طريقة محسنة لعزل الحمض النووي الريبي من الصنوبر Loblolly ( P. taeda L.) والأنواع الأخرى الصنوبرية

Summary

العديد من الأنسجة النباتية ، بما في ذلك اللحاء والخشب من الصنوبر loblolly ( صنوبر taeda L.) ، تحتوي على مستويات عالية من السكريات والفينولات التي تتداخل مع تنقية الحمض النووي الريبي. يناقش هذا العرض التقديمي تقنيات حصاد الميداني نمت الأنسجة وعزل الحمض النووي الريبي ذات نوعية كافية لميكروأرس الجينومية والتحليلات الأخرى.

Abstract

الأنسجة المعزولة من الأنواع الصنوبرية ، وبخاصة أولئك الذين ينتمون إلى عائلة Pinaceae ، مثل الصنوبر loblolly (

Protocol

الجزء 1 : حصاد شجرة

بعد اختيار الأشجار وقطعها ، فإنه من المهم أن تعمل بدقة وبأسرع وقت ممكن. كما هو حصاد كل نوع من أنواع الأنسجة المختلفة ، ينبغي وضعها على الفور في السفن الخاصة النيتروجين السائل لتفادي أي تلوث المواد عبر العينة. هذا البروتوكول هو عزل الحمض النووي الريبي للتحجيم.

1. قطع البراغي في أطوال حوالي متر و0،5-،75 برصيد بالمنشار النباح في اثنين أو ثلاثة من الأماكن التالية المحور الطولي للالترباس.
2. باستخدام إزميل الخشب ، والعمل على حافة المنطقة وسجل حتى النباح يبدأ فصل من الخشب ومواصلة العمل في حين تتراجع إزميل على قسم من النباح حتى أنه يفصل تماما من الجذع.
3. حصاد الخشب الثانوي بشفرة الحلاقة حافة مستقيمة ، وقفت وحيدة عن طريق كشط على طول المحور الطولي للالترباس الذي تم تجريده من النباح. ارتداء قفازات مطاطية للحد من التلوث من الأنسجة.
4. حصاد بسهولة اللحاء ، والذي يقع على الجانب الداخلي للأبواب النباح ، وذلك دليل تقشير.
5. ويتم جمع الخشب رد فعل من الجانب السفلي من أطرافه بعد وضع العلامات عليها بطلاء للإشارة إلى ميولهم الأصلي مع احترام الأرض.
6. يتم قطع أطرافه في المسامير من 1-2 م وسجل على طرفي نقيض على طول المحور الطولي وفقا لمواقع التقريبية لهذين النوعين من الخشب رد فعل : الخشب المعاكس (على الجانب العلوي من أطرافه) والخشب الضغط (على القاع جانب الأطراف). يتم فصل النباح من الطرف على النحو المبين أعلاه ، إلا أنه الوحيد هو إزالة اللحاء التي تغطي كل نوع من أنواع الخشب رد فعل في وقت واحد. ثم يتم جمع الخشب أو اللحاء الثانوي على النحو الموصوف أعلاه ، وضعت في النيتروجين السائل.
7. يمكن حصاده عينات أخرى ، مثل الإبر ، نصائح اطلاق النار والمخاريط الشباب ، وباليد أو باستخدام المقصات التقليم على النحو المطلوب.
8. ينبغي أن توضع العينات التي تم جمعها مجمدة في النيتروجين السائل في أكياس أو حاويات مناسبة ملحوظ ومعبأة في الجليد الجاف ليعود شحنها إلى المختبرات.

