Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule In Vivo</em

Riepilogo

Fate mappatura genetica inducibile (GIFM) segna e cellule brani con fini di controllo spaziale e temporale In vivo E chiarisce come le cellule da un lignaggio genetico specifico contribuire a sviluppare e tessuti adulti. Dimostrato qui ci sono le tecniche richieste per il destino mappa E12.5 embrioni di topo per l'analisi e epifluorescente espianto.

Abstract

Mappe destino sono generate da marcatura e tracciabilità delle cellule in vivo per determinare come progenitori contribuire a strutture specifiche e tipi di cellule nello sviluppo e nel tessuto adulto. Un anticipo di questo concetto è G enetic ho mangiato nducible F M ANALITICI (GIFM), che collega l'espressione genica, il destino della cellula, e dei comportamenti delle cellule in vivo, per creare mappe sorte sulla base di lignaggio genetico.

GIFM sfrutta X-créer linee dove X è un gene o un insieme di elementi normativi gene che conferisce espressione spaziale di una proteina modificata batteriofago, Cre ricombinasi (Creer ^T). Creer ^T contiene una versione modificata e strogen r del dominio di legame eceptor che rende Creer ^T sequestrato nel citoplasma, in assenza del farmaco tamoxifene. Il legame di tamoxifene comunicati Creer ^T, che trasloca al nucleo e ricombinazione media tra sequenze di DNA affiancato da siti loxP. In GIFM, ricombinazione si verifica in genere tra un loxP affiancato stop cassetta precedente un gene reporter come la GFP.

I topi sono allevati per contenere una regione o di cella tipo specifico Creer e un allele giornalista condizionale. Topi non trattati non avranno marcatura perché la cassetta Stop al reporter impedisce l'ulteriore trascrizione del gene reporter. Gestiamo la tamoxifene mediante sonda gastrica per tempo le femmine gravide, che fornisce il controllo temporale di rilascio Creer ^T e traslocazione successive al nucleo di rimuovere la cassetta di arresto del giornalista. A seguito di ricombinazione, l'allele giornalista è costitutivamente e heritably espresso. Questa serie di eventi segni cellule in modo tale che la loro storia genetica è indelebilmente registrato. Il reporter ricombinati serve così come tracciante alto lignaggio genetico fedeltà che, una volta acceso, è disaccoppiato dal genica inizialmente usato per guidare ^T Creer.

Noi applichiamo GIFM nel topo per studiare lo sviluppo normale e verificare il contributo dei lignaggi genetici per tipi di cellule adulte e tessuti. Usiamo anche GIFM per seguire le cellule mutanti in background genetico per capire meglio fenotipi complessi che imitano le caratteristiche salienti di malattie genetiche umane.

In questo articolo il video guide ricercatori attraverso metodi sperimentali per applicare con successo GIFM. Dimostriamo il metodo con il nostro ben caratterizzati Wnt1-créer ^T; topi mGFP con la somministrazione di tamoxifen al giorno embrionale (E) 8,5 tramite sonda gastrica seguita da dissezione a E12.5 e analisi da stereomicroscopia epifluorescenza. Abbiamo anche dimostrare come micro-sezionare domini destino mappati per la preparazione espianto o analisi FACS e sezionare adulti destino-mapped cervello per tutto l'imaging montaggio fluorescente. Collettivamente, queste procedure permettono ai ricercatori di affrontare le questioni cruciali in biologia dello sviluppo e modelli di malattia.

Protocollo

Tamoxifene Preparazione e orale procedura Gavage (E8.5)

