هندسة الخلايا المنفذة للبروتين

Summary

تنبيغ البروتين يمكن التسليم المباشر للبروتينات نشطة بيولوجيا في الخلايا. على النقيض من الأساليب التقليدية مثل الحمض النووي أو تنبيغ ترنسفكأيشن الفيروسي هذا النموذج غير الغازية يسمح التلاعب الخلوية كفاءة عالية بطريقة المعايرة التحايل السمية الخلوية ومخاطر التحول من خلال التعديل الوراثي أنكجنيك دائمة.

Abstract

تقنية تنبيغ البروتين يمكن التسليم المباشر للمواد نشطة بيولوجيا في خلايا الثدييات [انظر لاستعراض ^1،2]. لهذا يمكن للمرء أن الاستفادة من القدرة translocating من الببتيدات الخلية يسمى اختراق (CPPS) ، كما عينت المجالات تنبيغ البروتين (PTDs). وتات لحزب الشعب الكمبودي المستمدة من نوع فيروس نقص المناعة البشرية 1 (HIV - 1) تم تات (العابرة للمنشط من النسخ) بروتين يستخدم على نطاق واسع. وتات المشحونة إيجابيا يعزز نفاذية الخلية وبالتالي التغلب على الحواجز في الغشاء الخلوي عن طريق الإلتقام و / أو اختراق الغشاء مباشرة ^2. بالاشتراك مع اشارة توطين النووي (NLS) البروتينات الانصهار قادرون على دخول وظائف النواة العارضة. فيديو يوضح العرض الذي قدمناه ، باعتبارها التمثيل للهندسة الخلية المنفذة للبروتينات ، والبناء ، والإنتاج وتطبيق صيغة خلية قابلة للاختراق من لجنة المساواة العرقية الانزيم تعديل الحمض النووي.

لجنة المساواة العرقية هو recombinase مواقع محددة قادرة على الاعتراف وإعادة تجميع 34 موقعا loxP قاعدة الزوج في خلايا الثدييات في المختبر والمجراة. ولذلك يستخدم على نطاق واسع في نظام لجنة المساواة العرقية / loxP مشروط للحث على طفرات في الجينوم للخلايا الحية ^3،4. تسليم لجنة المساواة العرقية recombinase نشطة للخلايا ، ومع ذلك ، يمثل القيد.

نحن تصف نظام النواقل pSESAME ، الذي يسمح للالإدراج المباشر من الجينات من الفائدة ويوفر منبرا لاستنساخ بسرعة مختلف المجالات والعلامات المستخدمة داخل ناقلات بطريقة مريحة وموحدة. إعادة ترتيب من علامات مختلفة وقد تبين لتعديل خصائص البيوكيميائية من البروتينات الانصهار توفير إمكانية تحقيق عائدات أعلى وأفضل للذوبان. نحن لشرح كيفية التعبير عن المؤتلف وتنقية الخلايا والبروتينات في نفيذ من كولاي. التحقق من صحة أخيرا وظيفة البروتين المؤتلف لجنة المساواة العرقية في ثقافة الخلية من خلال تقييم نشاطها recombinase داخل الخلايا.

Protocol

بناء ناقلات التعبير والتعبير :

تم بناء ناقلات pSESAME التعبير ، لجنة المساواة العرقية عن طريق إدراج جزء لجنة المساواة العرقية في ترميز pSESAME عبر مواقع تقييد AvrII NheI والاستنساخ باستخدام أساليب القياسية. pSESAME بترميز البروتين يتكون من الانصهار بصمة الحامض الاميني ، ، تات المجال ، وتسلسل NLS لجنة المساواة العرقية ، يختصر HTNCre. للتعبير عن HTNCre تحولت إلى لجنة المساواة العرقية pSESAME - TUNER (DE3) pLacI واستخدامها لتحضير الأوراق المالية الجلسرين.

1. تم تلقيح أكثر من ثقافة ليلة باستخدام طرف الماصة المغلفة مع البكتيريا تحول من المخزون الجلسرين. الثقافة خلال ليلة وتألفت من وسائل الإعلام LB تستكمل مع الجلوكوز 0.5 ٪ [V / V] وكربنيسيلين بتركيز نهائي من 50 ميكروغرام / مل وسمح لتنمو بمعدل 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
2. وقد استخدم في اليوم التالي نمت بكثافة خلال الليل لتطعيم الثقافة ثقافة التعبير في نسبة 1 إلى 40 وكان وضع في حاضنة على 37 درجة مئوية. وتألفت ثقافة التعبير عن وسائل الاعلام السل تستكمل مع الجلوكوز 0.5 ٪ [V / V] والأمبيسيلين بتركيز نهائي من 100 ميكروغرام / مل.
3. في جامعة النجاح OD ₅₉₅ من 1،5 كان بفعل ثقافة التعبير مع IPTG 0.5 مم لمدة 1 ساعة.
4. بعد ذلك تم جمع البكتيريا بواسطة الطرد المركزي في 5000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في الدوار SLA3000.
5. كانت مخزنة في البكتيريا الكريات ناقص 20 درجة مئوية حتى تنقية.