الجزء 2 : تصنيع برادات مطحنة للعينات

1. طاحونة ملء خزان سبكس الفريزر 6850 مع النيتروجين السائل ووضع شريط أثر في واحدة من طحن وتعبئة قوارير مع النيتروجين السائل لتبريد المسبق. تخلصي النيتروجين السائل وإضافة إلى عينة القارورة.
2. تأكد من أن أي فائض النتروجين السائل يبقى في غرفة الطحن وتنفيس تماما أن غاز النيتروجين الزائد قبل الجلوس على سقف نهاية لاغلاق الغرفة.
3. إدراج القارورة طحن في الناقل وثيق.
4. عينات الخشبية مصنع لدورتين من 1 دقيقة / دورة في الإعداد بنسبة 14.
5. استخدام ملعقة النيتروجين السائل المبرد لإزالة عينة المضروب (دقيق الخشب) في الدورق الذي تم قبل المبردة ويحتوي على كمية صغيرة من النيتروجين السائل.
6. صب النيتروجين السائل / عينة الطين في وعاء التخزين ومكان عقد الاجتماع -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.

الجزء 3 : عزل الحمض النووي الريبي ، يوم 1

1. 20mL من الاحتياطي عزل الحمض النووي الريبي في أنبوب 50mL فالكون توج مكان وإضافة 400 ميكرولتر β - المركابتويثانول ، الدوامة لفترة وجيزة ، ثم الحرارة في الحمام 60 ° C المياه.
2. إضافة 4 غرام من الأنسجة المجمدة على كل أنبوب. قبعة ويهز بقوة باليد تليها vortexing لمدة 10 ثانية.
3. إضافة حجم مساو من الكلوروفورم في أنبوب وعكس برفق لالمزيج. وضع أنبوب على عجلة دوارة ، والسماح نهاية الإفراط في نهاية الخلط لمدة 5 دقائق.
4. صب الخليط في أنبوب 50 مل أوك ريدج والطرد المركزي في 12000 (17200 XG) دورة في الدقيقة في الدوار الزاوية الثابتة SS34 لمدة 5 دقائق.
5. نقل إلى المرحلة المائية أنبوب أوك ريدج جديدة وإضافة نصف حجم الكلوروفورم.
6. دوامة لمدة 1 دقيقة ، ويستمر الخلط على عجلة دوارة لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (17200 XG) في الدوار SS34 زاوية ثابتة لمدة 5 دقائق.
7. نقل إلى المرحلة المائية العذبة أنبوب أوك ريدج وإضافة نصف حجم الكلوروفورم. دوامة لمدة 1 دقيقة. الطرد المركزي في 12000 دورة في الدقيقة (17200 XG) في الدوار SS34 زاوية ثابتة لمدة 10 دقيقة.
8. نقل المرحلة المائية إلى 50 مل أنبوب البولي بروبلين عالية السرعة. الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة (11900 XG) في الدوار SS34 زاوية ثابتة لمدة 20 دقيقة.
9. صب طاف في أنبوب 50 مل فالكون وإضافة ربع حجم 10 M إلى حل LiCl طاف. دوامة لفترة وجيزة ووضع على 4 درجات مئوية لهطول الأمطار خلال الليل.

الجزء 4 : عزل الحمض النووي الريبي ، يوم 2

1. العازلة للحرارة في حمام SSTE 65 ° C المياه قبل البدء.
2. صب العينة LiCl - عجلت في أنبوب بولي بروبلين وبيليه في الحمض النووي الريبي بواسطة الطرد المركزي في 11000 دورة في الدقيقة في الدوار SS34 زاوية ثابتة (14450 XG) لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
3. بعد الطرد المركزي ،من أجل الخروج وتجاهل السائل ، وعكس الأنابيب على Kimwipes لحوالي 1 دقيقة. ماصة إيقاف أي طاف المتبقية.
4. Resuspend كل بيليه في 800 ميليلتر من SSTE يسخن باستخدام ماصة إلى مزيج دقيق من العينات. نقل العينة إلى 2 مل معلق أنابيب Ambion microfuge ريبونوكلياز خالية.
5. عينات الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها vortexing حثيثة لضمان إعادة تعليق كامل.
6. إضافة حجم مساو من الفينول كلوروفورم ، pH8 ، إلى كل أنبوب العينة. دوامة كل عينة لمدة 30 ثانية ثم تدور في microfuge 14000 دورة في الدقيقة في مدة 3 دقائق
7. نقل إلى المرحلة المائية Ambion 2mL أنابيب جديدة microfuge ريبونوكلياز خالية ، وإضافة حجم مساو من الكلوروفورم. دوامة كل عينة لمدة 30 ثانية ، وتدور في microfuge 14000 دورة في الدقيقة في مدة 3 دقائق.
8. نقل إلى المرحلة المائية أنابيب جل قفل المرحلة التي تم إعدادها سابقا من قبل microfuging في 11000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. إضافة نصف حجم الكلوروفورم وماصة برفق لالمزيج.
9. الطرد المركزي في 11000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ونقلها إلى مرحلة جديدة مائي 2mL أنابيب Ambion microfuge ريبونوكلياز خالية.

