نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em

Summary

رسم الخرائط الجينية مصير محرض (GIFM) علامات المسارات والخلايا مع غرامة السيطرة المكانية والزمانية في الجسم الحي ويوضح كيفية الخلايا من سلالة وراثية محددة تسهم في تطوير وأنسجة البالغين. أظهرت هنا هي التقنيات المطلوبة لتعيين مصير أجنة الفئران E12.5 للتحليل وepifluorescent ازدراع.

Abstract

يتم إنشاؤها بواسطة خرائط مصير وسم وتعقب الخلايا في الجسم الحي لتحديد كيفية المساهمة في الأسلاف هياكل محددة وأنواع الخلايا والأنسجة في تطوير الكبار. تقدم في هذا المفهوم هو G enetic أنا أكلت nducible F M apping (GIFM) الذي يربط بين التعبير الجيني ، مصير الخلية ، والسلوكيات خلية في الجسم الحي ، لإنشاء الخرائط على أساس النسب مصير الجينية.

GIFM يستغل X - CreER خطوط حيث X هو جين أو مجموعة من العناصر التنظيمية التي تمنح الجينات التعبير المكاني للبروتين البكتيريا المحورة ، لجنة المساواة العرقية recombinase (CreER ^T). CreER ^T يحتوي على تعديل ه strogen يجند eceptor ص المجال الملزمة التي تجعل CreER ^T المحتبسة في السيتوبلازم في غياب تاموكسيفين المخدرات. الربط من CreER تاموكسيفين ^T النشرات التي translocates إلى النواة وإعادة التركيب يتوسط بين تسلسل الحمض النووي محاط مواقع loxP. في GIFM ، تأشب يحدث عادة بين loxP يحيط إيقاف الكاسيت السابقة جين مراسل مثل GFP.

هي ولدت الفئران لاحتواء أي منطقة أو خلية نوع محدد CreER وأليل مراسل الشرطي. سوف الفئران غير المعالجة لا نملك بمناسبة لأن الكاسيت في إيقاف مراسل يمنع النسخ مزيد من الجين المراسل. ندير تاموكسيفين بالتزقيم عن طريق الفم لتوقيت الحامل الإناث ، التي تنص على مراقبة الزمنية للإفراج ^T CreER وإزفاء اللاحقة إلى نواة إزالة كاسيت من إيقاف الصحفي. بعد إعادة التركيب ، وأليل المراسل هو constitutively وأعرب عن heritably. هذه السلسلة من الأحداث علامات مثل هذه الخلايا التي يتم تسجيلها لا يمحى تاريخهم الجينية. مراسل معاد يخدم بالتالي بمثابة التتبع الإخلاص النسب العالية التي الجينية ، مرة واحدة ، يتم uncoupled من التعبير الجيني يستخدم في البداية لحملة CreER ^تي.

نحن نطبق GIFM في الماوس لدراسة التطور الطبيعي والتأكد من مساهمة الأنساب الجينية لأنواع الخلايا والأنسجة الكبار. ونحن أيضا استخدام GIFM لمتابعة الخلايا على الخلفيات الوراثية الطافرة من أجل فهم أفضل الظواهر المعقدة التي تحاكي السمات البارزة من الاضطرابات الجينية البشرية.

هذه المقالة الفيديو دلائل الباحثين من خلال الطرق التجريبية لتطبيق بنجاح GIFM. نحن لشرح طريقة استخدام لدينا تتميز كذلك Wnt1 - ^T CreER ؛ الفئران التي mGFP بالإدارة تاموكسيفين في اليوم الجنينية (E) 8.5 خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم تليها في تشريح وتحليل من قبل E12.5 stereomicroscopy epifluorescence. نظهر أيضا كيفية الدقيقة تشريح مصير المجالات المعينة لإعداد يزدرع أو تحليل وتشريح FACS الكبار مصير المعنونة لتصوير أدمغة جبل بأكمله الفلورسنت. مجتمعة ، هذه الإجراءات تسمح للباحثين لمعالجة المسائل الحرجة في البيولوجيا التطورية ونماذج المرض.

