ロボロリーパインからのRNA分離の改良法（ P. taeda L.）及びその他の針葉樹種

要約

テーダマツから篩部および木部を含む多くの植物組織、（テーダマツ L.）、フェノール類およびRNA精製を妨害する多糖類の高レベルが含まれています。このプレゼンテーションでは、屋外栽培の組織やマイクロアレイや他のゲノム解析のための十分な品質のRNAの単離の収穫のためのテクニックを説明します。

要約

このようなテーダマツ（のような特に針葉樹の種、マツ科のファミリーに属するものから分離された組織、

プロトコル

パート1：ツリーの収穫

ツリーを選択し、伐採された後、それは慎重にし、可能な限り迅速に作業することが重要です。それぞれ別の組織の種類が収穫されているサンプルの材料の任意のクロスコンタミネーションを避けるために、彼らは自らの液体窒素容器にすぐに配置する必要があります。このRNAの分離のプロトコルがスケーラブルです。

1. ボルトの長手方向軸線に続く二、三箇所の樹皮は約0.5〜0.75メートルの長さにし、チェーンソーのスコアとボルトをカット。
2. 樹皮が木材から分離し、それが茎から完全に分離するまで樹皮のセクションに戻って引きながらノミを作業を続行し始めるまでの木材のみを使用して、得点領域の端を働く。
3. 二次木部は、樹皮から削除されているボルトの長手方向軸に沿ってこすることによりストレートエッジ、片面カミソリで収穫されます。組織の汚染を最小限に抑えるためにゴム手袋を着用してください。
4. 樹皮のセクションの内側に配置されている師部は、容易に剥離手動で収穫される。
5. 反応の木は、尊敬グラウンドで元の方向を示すために、スプレーペンキでそれらをマークした後、手足の下面から収集されます。
6. 手足は1〜2 mのボルトに切断し、反応の木の2つのタイプのおおよその位置に基づいて縦軸に沿って反対側に得点されています：反対の木（四肢の上部側）と圧縮あて材（底上肢の側）。樹皮は、反応の木材の各タイプをカバーする樹皮を一度に削除されることを除いて、上記のような手足から分離されている。二次木部や篩部は、前述のように回収し、液体窒素中に配置されます。
7. このような針、茎頂や若い円錐のような他のサンプルは、、手で収穫するか、または必要に応じ剪定ばさみを使用して設定できます。
8. 液体窒素で凍結採取した試料は、顕著な袋または適切な容器に入れ、実験室に戻って出荷のためにドライアイスで梱包してください。

パート2：サンプルのフリーザーミル加工

1. 液体窒素でスペックス6850フリーザーミルタンクを記入し、研削バイアルのいずれかにインパクトバーを配置し、プレチルに液体窒素で満たす。液体窒素を捨て、バイアルにサンプルを追加。
2. 余分な液体窒素が製粉チャンバー内に残っていないとエンドキャップは、チャンバーを密封するために装着される前に、その過剰な窒素ガスが完全に排気されていることを確認します。
3. キャリアと密接に研削バイアルを挿入します。
4. 14の速度の設定で1分/サイクルの2サイクル用ミル木質サンプル。
5. あらかじめ冷却され、液体窒素を少量含まれているビーカーに粉砕されたサンプル（木粉）を除去するために液体窒素冷却したスパチュラを使用してください。
6. 必要になるまで-80℃で貯蔵容器と所定の位置に液体窒素/サンプルスラリーを注ぐ。

