人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

要約

我々は、死後、人間の脳の上側頭回の層IIIの均質な細胞集団、錐体細胞からRNAを分離して抽出するためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用してプロセスを説明します。私たちは、その後直線的に（T7ベース）mRNAを増幅し、Affymetrix社人間X3Pマイクロアレイにサンプルをハイブリダイズする。

要約

我々は、レイヤーIIIの錐体細胞の遺伝子発現プロファイルを問い合わせることにより、統合失調症の患者に見られる上側頭回の灰白質の減少を調査することを提案した。それは、大脳皮質は多様な領域、層および別個の細胞および分子組成物およびそのための差動遺伝子発現プロファイルによって特徴づけられるそれぞれの細胞タイプを、構成する非常に不均質構造であることはよく知られています。組織の不均一性の交絡の影響を回避するために、我々は特定の細胞型、すなわち錐体細胞を単離するために、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を使用。

Histogene染色液で染色された約500個の錐体細胞は、アルクトゥルスXT LCMシステムを使用して捕獲された。 RNAを捕捉細胞から単離され、アルクトゥルス/分子デバイスのキットを用いてT7ベースの線形増幅を2回施行した。 Experion LabChip（Bio - Rad社）ゲルや電気泳動図では、マイクロアレイに必要な過去の600ntを拡張する転写産物の長さで、良質の（m）のRNAを示した。得られたmRNAの量は2.5、A260/280比で示されるように許容可能な平均値サンプルの純度で、51μgの平均値。遺伝子発現は、アフィメトリクスからヒューマンX3PのGeneChipプローブアレイを用いてプロファイリングした。

プロトコル

1）組織切片：

我々は、年齢、性別及び死後間隔（PMI）​​（表1）については一致した、ハーバード脳組織リソースセンターから必要な組織を（コントロールのn = 9、統合失調症のn = 9）を得る。液体窒素蒸気ブロックは、約3mm厚は、ブロードマンの領域42（上側頭回）から採取したれました。

錐体細胞の染色を開始する前に、条件は最適な組織"リフト"と高いRNAの品質を得るために最適化する必要があります。組織"リフト"はキャプチャ用にマークされたニューロンは、キャップに付着レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、中にプロセスを説明し、残りの組織が残されている間に分離されています。

最適化：

1. 100％エタノールでダウン拭きに加え、RNアーゼザップなどのRNase除染液、、とブレードとスライドの切削、、RNAの品質を損なうRNase活性を、減らす作業領域を含むすべての面を、治療するために。
2. -17に設定されたクライオスタットを持つセクション組織を℃にこれは、室温（スライド）、クライオスタット、ドライアイスの間に温度勾配を低減します（下の全体のプロセスを参照してください）​​。温度が-20℃を下回っている場合、組織切片では、それらが使用できなくなる、細断処理す​​る傾向がある。高い、とRNAの完全性が損なわれる可能性が温度勾配が増加する、。
3. のセクションでは、厚いセクションでは、最終的に組織"リフト"が損なわれるとして、厚さ8μmにする必要があります。この厚さは、キャプチャするための錐体ニューロンの正しい識別が可能になります。
4. レーザーキャプチャプロセス中に、組織"リフト"に干渉しないこれらのような単純な荷電ガラススライドを（例えばHistogene LCMスライド）を使用してください。膜のスライドも使用できますが、膜は、それによって赤外線（IR）レーザーのスポットサイズを増加させると、細胞の特異性を減少させる、レーザーキャプチャプロセス中にわずかに持ち上げる傾向があるので、これらは、大規模な組織構造を分離するより適していますすることができます。
5. スライドごとに2つ以上のセクションでは、セクショニングプロセス中に起因する温度で一定に変化するRNAの品質を損なう可能性があるので、ガラスのスライドごとに2つのセクションをマウントします。
6. 切削後は、RNAの完全性を維持するために、直ちにドライアイス上でマイクロスライドボックスにスライドを配置する。処理° Cまで、脳切片を含むスライドボックスが続いて-80℃で保存されています。

我々は以前に錐体神経細胞については、ケースごとに500個の細胞は、マイクロアレイのハイブリダイゼーションのために十分なRNAを得るために適切であると判断した。約4つのセクションは主に切片と染色のアーティファクトに、ケースごとに必要とされる。