Protocol

تاموكسيفين إعداد وإجراء بالتزقيم الفم (E8.5)

• إعداد محلول المخزون 20 ملغ / مل من تاموكسيفين تاموكسيفين عن طريق إذابة في زيت الذرة قبل تحسنت.
• احتضان الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على nutator ودوامة بشكل متقطع.
• حماية المخزون من مخزن تاموكسيفين ، الضوء على 4 درجات مئوية ، واستخدام لمدة تصل الى شهر واحد.
• لتعيين مصير التجارب ، وإقامة الزوج تربية تتألف من الاناث وبستر السويسرية (wildtype ؛ شراؤها من Taconic) والذكور على حد سواء يحمل جين معين الأليل ^T CreER مراسل وأليل. لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن به Wnt1 - ^T CreER ؛ mGFP الذكور (Ellisor 2009).
• التحقق من الإناث وبستر السويسرية صباح كل يوم لظهور أحد المكونات المهبلية. يسمي الصباح (0900) من يوم ينظر إلى المكونات المهبل إلى 0.5 أيام بعد الجماع وحساب تاريخ تاموكسيفين الادارة القائمة على هذا نقطة انطلاق. (للحصول على هذه التجربة ، كانت تستخدم اليوم الجنينية 8.5).
• استخدام حقنة 1 مل مع إبرة تغذية الحيوان (20G X 1-1/2) لوضع 200 ميكرولتر من محلول المخزون تاموكسيفين (4 ملغ تاموكسيفين).
• كبح بشدة وقت الإناث الحوامل وبستر السويسرية استيعاب مؤخر العنق والظهر لشل حركة الرأس وذلك بتسليم الجانب البطني يكون مواجها لها.
• عقد الذيل بين الأصابع الحرة لابقاء الجسم في خط مستقيم.
• مكان الإبرة التغذية في زاوية الفم وتوجيه الإبرة بلطف على طول سقف الفم.
• تدوير الإبرة بحيث تكون موازية للهيئة ، في حين تميل في الوقت نفسه رئيس الخلف للحفاظ على العنق على التوالي.
• دليل الإبرة أسفل المريء ، نحو المعدة. يجب الحرص على عدم دخول القصبة الهوائية. إذا كان هناك مقاومة على الإبرة ، يشارك الحيوان منعكس هفوة ، أو إذا كان الماوس الصراعات ، على الفور بإزالة الإبرة وحاول مرة أخرى بالتزقيم.
• الإبرة مرة واحدة التغذية في المعدة ، وإدارة تاموكسيفين الى المعدة وعودة المرأة إلى قفص منزلها حتى تاريخ تشريح.

حج القحف :