• Preparare un 20 mg / ml soluzione madre di tamoxifene sciogliendo tamoxifen in fase di pre-riscaldato l'olio di mais.
• Incubare la soluzione a 37 ° C per 2 ore in un vortice nutator e intermittente.
• Proteggere lo stock tamoxifene dalla luce, conservare a 4 ° C, e l'uso per un massimo di un mese.
• Per gli esperimenti di mappatura destino, stabilire una coppia di riproduttori costituito da un Webster svizzero femminile (tipo selvatico; acquistati da Taconic) e un maschio che trasportano sia un gene specifico Creer allele ^T e un allele giornalista. A scopo dimostrativo, stiamo usando Wnt1-créer ^T; maschi mGFP (Ellisor 2009).
• Controllare svizzera femmine Webster ogni mattina per la comparsa di un tappo vaginale. Designare la mattina (0900) della giornata è visto un tappo vaginale di 0,5 giorni dopo il coito e calcolare la data di somministrazione Tamoxifene sulla base di questo punto di partenza. (Per questo esperimento, il giorno embrionale 8,5 è stato utilizzato).
• Utilizzare una siringa da 1 ml con un ago da alimentazione degli animali (20G x 1-1/2) di elaborare 200 ul della soluzione di riserva Tamoxifene (4 mg di tamoxifene).
• Trattenere saldamente il tempo incinta svizzero femminile Webster afferrando la nuca del collo e della schiena per immobilizzare la testa e girare in modo che il lato ventrale è rivolto verso l'alto.
• Tenere la coda tra le dita libere di mantenere il corpo in linea retta.
• Posizionare l'ago di alimentazione in un angolo della bocca e dolcemente guidare l'ago lungo il tetto della bocca.
• Ruotare l'ago in modo che sia parallelo al corpo, allo stesso tempo inclinando la testa all'indietro per mantenere il collo dritto.
• Guidare l'ago giù nell'esofago, verso lo stomaco. Fare attenzione a non entrare nella trachea. Se c'è resistenza sul ferro, si impegna riflesso dell'animale bavaglio, o se il mouse lotte, rimuovere immediatamente l'ago e provare di nuovo la sonda gastrica.
• Una volta che l'ago di alimentazione è nello stomaco, amministrare il Tamoxifene nello stomaco e tornare la donna alla sua gabbia a casa fino alla data di dissezione.

Craniotomia:

• Intracardially profumato il destino adulto mappati del mouse con il 4% PFA e togliere la testa con le forbici, tagliando attraverso la colonna vertebrale appena sopra le spalle.
• Eseguire un bisturi lungo la linea mediana dorsale della testa (rostrale per caudale) per tagliare il cuoio capelluto e esporre il cranio.
• Utilizzando il bisturi, raschiare via qualsiasi tessuto in eccesso o muscolo lungo il lato e posteriore del cranio.
• Con una pinza, forare il cranio sulla linea mediana appena anteriore del bulbo olfattivo e creare un piccolo foro per accogliere la punta delle forbici.
• Inserire le forbici bene in questo foro e fare un'incisione mediale a laterale circa la lunghezza dei bulbi olfattivi. Questo taglio si romperà il cranio all'incrocio tra l'osso nasale e osso frontale e forniscono un facile accesso per le forbici.
• Tagliare lungo le suture sagittale del cranio (dorsale linea mediana) evitando di mettere le punte angolate forbice di distanza dal cervello per evitare di danneggiare il tessuto sottostante.
• Afferrare delicatamente il cranio con una pinza e staccarsi l'osso lungo l'incisione mediale per esporre il cervello. Il cranio può chip di fuori in piccoli pezzi o staccarsi in grandi sezioni. Continuare a utilizzare il forcipe per rimuovere tutti il ​​frontale, ossa parietali, interparietale e occipitale.
• Rompere le ossa che stringe la paraflocculi (che si trova lungo i bordi laterali del cervello a livello del cervelletto), pizzicando le ossa sferiche su ciascun lato. Delicatamente tirare fuori le ossa.
• Girare la testa in giù (lato dorsale verso il basso) e utilizzare le pinze per tagliare i nervi cranici e rilasciare il cervello dal cranio.

Intero monte Microscopia: cervello adulto

• Valutare cervello adulto per GFP marcatura utilizzando un ambito fluorescente dissezione.
• Trasferimento cervello a una piastra di Petri contenente PBS e fotografare utilizzando PictureFrame o altri software appropriato.

Intero monte Microscopia: E12.5 embrioni

• Valutare gli embrioni montare tutto per GFP marcatura utilizzando un ambito fluorescente dissezione.
• Trasferimento quelli che sono GFP positive da montare tutta una piastra di Petri contenente PBS e fotografare utilizzando PictureFrame o altri software appropriato.
• Usare pinze per pizzicare fuori un piccolo pezzo di coda di ogni embrione, posto ogni pezzo in un tubo di PCR e genotipo del tessuto mediante PCR (Ellisor 2009) per entrambi gli alleli per confermare i risultati visti attraverso l'analisi montare tutto.