錐体ニューロンの2）染色：

それは、私たちはそれによってRNAを保持し、水溶液に長時間さらされることなく、これらのニューロンを可視化することができるように錐体細胞の同定は、Histogeneクイック染色液およびキットによって実現されます。

1. RNase活性を制限するために染色液（例えば、Promega）を100μlのあたり1μlのRNase阻害剤を添加することにより染色手順の準備。つのセクション（2スライド）は、RNase阻害剤の4μlが必要1.5ml微量遠心チューブ（氷上で保持）にHistogene染色液の400μlに加えた。各セクションでは、錐体細胞を識別するために、私たちに十分な染色を与えるこのソリューションの97μl使用します。
2. Histogeneキット、すなわち2x75％、95％、100％、RNaseフリー水を2瓶で提供される染色瓶に適切なethanols物のアリコートを25ミリリットル：脱水シリーズとキシレンを準備します。 -20℃の冷凍庫内では、片足75％瓶、を除いて、氷のバケツにあるすべてのjarファイルを置きます。ヒュームフードの下に、組織"リフト"を損なう可能性のある余分な水分を除去するキシレン瓶にモレキュラーシーブを追加。
3. 42に設定温度を水浴（またはヒートブロック）に切り替える℃、水浴のラックでサポートされている50ミリリットルファルコンチューブを置く。
4. 〜80から約30秒間、キムワイプ上でCとデフロスト、それらを2つのスライドを削除する、またはスライドの隅には、霜に始めるところまで。
5. 簡単に言うと-20℃の冷凍庫で30秒間75％エタノールでスライドを修正。汚染を減らすためのRNaseしてやら鉗子を用いて染色瓶の間にスライドを転送する。
6. ヌクレアーゼフリー水で30秒洗浄後、切片がソリューションのセクションを集中するためにPAPバリアペンで概説されることはありますが、普通のガラスのスライドで、これは必ずしも必要ではない。
7. セクションごとの汚れ/ RNase阻害剤の97μlを、20秒間Histogene染色液で4つのセクションを染色。続いて、ステップごとに30秒間、氷の上で事前に準備ethanolsのセクションを脱水する。最終的に100％エタノールのステップは3分に延長されるべきである、十分な組織"リフト"のための十分な脱水を実現し、LCMキャップの上に捕捉するために。
8. キャプチャする前に別の5分間5分、ヒュームフードの空気乾燥のためのキシレンにスライドを浸し。

その直後にレーザー捕捉場合染色の手順は、実行する必要があります。すべてのソリューションは、汚染を防止するために、適切な脱水を確実にするためにあらゆる4月6日のスライドを変更する必要があります。

3）単一細胞レーザーキャプチャーマイクロダイセクション：

染色後、レイヤーIIIの錐体細胞は、アルクトゥルスXTシステムとソフトウェアで、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して削除されます。簡単に言えば、システムは目的の細胞に直接フィルムの延長/膨満、その結果、キャップの底部にある熱可塑性フィルムを介して調節可能な強度のIRレーザーをパルス化することによって機能します。キャップを組織から解除されると、細胞がキャップに捕捉/キャプティブ残ります。絵画概要を図1に示されている。

この手順を開始する前に、それはこのシステムで利用可能なキャップの2つの種類を区別することが重要です。マクロポイカプセルのキャップは一般的に大規模な組織構造を捕捉するために使用されている間に、ポイカプセルHSキャップは個々の細胞の小さな数字をキャプチャするために設計されており、従ってこれらのキャップは、キャプチャ用に指定されたより小さな表面積を有している。マクロのキャップはそうではないHSキャップはまた、組織切片に直接接触されてからキャップを防ぐレールを持っている。これらのレールは、マクロのキャップが折り畳まれた、不均一な組織に直接座っているように、スポットサイズのばらつきを（レーザーパルスの）影響を与えるまたは誘発する可能性がある組織の折り畳みの効果を減少させる。私たちの手順については、我々は組織の折り畳みの効果を減少させる能力を活用するためにHSキャップを使用していましたが、我々は多数のセルをキャプチャしているように写る範囲を最大にするためにソフトウェアでマクロキャップの設定を維持。