• يروي Intracardially مصير أخلاقي معين الفأر مع PFA 4 ٪ وإزالة الرأس مع مقص من خلال قطع في العمود الفقري فقط فوق الكتفين.
• تشغيل مشرط على طول خط الوسط الظهرية من الرأس (منقاري لعجزي) الى قطع طريق فروة الرأس وفضح سكل.
• باستخدام مشرط ، بعيدا كشط الزائد أو أي نوع من الأنسجة العضلية لوعلى طول الجانب الخلفي من الجمجمة.
• مع ثقب ، ملقط الجمجمة في خط الوسط منقاري عادل لبصيلات الشم وخلق ثقب صغير لاستيعاب نصائح من مقص الغرامة.
• تضاف الى غرامة مقص هذا الثقب وإجراء شق الإنسي إلى الوحشي طول ما يقرب من بصيلات الشم. وهذا الخفض كسر الجمجمة عند تقاطع عظم الأنف والعظم الجبهي وتوفير إمكانية الوصول جيدة للمقص.
• قطع على طول الغرز السهمي في الجمجمة (خط الوسط الظهرية) مع التأكد من الحفاظ على نصائح مقص الزاوية بعيدا عن الدماغ لتجنب إتلاف الأنسجة الكامنة وراءها.
• فهم بلطف الجمجمة مع ملقط وقشر بعيدا العظم على طول شق الإنسية لفضح الدماغ. قد الجمجمة رقاقة على شكل قطع صغيرة أو الانفصال في جو من المقاطع. الاستمرار في استخدام الملقط لإزالة كافة العظام ، الجبهي الجداري ، بين الجداري والقذالي.
• كسر العظام والتغليف paraflocculi (الواقعة على طول الحواف الجانبية من الدماغ على مستوى المخيخ) بواسطة معسر عظام كروية على كل جانب. برفق بعيدا عن العظام.
• بدوره رئيس رأسا على عقب (الجانب الظهري أسفل) واستخدام ملقط لقطع الأعصاب القحفية والافراج عن الدماغ من الجمجمة.

جبل بأكمله الميكروسكوب : الدماغ الكبار

• تقييم المخ لتعليم الكبار GFP باستخدام نطاق الفلورسنت تشريح.
• نقل الدماغ على طبق بتري تحتوي على صورة باستخدام برنامج تلفزيوني وPictureFrame أو برامج أخرى ملائمة.

جبل بأكمله الميكروسكوب : E12.5 الأجنة

• تقييم الأجنة جبل بأكمله لوسم GFP باستخدام نطاق الفلورسنت تشريح.
• نقل تلك GFP الإيجابية التي جبل بأكمله إلى طبق بتري تحتوي على صورة باستخدام برنامج تلفزيوني وPictureFrame أو برامج أخرى ملائمة.
• استخدام ملقط لقرصة قبالة قطعة صغيرة من الذيل من كل الأجنة ، ومكان كل قطعة في أنبوب PCR والنسيج الوراثي باستخدام PCR (Ellisor 2009) على حد سواء لتأكيد النتائج الأليلات المشاهدة عبر تحليل جبل بأكمله.

الجزئي تشريح وإعداد يزدرع من الدماغ المتوسط ​​بطني من E12.5 الأجنة

• تشريح التالية من سلسلة الرحم و identification مصير المعنونة الأجنة التي يشن مضان كله ، لنقل الأجنة في برنامج تلفزيوني العقيمة الجليد الباردة في خلية طبق الثقافة.
• باستخدام مقص غرامة ، وإزالة جزء من رأس الجنين القطع بالعرض ، لعجزي قسيم معيني 1.
• المقبل ، وإزالة جزء منقاري من الرأس مع خفض الاكليلية من خلال الدماغ البيني. هذا وسوف يعرض بنية أنبوب يشبه فيه البطين 4 من خلال النموذج حويصلة الدماغ المتوسط ​​ممرا بين الأنسجة الظهرية والبطنية.
• إدراج بعناية نصائح مقصية في البطين 4 ، وعلى طول خط الوسط قص ظهري ، لعجزي منقاري ، وفتح أنبوب تماما ، وخلق "الكتاب المفتوح" التحضير. والآن يتعرض الدماغ المتوسط ​​بطني إعلامي ، في حين أن نصفي الدماغ المتوسط ​​الظهرية من سيقيم أفقيا.
• إزالة أي المتبقية غير الأنسجة العصبية تحت بطني الدماغ المتوسط ​​من أجل النسيج لوضع أكثر صراحة. إذا لزم الأمر ، وجعل الشقوق في الجوانب منقاري والذيلية بحيث الظهرية "أجنحة" للازدراع سيضع شقة كذلك. ينبغي أن يزدرع الآن تشبه الفراشة "، الذي يمثل الدماغ المتوسط ​​الظهرية الأجنحة ، وقسيم معيني (1) والذيل.
• لمزيد من عزل الدماغ المتوسط ​​البطني للتحليل FACS أو تجارب زراعة الخلايا ، وإزالة الوحشي (الجوانب الظهرية) من الأنسجة.