パート3：RNA単離、1日目

1. 50mLのキャップファルコンチューブにRNA分離バッファの20mlの代わりとし、400μLのβ-メルカプトエタノール、軽くボルテックスして、60℃の水浴中で熱を加える。
2. 各チューブに凍結組織の4gを追加します。フタをし、10秒間ボルテックスし、次いで手で強く振とう。
3. チューブに等量のクロロホルムを追加し、穏やかに転倒混和。回転するホイール​​にチューブを置き、5分間転倒ミキシングが可能。
4. 12,000（17200 × g）で5分間SS34固定アングルローターの回転数で50 mLのオークリッジチューブと遠心分離機に混合物をデカント。
5. 新鮮なオークリッジ管に水相を移し、クロロホルムの半分のボリュームを追加します。
6. 1分間ボルテックスし、5分間回転するホイール​​に混和して。 5分間SS34固定アングルローターで12,000 rpmで（17200 × g）で遠心する。
7. 新鮮なオークリッジ管に水相を移し、クロロホルムの半分のボリュームを追加します。 1分間ボルテックス。 10分間、SS34固定アングルローターで12,000 rpmで（17200 × g）で遠心する。
8. 50mLの高速ポリプロピレンチューブに水相を移す。 20分SS34固定アングルローターで10,000 RPM（11900 × g）で遠心する。
9. デカントは50mlのファルコンチューブに上清と清の四分の一のボリュームを追加する10 M LiClをソリューション。 4で簡潔にボルテックスし、場所で一晩沈殿のためのC。

パート4：RNAの単離、2日目

1. 開始する前に65℃の水浴中で熱のSSTEバッファ。
2. 4℃で30分間SS34固定アングルローターで11000回転（14450 × g）で遠心分離によってポリプロピレンのチューブ及びペレットRNAにLiClを沈殿させ、サンプルを注ぐ℃に
3. 遠心分離後、オフ注ぐと液体を捨てる、と約1分間、キムワイプで試験管を反転。残りの上清をピペットで。
4. 徹底的にサンプルを混合するピペットを用いて加熱SSTEの800μLで各ペレットを再懸濁する。 2 mLのAmbion社のRNase - freeマイクロチューブに再懸濁したサンプルを移す。
5. 熱サンプルを65℃の完全な再懸濁を確保するために積極的なボルテックスに続いて2分間。
6. 各サンプルチューブに、フェノール - クロロホルム、PH8の等量を追加。 30秒間ボルテックス各サンプルを、その後3分間14,000 rpmで遠心でスピン
7. 新しい2mLのはAmbion社のRNase - freeマイクロチューブに水相を移し、等量のクロロホルムを加える。 3分間14,000 rpmで遠心で30秒とスピン間ボルテックス各サンプルを。
8. 以前に2分間11,000 rpmでmicrofugingによって準備されているフェーズロックジェルチューブに水相を移す。クロロホルムの半分量を加え、穏やかに混合してピペット。
9. 5分間、11,000 rpmで遠心分離し、新鮮な2mLのアンビオンRNaseフリーのマイクロチューブに水相を移す。

パート5：RNAの降水量とエタノールで洗浄

1. 水相に50μLの3.0 M酢酸ナトリウム、pH 4.8、1 mLの100％エタノールを加えます。 -80の渦と沈殿-20℃で30分間または一晩℃です。
2. 慎重にマイクロ4で30分間14,000 rpmでサンプル° C、そして上清を吸引。ペレットを乱さないでください。
3. 1mLを-20 ° C 70％（v / v）エタノールでRNAペレットを洗浄してください。 1分間14,000 rpmで微量とエタノールを吸引除去する。
4. ステップ5.3を繰り返します。
5. 3-5分のためのベンチでチューブと空気乾燥ペレットを暴露する。

パート6：最終的な再懸濁および定量

1. 100μLのDEPC処理水に各ペレットを再懸濁する。ボルテックスで混合し、氷上に置く前に2分間、65℃でチューブをインキュベートする。サンプルの再懸濁を確保するために必要に応じて繰り返します。
2. 希望と分光学的定量のために、10mMのトリス、pH 7.5の10倍希釈液50μLを加えた場合のサンプルのようなプール。 280分の260と230分の260の吸光度比はそれぞれ、一般的に2.1と2.2よりも大きいです。 60120μg/ gの凍結組織からのRNA単離収率の範囲。
3. TAEバッファー中で1％アガロースゲル上で1.5〜2.5μgのRNAを実行してサンプルを分析する。より重要なサンプルについては、製造元の指示に従ってAgilent 2100バイオアナライザを用いてRNAを分析する。