1. アルクトゥルスXTの装置の上にスライドしてキャップをロードする。ポイカプセルHSのキャップを使用しますが、マクロのプログラムの設定を保持します。各スライドの概観写真を得るために"概要とロード"ボックスをクリックしてください。
2. セクションでは、レーザーキャプチャー用に最適であるか決定するために、2倍の倍率で明るさ/フォーカスを調整。過剰な折りたたみで組織切片を避けるのではなく、滑らかな、無傷であり、特に関心、すなわち層IIIの領域に近い、よく染色セクションを選択します。
3. 我々は、我々は層IIIを含むように確実に、キャプチャされる一般的な領域の上にキャップを置きます。それでも2倍の倍率で、これはキャップを傾けるのでキャップのレールは、任意の折り目に休むしないことを確認してください。
4. 次に、我々は、手動で40倍の倍率でのIRレーザースポットの位置を確認してください。スポット（赤線）は青のクロスと相関していない場合は、この場で右クリックし、"あるIRスポット"を選択することによって調整することができます。
5. 40倍で、我々は、以下の基準に従って錐体細胞を識別するために始めることができます（1）形の錐体であり、（2）心尖部および/または基底樹状突起の近位部分は（図1A）識別可能な細胞が。

我々は現在、錐体ニューロンをキャプチャするために、レーザーパルスのパワーと持続時間を調整する。それは、キャプチャされたセルの数に加えて、キャプチャされた細胞の特異性を決定するので、これは、特に重要です。パルスが弱すぎる場合、パルスが強すぎる場合には、単独でニューロン以外の周囲の組織/細胞を取り込むことができる一方ではない全ての特定のニューロンは、キャプチャされます。一般的に、ここに採用組織および細胞の仕様で、約錐体ニューロンの大きさに沿ってレーザーの強さ（70mWで）と25μmのスポットサイズの持続時間（16msec）の結果、（図1B）。しかし、これらの設定は、ケースごとにほぼ同じスポットサイズを得るために各セクションに微調整されています。 "リフト"が侵害された場合、1つは常に同等のそれぞれのケースから得られたRNAの量を維持するために、キャプチャされたセルの数を増やすことができます。しかし、、1.5時間で染色を含めてキャプチャ時間を保つためにこれより長いとRNAの品質を妥協できることを確認してください。

1. 最初の位置の機能でプラス記号をクリックして、キャップの位置を保存します。何らかの理由で我々はキャップを除去し、同じ場所でそれを元に戻す必要がある必要がある場合は、この方法では、、キャップは常にあなたがのためのスポットサイズを調整している正確に同じ場所に戻ります。
2. 持続時間に電源および16に70：コントロールボックスにこれらの値を入力します。 "自動移動ステージ"オプションをUnclick、そして右のサイズの記号が右側のパネルにシンボルと相関していることを確認してください。
3. キャプチャをテストしたいというニューロンを選択するために円のオプションを（右下）を選択し、クリックしてレーザーをアクティブに"テストIRスポット"について。
4. レーザーによるスポットは、まず、キャプチャされたオブジェクトの周囲にさわやかなダークリングが必要です。このリングが軽すぎる場合、細胞はキャプチャされませんでした。 darkリングの真ん中にダークスポットが存在する場合、レーザー強度/持続時間はあまりにも偉大であり、それは、取得されたセル内のRNAの存在に悪影響を及ぼす可能性があります。リングはセルを包含するのに十分な大きさ、それが不要な組織または他の細胞が含まれていないことを十分に小さくなっていることを確認します。
5. スポットサイズは​​場所によって違いがないことを確認して、キャプチャしたいという層内の組織の異なる部分で処理を繰り返します。それに応じて調整します。
6. レーザースポットが調整されると、キャプチャの錐体細胞を識別するために引き続き。我々は、サンプルあたりのトータルRNAの約500pg、その結果、サンプルあたり約500個の細胞を、識別する。我々はまた、通常、キャップは、各セクションに対して再調整する必要があるので、キャプチャ時間の量を減らすために、ひとつのセクションを使用してください。一度あなたが必要とするすべてのセルを特定している、（図1C）レーザーキャプチャボタンを押すと、すべてのセルが自動的にキャップに捕捉されます。
7. すべてのセルがキャプチャされると、セクションが含まれていないスライドの別の部分にキャップを戻します。細胞が捕獲された場所に戻って、神経細胞の少なくとも90％が削除されたことを確認してください。されていない場合は、同じ細胞を奪回しようとするが、ほとんどの細胞のがキャプチャされたエリアを見つけて、同じ地域で複数のセルをキャプチャしないでください。 QCステーションにキャップを戻します。
8. 抽出緩衝液50mlの（PicoPure RNAアイソレーションキット）を含む、アプライドバイオシステムズ（カタログ番号N8010611）から0.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにキャップを置きます。キャップは、漏れからバッファを防ぐために、この特定のチューブにぴったり合うように設計されています。
9. 抽出緩衝液が全体のキャップをカバーしていることを確認して、上下逆さまにアセンブリをオンにして、42℃水浴セット内にすでに存在する50ミリリットルファルコンチューブの底℃でそれを置くニューロンは、キャップから組織を除去するために、30分間インキュベートする。
10. その後、800 gで2分間、チューブとキャップアセンブリを遠心してください。キャップを外し、-80、残りの細胞抽出物を保管° Cを、RNA抽出するまで。余分な予防措置として、あなたはすべてのニューロンがキャップ自体から削除されていることを保証するためにレーザー捕捉装置でQCの駅でキャップを再確認することができます。