ممثل النتائج :

في هذه التجربة GIFM ، Wnt1 - معربا عن الخلايا بشكل دائم وملحوظ خلال مرحلة التطور الجنيني heritably بواسطة بالإدارة تاموكسيفين في E8.5 لCreERT - Wnt1 ؛ mGFP الأجنة. في وقت لاحق ، وهذه الخلايا هي تصور عن طريق وضع علامة جبل مضان كله والمناعية المقطع لتحديد كيفية Wnt1 المستمدة من الخلايا العصبية تساهم في الهياكل عبر التنمية. مضان كله جبل تعتمد على عنصر GFP غشاء ملزمة لمراسل mGFP وبالتالي يوفر المعلومات الخلوية وكذلك من وجهة نظر شاملة Wnt1 المستمدة من الإسقاطات العصبية. على سبيل المثال ، مع تاموكسيفين الإدارة في الأجنة Wnt1 - E8.5 CreERTmGFP ، في معرض E12.5 مضان GFP في المقام الأول في الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر الخلفي والحبل الشوكي (الشكل 1A). في التكبير عالية ، وتعتبر التوقعات العصبية في الدماغ المتوسط ​​غرامة التعصيب ، جدار الجسم والأطراف ، والمنطقة القحفي. في هذه المرحلة التنموية والجنين غير شفافة والداخلية وضع العلامات GFP هو تمييزها بسهولة. لكن ، وكما تطور الدماغ ، وكثافة الأنسجة الناضجة يحجب GFP مضان المنبثقة عن هياكل الدماغ الداخلية. لذلك ، مع ادارة تاموكسيفين في E8.5 ، يلاحظ وجود العلامات فقط GFP طفيفة في أكيمات متفوقة من الكبار بحلول مضان جبل بأكمله (الشكل 1C ، أقحم). بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر بعض التوقعات محواري التعقيب على طول السطح البطني من الدماغ المؤخر (لا يظهر). في المقابل ، عندما يدار تاموكسيفين في E9.5 ، وسم GFP كبيرة تحدث في جميع أنحاء أكيمات السفلي بأكمله (1B الشكل ، الشكل). وهذا قد يزيد في مضان كله تشير إلى أن جبل Wnt1 ، معربا عن الخلايا في E9.5 تساهم بشكل كبير في مزيد من المناطق السطحية من المخ الأوسط الظهرية أو تقديم المزيد من العمليات داخل هذه المنطقة من التعبير عن الخلايا Wnt1 من E8.5. بغض النظر ، فإن هذا الاختلاف في جبل مضان كله يعكس الطبيعة الديناميكية لWnt1 التعبير خلال تطوير ويوضح كيف يمكن أن تستخدم لمتابعة GIFM السكان خلية متميزة من الجنين في الناضج.

مع أقسام المناعية مصير والأنسجة المعينة من Wnt1 - CreERT ؛ يتم تحليل الحيوانات mGFP على المستوى الخلوي. وتستخدم الأجسام المضادة ضد GFP وβ - غالاكتوزيداز (β - غال) بالاشتراك مع مجموعة متنوعة من المؤشرات الحيوية أنسجة محددة لتحديد حجم مساهمة غرامة الخلوية من سلالة Wnt1 الهياكل العصبية وأنواع الخلايا. تاموكسيفين مع الإدارة في E8.5 وتحليل الأنسجة في E12.5 ، وخلايا ايجابية مزدوجة (GFP + و + β - غال) ويلاحظ في جميع أنحاء الدماغ المتوسط ​​والدماغ المؤخر مع التوقعات التي تجوب في بطني الدماغ المتوسط ​​(الشكل 1B). في الدماغ الكبار ، وWnt1 - ملحوظا في نسب E8.5 يثير العديد من الهياكل الدماغ المتوسط ​​بما في ذلك أكيمات الأعلى والأدنى ، وكذلك على مقربة من السكان خلية الدوبامين في المنطقة الجوفية السقيفية substantia وأسود (الشكل 1D) (انظر Zervas أيضا 2004). في المقابل ، Wnt1 - ملحوظا في نسب E9.5 يثير أكيمات السفلية وكذلك الخلايا العصبية في المناطق القريبة من السكان خلية الدوبامين (الشكل 1F).