الجزء 5 : رنا الأمطار واغسل الايثانول

1. إضافة 50 ميكرولتر الصوديوم 3.0 M أسيتات ، ودرجة الحموضة 4.8 و 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ في المرحلة مائي. ويعجل في دوامة -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
2. في عينات Microfuge 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية ، ونضح بعناية قبالة طاف. لا تخل بيليه.
3. غسل الكريات RNA مع 1 مل من الايثانول درجة مئوية 70 ٪ (V / V) -20. Microfuge في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة ، ونضح قبالة الايثانول.
4. كرر الخطوة 5.3.
5. إرفع قبعة الأنابيب وكريات الهواء الجاف على مقاعد البدلاء لمدة 3-5 دقائق.

الجزء 6 : إعادة تعليق النهائي والكمي

1. Resuspend كل بيليه في 100 DEPC المياه المعالجة ميكرولتر. مزيج من قبل vortexing واحتضان الأنابيب في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة قبل ان يضع على الجليد. كرر إذا لزم الأمر لضمان إعادة تعليق العينة.
2. تجمع عينات مثل الرغبة وجعل 50 ميكرولتر من التخفيف في تريس 01:10 10MM ، ودرجة الحموضة 7.5 ، عن الكميات الطيفي. نسب الامتصاصية ل260/280 260/230 وعادة ما تكون أكبر من 2.1 و 2.2 على التوالي. RNA مجموعة غلة بمعزل عن 120μg - 60 / ز الأنسجة المجمدة.
3. تحليل عينات من الحمض النووي الريبي ميكروغرام عن طريق تشغيل 1،5-2،5 على agarose هلام 1 ٪ في المخزن تاي. لعينات أكثر حرجا ، وتحليل الحمض النووي الريبي باستخدام 2100 اجيلنت Bioanalyzer حسب تعليمات الشركة المصنعة.

ممثل النتائج :