4）特定の神経集団からのRNAの取得：

一つは、孤立してキャプチャから直接移動、または-80 ° Cの冷凍庫に保存されているサンプルを解凍することができます。私たちの実験では、我々は最初の単離をRNAに進​​む前に、-80℃で、必要に応じ、それらを保存されているすべてのサンプル° Cを集めた。

RNAの分離は、LCMサンプルからの細胞の小さな数字を分離すると発現量の低いmRNAを保持するように設計されてPicoPureアイソレーションキットを、使用して実行されます。一般的に、我々は、キットに含まれているプロトコルに従ってください。以下、我々は、プロセスの基本的な説明を与える。

1. 解凍後、カラムのフィルターにRNAを結合するために70％エタノール（キットに付属）とプレコンディショニング精製カラムで遠心分離器を追加。
2. 洗浄後、DNAの干渉のリスクを排除するためにDNAの完全な除去を確実にするためにDNaseでRNAを扱う。このステップでは、リアルタイム定量RT - PCRなどのダウンストリームアプリケーションに特に重要です。
3. DNAダイジェストに続いて、別の洗浄ステップがあります。最終的なサンプル中のバッファのいずれかが存在するが、増幅のための小さい開始RNAにつながるとしては洗浄緩衝液は、別のマイクロ遠心チューブに移す前に列に残っていないことを確認してください。これを確実にするために、我々は、提供するプロトコルで提案されている2.5分の代わりに2分間の最後の洗浄ステップを遠心してください。
4. 最後に、溶出バッファーは、トータルRNAを溶出するために、遠心分離に続いて1分間カラムに添加し、フィルター上でインキュベートされる。
5. 別の0.5ミリリットルチューブの各サンプルのピペット1.3ulはExperion HighSens LabChipを実行する。 -80サンプルの残りを凍結℃に

RNAを単離する場合の品質管理には量が少ない場合は特に、非常に重要であり、このようなマイクロアレイ実験（15μg）のため、必要に応じて金額が、、大きいです。抽出されたRNAは、したがって、プロセス全体を通して様々な時点での品質管理を受ける必要があります。最初の抽出後に発生します。我々は、エレクトロとExperion HighSens LabChipによって生成される仮想ゲルの18S/28Sピークの肉眼的検査により全RNAの完全性を確立する。この方法は迅速であり、RNAの品質のエレクトロと仮想ゲル（図2）を確認するための測定の2つの手段が用意されています。トータルRNAの品質は（図比較的良好である場合。 2A、BとC、D）、我々は、その後直線的にトータルRNAの約2％を占めてmRNAを、増幅に進みます。

5）リニア増幅：

レーザー捕捉組織から抽出したRNAの増幅は、その後のマイクロアレイのハイブリダイゼーションや定量RT - PCR実験のためのRNAの十分な量を生産するために必要です。 T7ベースの線形増幅と述べた潜在的な混乱させる可能性を最小限にするために、我々は、出発レーザー捕捉組織材料の量を最大化によって必要な増幅のラウンド数を最小限に抑える。