Micro-dissezione e preparazione espianto del mesencefalo ventrale da E12.5 embrioni

• In seguito a dissezione dalla catena uterina e identificazione del destino-mapped embrioni da tutto il montaggio a fluorescenza, il trasferimento di embrioni ghiacciata PBS sterile in un piatto di coltura cellulare.
• Utilizzando le forbici fine, rimuovere la porzione testa dell'embrione taglio trasversalmente, caudale a rhombomere 1.
• Successivamente, rimuovere la porzione rostrale della testa con un taglio coronale attraverso il diencefalo. Questo esporrà un tubo-come la struttura in cui il quarto ventricolo attraverso il modulo di vescicola mesencefalico un condotto tra tessuti dorsale e ventrale.
• Inserire con attenzione i suggerimenti forbice nel ventricolo 4, e tagliare lungo la linea mediana dorsale, caudale a rostrale, aprire completamente il tubo, creando una preparazione "libro aperto". Il mesencefalo ventrale sarà ora esposto medialmente, mentre le due metà dorsale del mesencefalo risiederà lateralmente.
• Rimuovere qualsiasi residuo non tessuto neurale sotto il mesencefalo ventrale in modo che il tessuto di gettare nuove categoricamente. Se necessario, fare tacche negli aspetti rostrale e caudale tale che il dorsale "ali" del espianto getterà piatto pure. L'espianto dovrebbe assomigliare ad una "farfalla, in cui il mesencefalo dorsale rappresenta le ali e la coda rhombomere 1.
• Per isolare ulteriormente il mesencefalo ventrale per l'analisi FACS o esperimenti di coltura cellulare, rimuovere il laterale (aspetti dorsale) del tessuto.

Rappresentante dei risultati:

In questo esperimento GIFM, Wnt1 cellule che esprimono in modo permanente e sono heritably segnato durante l'embriogenesi con la somministrazione di Tamoxifene a E8.5 a Wnt1-CreERT; embrioni mGFP. Successivamente, queste cellule sono contrassegnati visualizzati tramite intero fluorescenza montare e immunoistochimica sezione per determinare come Wnt1 cellule derivate contribuiscono a strutture neurali durante lo sviluppo. Intero monte fluorescenza si basa sulla componente membrana legata GFP del reporter mGFP e quindi fornisce informazioni cellulari, nonché una visione generale di proiezioni neurali Wnt1 derivati. Per esempio, con la somministrazione di Tamoxifene E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embrioni a E12.5 fluorescenza GFP mostra principalmente nel mesencefalo, romboencefalo posteriore e del midollo spinale (Figura 1A). A forte ingrandimento, fine proiezioni neuronali sono visti innervano il mesencefalo, parete del corpo, degli arti, e della regione cranio-facciale. A questo stadio di sviluppo, l'embrione è traslucido ed etichettatura GFP interno è facilmente individuabile. Tuttavia, poiché il cervello si sviluppa, la densità del tessuto maturo oscura fluorescenza GFP provenienti da strutture cerebrali interne. Pertanto, con la somministrazione di Tamoxifene E8.5, solo l'etichettatura GFP minore si osserva nel collicoli superiori degli adulti da tutto il montaggio di fluorescenza (Figura 1C, nel riquadro). Inoltre, alcune proiezioni assonale sono visti scorrere lungo la superficie ventrale del cervello posteriore (non mostrato). Al contrario, quando viene somministrato tamoxifene a E9.5, etichettatura GFP sostanziale si verifica durante l'intero collicoli inferiore (Figura 1B, nel riquadro). Questo aumento, in tutto fluorescenza monte può indicare che Wnt1 cellule che esprimono E9.5 a contribuire in modo più significativo alle regioni superficiali del mesencefalo dorsale o estendere più processi all'interno di questa regione che Wnt1 cellule che esprimono da E8.5. Indipendentemente da ciò, questa differenza, in tutto montare fluorescenza riflette la natura dinamica di Wnt1 espressione durante lo sviluppo e dimostra come GIFM possono essere usati per seguire le distinte popolazioni cellulari dall'embrione nella adulto maturo.