代表的な結果：

木質試料で60〜120μg/ gの凍結組織とは異なる針葉樹の組織の範囲からのRNA単離収率は通常、70〜80グラム/ gの凍結組織の周りに降伏。 280分の260と230分の260の診断率は両方とも2.1よりも一般的に大きくなって、そしてRNAサンプルはそれぞれ、重要なフェノールまたは炭水化物の汚染がないことを良い指標です。反応ステップの染色をアガロースゲル電気泳動によって分析したサンプルは、25S、18S、および5S RNA（図1）の3つの明瞭なバンドを表示する必要があります。アガロースゲル上で18Sに28Sの化学量論を決定することは幾分主観的であり、そしてそのような実行中のゲルのための条件、染色、およびサンプルの負荷などの要因がすべて影響を及ぼす可能性があります。一般的には、28S：18S比が> 1.5であることが表示されます。ただし、一部の針葉樹のサンプルは低い比率を持っている。例えば、Agilent 2100バイオアナライザ分析の後我々は、化学量論は1.2:1に近い方の異なる組織タイプから針葉樹のサンプルの複数のインスタンスを見てきました。このように、見かけの低い28S：18Sアガロースゲル電気泳動による化学量論は、必ずしも低品質のサンプルを示しているわけではありません。葉、茎、およびコーンのサンプルは、しばしば追加の明瞭なバンドが葉緑体リボソームRNAによる発表があります。サンプルウェルまたは高分子量のバンド（> 8〜10キロバイト）から移行しない流します染色材料は、通常、ゲノムDNAのコンタミネーション（図2）を示している。 5Sバンドのまたは下近傍の減少リボソームバンドの染色または明白18Sの低分子量の汚れが> 28Sの化学量論は、RNAの分解が（図3）が発生したことを示す良い指標です。 1.2から2.0にどこまで18S比：Agilent 2100バイオアナライザ電気泳動分析では、ベースラインが低く、18Sと28Sをもつ28SリボソームRNAに対応する主要なピークを持つ比較的滑らかでなければなりません。 AgilentのRNAの完全性番号（RIN）値は、RNAの品質の良い予測因子である可能性があり、マイクロアレイのターゲットの調製に使用するRNAの少なくとも7以上にする必要があります。 18S：図5は、28Sで明らかにしたように非常に高いベースラインと顕著な低下を持っている貧しい木部RNAプレップを示し、18S 1.4〜等しい比と8.6のRIN値：図4は、28Sと木部のRNAの典型的なAgilent 2100バイオ電気泳動図を示しています。 RA0.65〜3.4のRINの値に等しいチタン。

高品質な松のRNAの図1。アガロースゲル分析。レーン1、NEB 1キロバイトの標準は、レーン2は、特徴的なリボソーム28S、18S、そして5Sのバンドと明らかに28Sとテーダマツ二次木部からの典型的なトータルRNAの分離を示しています：18S比> 1。

ゲノムDNAで汚染された松のRNAサンプルの図2。アガロースゲル分析。レーン1、NEB 1キロバイト標準、レーン2、ゲノムDNAのコンタミネーションを示す木部RNAサンプル。

ゲノムDNAとRNAの分解やコンタミネーションを示す松サンプルの図3。アガロースゲル分析。レーン1、NEB 1キロバイト標準、Lane2、ゲノムDNAのコンタミネーションと深刻なRNAの分解を示す木部RNAサンプル。

図4。木部のトータルRNAのAgilent 2100バイオアナライザ電気泳動図は、テーダマツの木部に記載された方法を用いて単離した。 28S：18S比は、RIN値は8.6に等しく、1.4に等しい

図5。深刻な劣化とゲノムコンタミネーションを示す心尖先端トータルRNAのAgilent 2100バイオ電気泳動図。 28S：18S比はRINの値が3.4と等しい、0.65に等しい

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ディスカッション

針葉樹の種から高品質のRNAを得ることは木質の組織で検出されたフェノール及び多糖類化合物を高レベルで与えられる困難な作業になる場合があります。 Changらによって開発されたプロトコルを使用して起動。 （1）、我々はより厳密な抽出を発見し、様々な木質と針葉樹種の多種多様なサンプリング非木質組織から非常に高品質のトータルRNAの一貫性のある分離する可能性の手順をクリー?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425