我々の予備的データは、（図示せず）約500個の細胞を含む組織から抽出したトータルRNAのリニア増幅（RiboAmp HS ^PLUSキット）の2ラウンドは、aRNAのの約50μg生成するようなことを示唆している-マイクロアレイと定量RT - PCRの両方のパフォーマンスのための十分な実験。可能であれば、サーマルサイクラーとキットに付属の0.5ミリリットルチューブに0.5ミリリットルのブロックを使用して0.2ミリリットルと0.5ミリリットルチューブの間にサンプルの不要な移籍を避ける。

再び、その後にプロトコルがキットに付属するものです。簡略化したものがここで説明されています。

1. トータルRNAサンプル（約11μl）に提供されるプライマー1μlを追加し、65℃インキュベート4℃で冷却続いて5分間、℃で1分間。
2. 42℃のSuperScript III逆転写酵素とインキュベート℃で1時間と一緒に第一鎖cDNAコンポーネントを追加します。
3. 第二鎖cDNA合成後、提供されて精製カラムを介して得られたcDNAを精製する。一度カラムにサンプルを転送した後、最大1μlのサンプルのように転送後に管の両側に残っている - ここでは、倍のサンプルチューブを遠心するために、精製カラムにサンプルを加えた結合バッファーを転送するときにすることをお勧めします。
4. 付属の洗浄バッファーでcDNAを洗浄し、溶出バッファーで精製されたcDNAを溶出させる。
5. in vitro転写のコンポーネントの追加と42で6時間インキュベート℃に
6. DNase処理ステップの後、最終的には溶出バッファーの12μlの合計で、それを溶出する、提供されるバッファと結果aRNAのを清める。

より多くの品質管理の手順が採用された後、 - RNAは（キットプロトコールを参照して、別のプライマーを用いて）線形増幅の別のラウンドを受ける。サンプルの一つULは約StdSens LabChip（Experion）を持つmRNA転写物の長さと濃度を決定するために250ng/ulに希釈される。伝統的なアフィメトリクスマイクロアレイ技術は、mRNAを検出するために長さが少なくとも600ヌクレオチドであることが必要です。 LabChipから得られたゲルと電気泳動図は、したがって、この最小のmRNA転写物の長さ（図3）を描くはず。

追加の品質管理は、2つの光学密度、すなわち、A260とA280で構成される比率は、RNAの純度を決定する光度計分光光度計の分析を介して決定されます。最高2.7まで比は同等のハイブリダイゼーションの品質を有することが示されているものの、2.1前後の光学濃度の検体は、遺伝子発現解析のために標識する必要があります。これより低いが（さらに-80℃以下の温度で）保管中に劣化してRNAにつながっているとも貧しいマイクロアレイの結果につながっているとして、濃度はまた、800ng/μl-1μg/μlの間でなければなりません。

6）アフィメトリクスマイクロアレイ解析用ビオチン標識mRNAのサンプル：

モレキュラーデバイスからTURBOビオチン標識キット（末端標識）を増幅したサンプルから得られたaRNAのラベルを付けるために使用されます。プロトコルの短縮版がここに与えられます。

1. ヌクレアーゼフリー水を添加することにより、または初期濃度に応じて、真空遠心機でサンプルを濃縮することにより13μlの合計に各aRNAのサンプルの20μgの音量を調整します。のみ15μgが使用アフィメトリクスのチップのために必要であるにもかかわらず、いくつかのRNAをインキュベーションし、遠心操作中に失われるので、我々は、最初の反応に20μgを追加します。
2. 4で寒さを85でビオチン反応℃で30分間インキュベートする、と℃の
3. キットに付属する特殊な列で遠心分離を介して過剰ビオチンラベルを剥がします。いくつかのケースでは、特にそのようなFFPE（ホルマリン固定、パラフィン包埋）サンプルから得られるような劣化したmRNAと、そうではすべてのmRNAは、単一の遠心分離のステップで溶出されている場合もあります。私たちは、その後1分のその後の余分な遠心分離のステップの列に1 -5μlの余分なヌクレアーゼフリーの水との間で追加することをお勧めします。これは、標識されたサンプルのほとんどが溶出されることが保証されます。
4. 最終容量は、1μg/μlの濃度で、20μlのです。余分なヌクレアーゼフリー水を添加した場合は、サンプルを濃縮真空遠心分離で正しいボリューム。我々はこれよりも少ないが、貧しいマイクロアレイの結果が得られますストレージおよび/またはハイブリダイゼーション時の劣化につながることを発見したとして、800ng/μl以上ハイブリダイゼーションを開始する前に、ストレージの濃度を維持することをお勧めします。