غلة العزلة RNA من مختلف أنسجة الصنوبرية نطاق 60-120 ميكروغرام / ز الأنسجة المجمدة مع عينات الخشبية العائد عادة حوالي 80G - 70 / ز الأنسجة المجمدة. نسب تشخيص 260/280 260/230 وكلاهما أكبر من 2.1 عادة ، ومؤشرات جيدة على أن عينة الحمض النووي الريبي وخالية من أي تلوث أو الفينولية كبيرة من الكربوهيدرات ، على التوالي. وينبغي أن العينات التي تم تحليلها من قبل الكهربائي للهلام agarose تليها تلطيخ EtBr تظهر ثلاثة نطاقات متميزة لل25S ، 18S ، و5S RNA (الشكل 1). تحديد رياضيات الكيمياء لل28S 18S إلى المواد الهلامية على agarose غير موضوعي إلى حد ما ، والعوامل مثل تشغيل الظروف لهلام ، تلوين ، وتحميل كل نموذج يمكن أن يكون لها تأثير. بوجه عام ، 28S : سوف 18S يبدو أن نسبة> 1.5. ومع ذلك ، بعض العينات الصنوبرية وأقل النسب. على سبيل المثال ، وبعد تحليل اجيلنت 2100 شهدنا حالات عديدة لعينات من أنواع الأنسجة الصنوبرية مختلفة حيث رياضيات الكيمياء هو اقرب الى 1.2:1. وبالتالي ، وهو ما يبدو 28S منخفض : رياضيات الكيمياء 18S التي agarose هلام إستشراد لا يدل بالضرورة على عينة ذات نوعية رديئة. أوراق ، واطلاق النار ، وعينات مخروط سوف يكون في كثير من الأحيان نطاقات مميزة إضافية الراهن ، نظرا إلى الرنا الريباسي البلاستيدات الخضراء. EtBr الملطخة المواد التي لا تهاجر من العينة جيدا أو نطاقات عالية الكتلة الجزيئية (> 80-10 كيلوبايت) تشير عادة التلوث الجيني DNA (الشكل 2). انخفاض مسحات الكتلة الجزيئية في محيط أو أقل من الفرقة وخفضت 5S تلطيخ الفرقة أو الريباسي 18S واضح> 28S رياضيات الكيمياء يعد مؤشرا جيدا أن الحمض النووي الريبي تدهور حدث (الشكل 3). في تحليل مخطط رحلاني اجيلنت 2100 ، خط الأساس ينبغي أن تكون منخفضة نسبيا وسلس مع القمم الرئيسية المقابلة ل18S 28S الرنا الريباسي وجود 28S : 18S نسب تتراوح في أي مكان 1،2-2،0. قد النزاهة RNA اجيلنت رقم (رين) قيمة يكون أفضل مؤشر لنوعية الحمض النووي الريبي ، وينبغي أن لا يقل عن 7 أو أكبر للالحمض النووي الريبي التي يتم استخدامها لإعداد الأهداف ميكروأري. ويبين الشكل 4 نموذجي اجيلنت 2100 عن مخطط رحلاني RNA الخشب مع 28S : 18S نسبة مساوية لقيمة 1.4 و 8.6 RIN بينما يظهر الشكل رقم 5 الزيليم الفقراء RNA الإعدادية وجود خط رفيع للغاية ، وتدهور ملحوظ كما كشفت عنها 28S : 18S RAيساوي 0.65 وقيمة قدرها 3.4 RIN تيو.

هلام Agarose الرقم 1. تحليل الحمض النووي الريبي الصنوبر العالية الجودة. حارة 1 ، 1 ك NEB القياسية ، 2 لين معارض نموذجية العزلة من الحمض النووي الريبي مجموع الخشب الصنوبر loblolly الثانوية مع 28S الريباسي مميزة ، 18S ، وشرائح 5S 28S واضحا : 18S النسبة> 1.

هلام Agarose الرقم 2. تحليل عينة الحمض النووي الريبي DNA الصنوبر ملوثة الجيني. حارة 1 ، 1 ك NEB القياسية ، 2 لين ، الزيليم عينة الحمض النووي الريبي DNA تبين التلوث الجيني.

هلام Agarose الرقم 3. تحليل عينة من الحمض النووي الريبي الصنوبر تبين التدهور والتلوث مع الحمض النووي الجيني. حارة 1 ، 1 ك NEB القياسية ، Lane2 ، الزيليم عينة الحمض النووي الريبي DNA تبين التلوث الجيني وتدهور شديد الحمض النووي الريبي.

الشكل 4 المعزولة. اجيلنت 2100 مخطط رحلاني من الحمض النووي الريبي مجموع الخشب باستخدام طريقة وصفها على الخشب الصنوبر loblolly. 28S : 18S يساوي نسبة 1.4 ، RIN تعادل قيمتها 8،6

الشكل 5. اجيلنت 2100 مخطط رحلاني غيض من الحمض النووي الريبي مجموع قمية يظهر التدهور الشديد والتلوث الجيني. 28S : 18S يساوي نسبة 0.65 في رين تعادل قيمتها 3،4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن الحصول على نوعية عالية من الحمض النووي الريبي الأنواع الصنوبرية يكون مهمة صعبة نظرا لمستويات عالية من مركبات الفينول والسكاريد موجودة في الأنسجة الخشبية. بدءا من البروتوكول التي وضعتها تشانغ وآخرون. (1) ، وجدنا أن استخراج أكثر صرامة وتنظيف خطوات تؤدي إلى العزلة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425