الشكل 1 نتائج ممثل عن مصير Wnt1 - تعيين :

أمثلة على جبل لكامل والنتائج كيمياء سيتولوجية مناعية في Wnt1 - CreERT ؛ mGFP الأجنة والبالغين أدمغة مصير معين (علامة) في E8.5 (AD)وE9.5 (EF). ألف Wnt 1 - CreER ؛ mGFP الأجنة في المعرض E12.5 مضان GFP في المقام الأول في الدماغ المتوسط ​​(MB) ، الدماغ المؤخر الخلفي (الهيموغلوبين) والحبل الشوكي (SP). تصور باء الخلايا المحددة وتحليلها على المستوى الخلوي بواسطة المناعية كما هو مبين في هذا القسم 1 ميكرون سميكة البصرية (الهدف 40X ، ض سلسلة الاستحواذ). β - غالاكتوزيداز النووية (nβ غال) وسم الأضداد (الحمراء) ، ووضع العلامات GFP الأضداد (الأخضر) يدل على مصير المعنونة خلايا الدماغ المتوسط ​​هو موضح في بطني. هنا ، خلايا معاد ايجابية مزدوجة (nβ غال + / + GFP) بسبب طبيعة مراسل mGFP الشرطي. جيم الجامعة يشن المجهري يكشف تنوير خافت مضان GFP في أكيمات متفوقة (SC) من البالغين (الشكل). تقييم نسب Wnt1 ملحوظا في E8.5 على أبواب الكبار مع التكبير المنخفض (5X) المجهري يكشف عن أن نسب Wnt1 يثير الدماغ المتوسط ​​بما في ذلك الهياكل العلوية (SC) والسفلية (IC) أكيمات (C). D. A 40X ، الفرع 1 مم الضوئية المأخوذة من الدماغ المتوسط ​​البطنية في محيط الخلايا العصبية الدوبامين مع خلايا + nβ غال وGFP الغنية + محواري الضفيرة. E. علامات على النتائج في وضع العلامات E9.5 GFP الكبير الذي لوحظ بسهولة في أكيمة السفلي من الدماغ المتوسط ​​بواسطة جبل مضان كله (الشكل). وتتركز نسب Wnt1 ملحوظا في E9.5 على أبواب الكبار (β - غال + ، أحمر) في الأكيمة السفلية (الظهري الخلفي الدماغ المتوسط) كما رأينا مع التكبير المنخفض (5X) المجهري (E). F. A 40X ، الفرع 1 مم الضوئية المأخوذة من الدماغ المتوسط ​​البطنية في محيط الخلايا العصبية الدوبامين مع خلايا + nβ غال وGFP الغنية + محواري الضفيرة. وتقتصر الخلايا العصبية تدريجيا Wnt1 المستمدة ملحوظا في مقابل E8.5 E9.5 من المساهمة في الدماغ المتوسط ​​الظهرية ، في حين أن نسب Wnt1 استمرت في المساهمة في الدماغ المتوسط ​​البطني.

Discussion

ويمكن استخدام هذا النظام الذي GIFM أننا أظهرنا للرد على مجموعة واسعة من الأسئلة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الفئران المهندسة مع السائقين لجنة المساواة العرقية المختلفة لاستهداف أي نوع من الخلايا والأنسجة الوراثية أو نسب الفائ?...