aRNAをしアフィメトリクスからヒューマンX3PのGeneChipプローブアレイを用いて、ハイブリダイズさせ、遺伝子発現プロファイリングした。このチップは、我々は予防措置としてそれを使用する、より劣化したaRNAのために設計されたとして、私達が制御できないような多くの要因は、死後の組織の品質に影響を与える可能性があります。私たちの研究室は、ハイブリダイゼーションのための適切な施設を持っていなかったとして、プロセスは、パートナーのゲノムの中核施設で行われました。

代表的な結果：

1 +2 +3）組織は、錐体細胞とレーザーキャプチャーマイクロダイセクションの染色、セクショニング：

上記のプロトコルは、スライドごとに4つのセクションを持つ2つのスライドになるはずです。各セクションには、最小限の、引裂き割れと折りたたみでスムーズなはずです。ピラミッド型の形状と目に見える尖頭の樹状突起とサイズで25μmの - 正しい染色で、汚れは約20黒く染まった錐体ニューロンが識別されます。セクション/トータルRNAの少なくとも500pg、結果としてケース当たり700細胞 - ポイカプセルHSのマクロ設定のキャップ、および各セクションのためのレーザパワーと強さの正しい調整を使用すれば、約500入手する必要があります。約85 - ニューロンの100％が上限（図1）に準拠します。

4）特定の神経集団からのRNAの取得：

説明されているように、トータルRNAの分離の後、我々は、Bio - Rad社Experion経由のエレクトロと仮想ゲルを用いてRNAの品質を確認してください。電気泳動では、18Sおよび28SリボソームRNAのユニットに対応する2つの明確なピークが表示されるはずです。組織の要因により前の切片に低下する可能性があるとして、死後の組織で、しかし、これは、必ずしもそうではありません。通常は18S付近に大きなピーク、およびより小さい28Sのピーク（図2A、B）で、劣化を示す大きなバンプが表示されます。限り、電気泳動のプロファイルがサンプル間で比較可能であるため、我々は、RT - PCRとマイクロアレイの研究（Imbeaudら、2005）の両方を実行するための十分な良いmRNAの品質をもたらすためにこのガイドラインを発見した。

あまりにも多くの劣化がある場合 - などの電気泳動図の曲線の下の大きな面積で示さ、またはピークが表示されていない場合（図2C、D） - 細胞は組織から再キャプチャする必要があります。我々はまた、RNAが組織ブロック自体が劣化しているかどうかを判断するために細胞を取り戻す前に、セクションの全体の断片（だけではなく細胞）から抽出される組織こすりテストを、行うことをお勧めします。

5）リニア増幅：

線形増幅2ラウンドの後のmRNAの品質をテストするために、我々は、Bio - Rad社Experion StdSens LabChipと光度計分光光度計の両方を利用していました。伝統的なアフィメトリクスマイクロアレイ技術は、このプロトコルで取得された、mRNAが検出されるためには長さが少なくとも600ヌクレオチドであることが必要です。実際には、mRNAの長さは1000塩基の範囲に検出された。電気泳動図はまた、大きなピークが徐々に時間の関数（図3A、B）のように降順でこれを反映している。

光度計の測定値は、実行可能なmRNAを（表2）を示す、サンプル間で2.5のA260/A280比の平均値を示した。

我々の結果は、このプロトコルを使用して、得られたRNAの質と量の両方がアフィメトリクス人間X3PのGeneChipを介して遺伝子発現の違いを調べるために十分であることを示している。

6）アフィメトリクスマイクロアレイ解析用ビオチン標識mRNAのサンプル：

アフィメトリクス人間X3PのGeneChipにハイブリダイズした後、我々は適切なハイブリダイゼーションおよびプローブの強度を示し、26.6％（表2）の平均のパーセントの呼び出しを実現。

