популяции, в рамках гетерогенных посмертных тканей мозга. Это снижает эффект разбавления окружающих сооружений и других клеточных типов расположены в различных слоях в пределах мозга, что приводит к результатам направлены специфические типы клеток под следствием. Как качество получаемого РНК является достаточно хорошим для исследования микрочипов, мы можем начать определить конкретные молекулярные подписи конкретных популяций клеток при болезни пострадавших государств.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4.5” Forceps	VWR international	82027-392
Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System	MDS Analytical Technologies	13821-00
CapSure™ HS LCM Caps	MDS Analytical Technologies	LCM 0214
CapSure® Macro LCM Caps	MDS Analytical Technologies	LCM 0211
Experion™ Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad	700-7001
Experion™ RNA HighSens Chips	Bio-Rad	700-7155	10 chips
Experion™ RNA HighSens Reagents	Bio-Rad	700-7156	10 chips
Experion™ RNA StdSens Chips	Bio-Rad	700-7153	10 chips
Experion™ RNA StdSens Reagents	Bio-Rad	700-7154	10 chips
Falcon® polypropylene Conical tube	BD Biosciences	352070
GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap	Applied Biosystems	N8010611
GeneChip® Human X3P array	Affymetrix	900516	6 chips
Histogene® LCM Frozen Section Staining kit	MDS Analytical Technologies	KIT0401	For staining solution, jars, ethanols and Xylene
Histogene™ LCM slides	MDS Analytical Technologies	12231-00
Micro Slide Box	VWR international	48444-004
Microm HM 505E cryostat	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22-050-350	Catalogue number for similar product as current product no longer available
Microprocessor Controlled 280 series Water bath	Thermo Fisher Scientific, Inc.	51221048	Model 282
Molecular Sieve	EMD Millipore	MX1583L-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	n/a	The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.
Nuclease-free water	Ambion	AM9932
PEN Membrane glass slides	MDS Analytical Technologies	LCM 0522
PicoPure® RNA Isolation kit	MDS Analytical Technologies	KIT0204
RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling	MDS Analytical Technologies	KIT0511B	12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit
RNase Zap®	Ambion	AM9780/2
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNasin® Plus	Promega Corp.	N261B
SuperScript™ III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080-044