Con l'immunoistochimica, sezioni di tessuto destino mappati da Wnt1-CreERT; mGFP animali vengono analizzati a livello cellulare. Anticorpi contro GFP e β-galattosidasi (β-gal) sono usati in combinazione con una varietà di tessuti specifici biomarcatori per determinare il contributo multa scala cellulare del lignaggio Wnt1 delle strutture nervose e tipi di cellule. Con la somministrazione di Tamoxifene E8.5 e E12.5 l'analisi del tessuto a doppio cellule positive (GFP + e β-gal +) sono stati osservati in tutto il mesencefalo e romboencefalo, con proiezioni che scorre attraverso il mesencefalo ventrale (Figura 1B). Nel cervello adulto, il Wnt1-lignaggio marcato E8.5 dà origine a strutture tra cui il mesencefalo collicoli superiori ed inferiori, nonché in prossimità di popolazioni di cellule dopaminergiche della tegmentale ventrale e substantia nigra (Figura 1D) (vedi Zervas anche 2004). Al contrario, la Wnt1-lignaggio marcato E9.5 dà luogo a collicoli inferiori come pure ai neuroni in prossimità di popolazioni di cellule dopaminergiche (Figura 1F).

Figura 1 Risultati Rappresentante per Wnt1-destino di mappatura.:

Esempi di tutto il montaggio e risultati immunocitochimica in Wnt1-CreERT; embrioni mGFP e adulti destino cervelli mappata (marcato) a E8.5 (AD)e E9.5 (EF). A. Wnt 1-Creer; embrioni a E12.5 mGFP fluorescenza GFP mostra principalmente nel mesencefalo (Mb), romboencefalo posteriore (Hb) e del midollo spinale (Sp). Cellule B. Contrassegnato visualizzati e analizzati a livello cellulare mediante immunoistochimica come mostrato in questa sezione 1-micron di spessore ottico (obiettivo 40x, z-series di acquisizione). Etichettatura degli anticorpi nucleari β-galattosidasi (nβ-gal) (rosso) e l'etichettatura degli anticorpi GFP (verde) indica il destino mappato cellule mostrato nel mesencefalo ventrale. Qui, le cellule sono ricombinati doppio positivo (nβ-gal + / GFP +) a causa della natura del reporter mGFP condizionale. C. Whole-mount microscopia a fluorescenza rivela debole fluorescenza GFP nel superiore collicoli (SC) dell'adulto (nel riquadro). Valutare il lignaggio Wnt1 marcato E8.5 sulle sezioni adulti con basso ingrandimento (5X) microscopia rivela che il lignaggio Wnt1 dà origine a strutture tra cui il mesencefalo superiore (SC) e inferiore (IC) collicoli (C). D. A 40x, 1 sezione mm ottico preso dal mesencefalo ventrale in prossimità dei neuroni dopaminergici con nβ-gal cellule + e un ricco GFP + assonale plesso. E. Marcatura a risultati E9.5 nell'etichettatura GFP sostanziale che è prontamente osservato nel collicolo inferiore del mesencefalo da tutto il montaggio di fluorescenza (riquadro). Il lignaggio Wnt1 marcato E9.5 su sezioni adulti (β-gal +, rosso) è concentrata nel collicolo inferiore (dorsale-posteriore del mesencefalo), come si è visto a basso ingrandimento (5X) microscopia (E). F. A 40x, 1 sezione mm ottico preso dal mesencefalo ventrale in prossimità dei neuroni dopaminergici con nβ-gal cellule + e un ricco GFP + assonale plesso. Wnt1 neuroni derivati ​​segnato contro E9.5 a E8.5 sono progressivamente limitata dal contribuire al mesencefalo dorsale, mentre il lignaggio Wnt1 persiste nel contribuire al mesencefalo ventrale.

Discussione

Il sistema GIFM che abbiamo dimostrato può essere utilizzato per rispondere a una vasta gamma di domande in una varietà di processi cellulari. Per esempio, i topi ingegnerizzati con diversi piloti Cre può essere usata per bersagliare qualsiasi tipo di cellula, tessuto o lignaggio genetico di interesse. Inoltre, poiché tamoxifene può essere somministrato in qualsiasi punto temporale embrionale o post-natale, la ricombinazione possono essere indirizzati ad una delle fasi importanti dello sviluppo. Il controllo spazia...