表1：コホートの概要

サンプル	グループ	セックス	年齢	PMI
C1	CONTROL	F	79	15.00
C2	CONTROL	M	22	21.47
C4	CONTROL	M	75	20.25
C5	CONTROL	M	80	15.50
C6	CONTROL	F	58	21.08
C8	CONTROL	M	61	17.00
C10	CONTROL	F	71	20.50
C11	CONTROL	F	90	12.66
C12	CONTROL	F	86	6.92
ミーン		4M/5F	69.11	16.71
S1	SCHIZOPH。	F	93	6.92
S2	SCHIZOPH。	M	55	21.40
S3	SCHIZOPH。	F	67	21.80
S4	SCHIZOPH。	F	55	22.00
S5	SCHIZOPH。	M	36	17.97
S6	SCHIZOPH。	M	62	10.75
S8	SCHIZOPH。	F	92	17.80
S11	SCHIZOPH。	M	56	21.83
S12	SCHIZOPH。	F	88	13.33
ミーン		4M/5F	68.11	16.90

略語：F -女性、M -男性、PMI -死後間隔、schizoph。 -統合失調症。

表2：RNAの濃度、品質とハイブリダイゼーション効率を描いた結果のまとめ

サンプル	[発現] NG / UL	A260/A280	プローブ強度	パーセントコール
C1	1318.01	2.67	63	19.5
C2	2312.93	2.37	147	30.6
C4	1811.92	2.44	69	26.6
C5	1316.26	2.51	78	34.7
C6	1663.24	2.39	66	33.8
C8	633.05	2.54	101	15.2
C10	1326.4	2.47	92	32.5
C11	994.24	2.75	76	22.4
C12	817.23	2.7	56	15.2
S1	2560.88	2.47	78	25.0
S2	2169.61	2.43	76	26.5
S3	2067.32	2.52	87	22.1
S4	1563.89	2.75	82	28.1
S5	2071.44	2.44	88	28.2
S6	2532.59	2.34	72	30.7
S8	2189.22	2.5	62	31.8
S11	1669.89	2.47	41	27.3
S12	1739.35	2.47	42	28.0
ミーン	1708.75	2.51	76.44	26.57

図1：レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのプロセスの概要 ）錐体細胞は、形態学的に識別されます。レーザーは、熱可塑性フィルムを用いたパルスした後B）、細胞がキャップに付着し、背後にある周囲の組織を残して、スライド上従って、もはやありません。 C）均一な細胞集団の顕微鏡写真は、レーザーをキャプチャした後にポイカプセルキャップに付着。

図2：トータルRNAの品質管理 + B）はC + Dしながら、分離後の良い品質のトータルRNAを表します）全RNAの単離後のように見てはいけないかを示しています。 （B）における仮想ゲルに対応する明確な18/28Sピークを持つA）電気泳動図。 C）の曲線の下の大きな領域とRNAの分解を示す無18S/28Sピークを示す電気泳動図は。これはまた、仮想ゲル（D）に示されています。

図3：mRNAの品質管理 + B）エレクトロ（）とmRNA転写嶺を示す仮想ゲル（B）。すなわち過去の600ヌクレオチド（nt）を拡張するマイクロアレイ研究に必要な目（ス​​プレッド）、。 C + D）エレクトロ（C）とmRNA転写の長さが過去の200ntを拡張しないように不十分なmRNAのスプレッドは、どのように見えるかを示す仮想ゲル（D）。

ディスカッション

ここで、我々は、アルクトゥルスXTシステムと関連するRNA抽出キットを使用して異種の死後の脳組織から均質な細胞集団を抽出するためのプロトコルをカスタマイズしよう。上述のように、我々は、RNAの完全性を最大化するために、同社が提供するオリジナルプロトコルにいくつかの変更を行っている。単一細胞の正常なキャプチャリングは、単に良いRNAとの最大のセルを実現するために、キャプチャする前に手順を最適化に依存する。これらの手順は、組織の切片や染色に関連するさまざまなパラメータが含まれています。一言で言えば、組織の準備に関して、これらが含まれます：1）、2の切削時に温度勾配を減少）のみ4、氷の上のすべての脱水の手順を実行して、スライドごとに2セクション、3）を配置すること）の増加）染色、5のRNase阻害剤を追加する3分に最後の100％エタノールで脱水期間。