تنقية الخلية المنفذة للبروتين :

1. وكان معلق المجمدة البكتيريا الكريات العازلة في 10 مل لكل ثقافة تحلل قارورة لتر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. ثم كان التعليق المحتضنة مع الليزوزيم ملغ / مل 1 ل 15 دقيقة اضافية في حين خلط في درجة حرارة الغرفة.
3. وكان 25 U / benzonase مل وأضاف بعد ذلك وبينما خلط المحتضنة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد sonification على الجليد لمدة 1.5 دقيقة مع نبضات ق 0.5 في 45 ٪ من الطاقة ، 1 مل الباردة العازلة الملح الطرطريك (TSB) لكل مل تمت اضافة تعليق بعناية في حين خلط والمحتضنة لمدة 5 دقائق على الجليد. لقد التقطت SDS - PAGE عينة من جزء lysate (L).
5. تم الحصول على مسح lysate بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 30000 ز وقد أخذت عينات SDS - PAGE الكسور للذوبان (S) ، وغير قابلة للذوبان (I).
6. وكان نقل الى طاف الطازجة 50 مل وأنابيب الصقر درجة مئوية مع 2 مل من 50 ٪ ني NTA الطين للتر الواحد من ثقافة التعبير الأولي. آنذاك مختلطة بلطف لمدة 1 ساعة بمعدل 4
7. كانت معبأة في عمود التعليق تدفق EconoPac الجاذبية (SDS - PAGE عينة من التدفق من خلال اتخاذ كان الكسر (FT)) وغسلها مرتين مع 5 مجلدات سريرا للغسيل العازلة. وقد تم جمع عينات SDS - PAGE كل من الكسور الغسيل (W1 و W2).
8. وeluted HTNCre المحتوية على الكسور مع وحدات التخزين الفراش 3 من شطف العازلة وعينة من جزء شطافة (E) لSDS - PAGE تحليل أجري.
9. تمت إزالة إيميدازول بواسطة الكسر dialyzing شطف ضد العازلة عالية من الملح مرتين.
10. وتركز كذلك على حل البروتين dialyzing عازلة ضد الجلسرين مرتين. غسيل الكلى في جميع الخطوات كانت نسبة عازلة لعينة لا يقل عن 50. هذا الإجراء أدى إلى حل الجلسرين الأسهم HTNCre تحتوي على تركيز المعتادة بين 200 و 450 ميكرومتر ، فإن أي 1 لتر من ثقافة التعبير النتيجة في 12 ~ ملغ من البروتين. وجمعت عينة من الأسهم الجلسرين (ع) لSDS - PAGE التحليل. ويمكن تخزين HTNCre حل السهم عند ناقص 20 درجة مئوية.

الشكل 1 : SDS - PAGE تحليل العينات التي تم جمعها خلال عملية تنقية recombinase لجنة المساواة العرقية. يشار إلى تحريض من قبل لجنة المساواة العرقية التعبير الفرقة المهيمنة في جزء lysate. على الرغم من أن جزءا من البروتين تكون غير قابلة للذوبان في بروتين لجنة المساواة العرقية إثراء كما رأينا في شطافة وكسور الأسهم الجلسرين. L : Lysate ، الأول : غير القابلة للذوبان ، S : الطافي (Supernatant) ، FT : تدفق من خلال ، W : الغسل ، E : شطافة ، ع : Gylcerol الأسهم. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

تنبيغ البروتين في الفئران الخلايا الجنينية (ES) الجذعية :