キャプチャに関しては、我々はポイカプセルHSキャップの組み合わせと感じ、マクロの設定上のソフトウェアで、最適な結果を確認する必要があります。高湿度が大幅に組織"リフト"を減少させるように湿度制御環境は、単一細胞を捕捉するために重要です。高温はまた、RNAの品質に悪影響を与えることができる。

PicoPureキットでRNA分離プロトコール中に、2つの洗浄ステップがあります。すべての洗浄バッファーが最終的なサンプル中のバッファのいずれかが存在するが、増幅のための小さい開始RNAにつながるとして、RNA溶出のための別のマイクロ遠心チューブに移す前に削除されていることを確認することが重要です。これを確実にするために、我々は、提供するプロトコルで提案されている2.5分の代わりに2分間の最後の洗浄ステップを遠心してください。

ほとんどの部分については、リニア増幅プロトコールは、製造元の指示に従ってでした。このプロトコルを使用するただし、次の2つの重要な点を考慮する必要があります：1）サーマルサイクラーで0.5ミリリットルのブロックと組み合わせて提供される唯一の0.5ミリリットルチューブを使用することにより、チューブ間のサンプルの過剰移籍を経由してRNAの損失を制限しようとする、および2）cDNAの精製のための精製カラムにサンプルを転送するとき、最初の転送の後にサンプルチューブをスピンダウンしてください。これは、精製カラムに追加するため、cDNAの回収を増加させることができるサンプルの追加1 - 2ulになります。

あなたの限られたaRNAのサンプルのビオチン標識用ターボ末端標識キットを利用する場合、我々は余分な数μlを添加すると収率は、列から抽出された標識RNAを高めるために、遠心分離のステップの前に水から出ているとのこと。遠心分離の余分な分はあなたがそのようなFFPE組織などの劣化した組織、と作業している場合は特に、この点で役立ちます。

我々は、このプロトコルは、異種の死後の脳組織内で、ユーザーがそのような単一の細胞集団としての小さな均質構造を、単離するために有効になると確信しています。これは、調査中の特定の細胞タイプをターゲットに結果につながる、脳内の様々な層に位置し、周囲の構造および他の細胞タイプの希釈効果を、減らすことができます。得られたRNAの質は、マイクロアレイ研究には十分なので、我々は、病気の状態に影響を受ける特定の細胞集団の特定の分子の署名を特定するために始めることができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4.5” Forceps	VWR international	82027-392
Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System	MDS Analytical Technologies	13821-00
CapSure™ HS LCM Caps	MDS Analytical Technologies	LCM 0214
CapSure® Macro LCM Caps	MDS Analytical Technologies	LCM 0211
Experion™ Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad	700-7001
Experion™ RNA HighSens Chips	Bio-Rad	700-7155	10 chips
Experion™ RNA HighSens Reagents	Bio-Rad	700-7156	10 chips
Experion™ RNA StdSens Chips	Bio-Rad	700-7153	10 chips
Experion™ RNA StdSens Reagents	Bio-Rad	700-7154	10 chips
Falcon® polypropylene Conical tube	BD Biosciences	352070
GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap	Applied Biosystems	N8010611
GeneChip® Human X3P array	Affymetrix	900516	6 chips
Histogene® LCM Frozen Section Staining kit	MDS Analytical Technologies	KIT0401	For staining solution, jars, ethanols and Xylene
Histogene™ LCM slides	MDS Analytical Technologies	12231-00
Micro Slide Box	VWR international	48444-004
Microm HM 505E cryostat	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22-050-350	Catalogue number for similar product as current product no longer available
Microprocessor Controlled 280 series Water bath	Thermo Fisher Scientific, Inc.	51221048	Model 282
Molecular Sieve	EMD Millipore	MX1583L-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	n/a	The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.
Nuclease-free water	Ambion	AM9932
PEN Membrane glass slides	MDS Analytical Technologies	LCM 0522
PicoPure® RNA Isolation kit	MDS Analytical Technologies	KIT0204
RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling	MDS Analytical Technologies	KIT0511B	12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit
RNase Zap®	Ambion	AM9780/2
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNasin® Plus	Promega Corp.	N261B
SuperScript™ III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080-044