1. وكانت المصنفة خلايا ES يحمل الشرطي β - ⁵ غالاكتوزيداز مراسل بناء الخلايا واحد باستخدام TrypLE ™ Express لتفكك خلايا ملتصقة. بعد 4 الى 6 ساعات وكان الخلايا إعادة المرفقة وأزيل المتوسط.
2. في وقت لاحق وحضنت وفاق مع HTNCre الخلايا التي تحتوي على المتوسط ​​لمدة 16 ساعة.
   • وكان المخفف مبلغ مناسب من البروتين HTNCre (الموافق 10 ميكرومتر) للخروج من الأسهم المتوسطة وفاق في الجلسرين ومرشح العقيمة في وقت لاحق (0.22 ميكرون).
3. بعد تغيير البروتين المتوسطة تنبيغ العودة الى متوسطة النمو الطبيعي.
4. بعد أن غمرت المياه يومين الخلايا مع برنامج تلفزيوني وثابتة لامتصاص العرق مع 4 ٪ (PFA) لمدة 10 دقيقة.
5. اثنين عديأعدم tional خطوات الغسيل مع برنامج تلفزيوني أجري قبل X - غال تلطيخ.
6. وتمت تغطية الخلايا الثابتة مع طبقة من حل تلطيخ X - ⁶ غال وحضنت في أكثر من ليلة 37 درجة مئوية.

ممثل النتائج :

وكان الحل المنشود اليوم التالي تلطيخ X - غال وكانت مغطاة بطبقة خلايا من برنامج تلفزيوني للتحليل المجهري. ويمكن ملاحظة 8-10 ٪ من خلايا معاد داخل خلايا الفئران الحكم عليها من خلال وفاق β - غالاكتوزيداز النشاط.

Discussion

أثناء عملية تنقية البروتين الانصهار لجنة المساواة العرقية من المهم عدم تجاهل إضافة العازلة TBS الجليد الباردة قبل الطرد المركزي. خلاف لجنة المساواة العرقية recombinase يميل إلى ترسيب داخل المنطقة العازلة الجلسرين.

وينبغي إذا الكسر شطافة يبدو أن تصبح تضاف عكر نظرا لتركيز عال من البروتين العازلة الانصهار شطف إضافية حتى هذا الحل قد مسح مرة أخرى.

الطلب من 10 ميكرومتر من البروتين الانصهار لجنة المساواة العرقية النتائج عادة في كفاءة تأشب من 80 إلى 100 ٪. الجنين مصل العجل (FCS) كونه عنصرا رئيسيا من عناصر الخلية المتوسطة ES بقوة تنبيغ يثبط البروتين. وكان تركيز عال من ذلك recombinase لجنة المساواة العرقية لاستخدامه. عند العمل في ظروف خالية من المصل أقل من البروتين (0.5 -- 2 ميكرومتر) يمكن استخدامها لتحقيق الكفاءة تأشب مماثلة.

مع نظام ناقل pSESAME في متناول اليد ويمكن للمرء أن يطبق تقنية تنبيغ البروتين لبروتينات أخرى بما في ذلك عوامل مثل النسخ وOct4 Sox2 ⁷ و ⁸ Scl/Tal1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TUNER (DE3) pLacI	Novagen, EMD Millipore	70625
Glycerol	Carl Roth GmbH	3783.2
Na2HPO4	Carl Roth Gmbh	T876.1
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
HCl	Carl Roth Gmbh	4625.1
Imidazol	Carl Roth Gmbh	X998.4
NaCl	Carl Roth Gmbh	9265.2
Yeast Extract	Carl Roth Gmbh	2363.4
Trypton/Pepton	Carl Roth Gmbh	8952.4
K2HPO4	Carl Roth Gmbh	P749.2
KH2PO4	Carl Roth Gmbh	3904.1
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Carbenicillin	Sigma-Aldrich	6344.2
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Lysozyme	Sigma-Aldrich	62971
Benzonase	Novagen, EMD Millipore
L-Tartaric acid, disodium salt	Sigma-Aldrich
50% Ni-NTA slurry	Invitrogen	R901-15
EconoPac columns	Bio-Rad	732-1010
Sterile filter 0,22μm	Whatman, GE Healthcare
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich
LB medium			Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl
TB medium			Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4
Lysis Buffer			50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartaric Salt Buffer (TSB)			PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol
Washing Buffer			PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol
Elution Buffer			PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol
High Salt Buffer			600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Buffer			50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express	Invitrogen
ESGRO (LIF)	EMD Millipore
NEAA	GIBCO, by Life Technologies	11140035
L-Glutamin	GIBCO, by Life Technologies	25030024
β-Mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	31350010
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11960044
PBS	GIBCO, by Life Technologies
Fetal Calf Serum (FCS)	PAA Laboratories
X-Gal staining solution:			4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS
K3(FeIII(CN)6)	Sigma-Aldrich	P-3367
K4 (FeII(CN)6)	Sigma-Aldrich	P-9387
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
X-Gal	Sigma-Aldrich	B4252