的RNA分离方法的改进火炬松（ P。火炬松 L）和其他针叶树种

摘要

许多植物组织中，包括从火炬松的韧皮部及木质部（火炬松 L），含有酚和干扰RNA纯化的多糖高的水平。此演示文稿讨论的收获种植现场组织和隔离的芯片和其他基因组分析的RNA质量足够技术。

摘要

针叶树种，特别是那些属于松科家族，如火炬松，从组织中分离（

研究方案

第1部分：树丰收

的树被选中，砍伐后，重要的是那样认真和尽快工作 。 随着每一个不同的组织类型的收获，他们应该立即放置到自己的液氮容器，以避免任何样品材料的交叉污染。 这种RNA隔离协议的可扩展性。

1. 切成约0.5-0.75米长的螺栓和电锯得分在两个或三个地方的树皮螺栓纵轴。
2. 使用木凿，工作取得区域的边缘，直到树皮开始从木材中分离出来，同时拉树皮的部分，继续凿，直到它完全分开干。
3. 次生木质部是收​​获的直边，单双面剃刀刮沿纵轴的螺栓已剥去树皮。戴乳胶手套，以尽量减少污染的组织。
4. 手册剥离韧皮部，这是位于树皮部分的内侧，很容易收获。
5. 反应木材是从四肢底面后他们用喷漆标记，表明尊重其原始方向的地面收集。
6. 四肢都切成1-2米的螺栓，并沿纵轴上取得的两侧，根据木材的反应两种类型的大致位置：对面的木（上顶侧肢体）和压缩木（在底部一侧肢体）。树皮中分离从上文所述的肢体，但只有树皮覆盖每种类型木材的反应是在同一时间删除。次生木质部或韧皮部，然后收集如上所述，并放置在液态氮中。
7. 其他样品，如针，茎尖和年轻的视锥细胞，可以通过手工或收获，利用必要的修枝剪。
8. 标记袋或适当的容器应放置在液氮冷冻收集的样本，并在运回实验室的干冰包装。

第2部分：冷冻样品铣加工

1. 用液态氮填充SPEX 6850冷冻厂的水库和一个研磨瓶放入影响的栏，并填写用液氮预寒意。倒入液氮和样品添加到小瓶。
2. 请确保没有多余的液态氮保持在研磨室和端盖前，坐在密封腔，多余的氮气是完全排出。
3. 插入载体和密切的研磨瓶。
4. 两个1分钟/循环周期率设定在14密尔木本样本。
5. 使用液态氮冷冻铲到一个已预冷，并含有少量的液态氮烧杯中删除的试片（木粉）。
6. 倒在-80℃直至所需的液态氮/样品泥浆进入储存容器和地点。

第3部分：RNA分离，每日1次

1. RNA提取缓冲液20ML成50毫升上限猎鹰管，加400μLβ-巯基乙醇，涡旋简单地说，然后在60℃水浴热。
2. 每管加入4克冰冻组织。第和动摇振荡10秒手大力。
3. 管加入等体积的氯仿和反转轻轻混合。管放置在一个旋转的轮子，并允许最终超过年底搅拌5分钟。
4. 倒出到50毫升橡树岭管和12,000（17,200 XG），在一个SS34固定角度转子5分钟的转速离心机的混合物。
5. 水相转移到一个新的橡树岭管，并添加一个半体积的氯仿。
6. 涡为1分钟，继续搅拌5分钟，一个旋转的轮子上。在SS34 5分钟的固定角度转子离心机转速12,000 rpm（17,200 XG）。
7. 水相转移到新鲜的橡树岭管，并添加一个半体积的氯仿。涡1分钟。在SS34 10分钟的固定角度转子离心机转速12,000 rpm（17,200 XG）。
8. 水相转移到50 mL的高速聚丙烯管。在SS34 20分钟的固定角度转子离心机以10,000 rpm（11900 XG）。
9. 倒出上清液到50毫升猎鹰管，并添加一季度量10米LiCl水溶液上清。简言之涡和地方在4 ° C为过夜析出。

第4部分：RNA分离，第2天

1. 热火在65 ° C水浴开始之前SSTE缓冲区。
2. 倒入聚丙烯管和沉淀的RNA，用LiCl沉淀样品离心30分钟，在11000名，在一个SS34固定角度转子转速（14450 XG）4 ° C。
3. 离心后，倒出并丢弃液体，倒置约1分钟Kimwipes管。移液器关闭所有剩余的上清。
4. 在每个加热用吸管SSTE彻底混合样品800μL重悬沉淀。悬浮样品转移到2毫升Ambion公司无RNase离心管。
5. 热样品在65℃大力涡旋2分钟，以确保完整的再悬浮。
6. 加入等体积酚 - 氯仿，PH8，每个样品管。涡每个样本为30秒，然后在离心旋转，在3分钟14000转
7. 水相转移到一个新的2ML Ambion公司无RNase离心管，加等体积的氯仿。涡每个样本为30秒，并在3分钟14,000转离心旋转。
8. 水相转移到锁相凝胶管先前已准备2分钟的转速在11000 microfuging。添加一个半体积的氯仿，轻轻地吸液管混合。
9. 离心5分钟11,000转和水相转移到新鲜2ML Ambion公司无RNase离心管。

第5部分：RNA沉淀和乙醇洗

1. 加入50微升3.0 M醋酸钠，pH值4.8，和1 mL 100％的乙醇水相。涡和沉淀在-80 ° C时为30分钟或隔夜-20 ° C。
2. 14000 RPM为30分钟，在4 ° C，并小心吸上清液离心样品。请勿打扰的颗粒。
3. 1毫升-20 ° C 70％（V / V）乙醇洗涤RNA的颗粒。在1分钟14000转离心和吸乙醇。
4. 重复步骤5.3。
5. 3-5分钟替补摘帽管和空气干燥颗粒。

第6部分：最后再悬浮和定量

1. 每100μLDEPC处理水重悬沉淀。由涡旋混合，并在65 ° C孵育2分钟，然后放置在冰上管。如有必要，以确保样品的再悬浮重复。
2. 像如果需要的话，并为50μL1:10稀释在10MM三，pH值7.5，分光光度定量的样品池。吸光度比值为260/280和二百三十○分之二百六十○通常比分别为2.1和2.2，更大。 RNA分离单产范围从60 -120μg/ g的冷冻组织。
3. 运行在1％琼脂糖凝胶在TAE缓冲液1.5-2.5微克RNA​​分析的样品。更为关键的样本，分析每制造商的指示使用，安捷伦2100生物分析仪的RNA。

代表性的成果：

RNA分离产量从不同的针叶树组织范围从60-120微克/克木本样品冰冻组织通常会产生大约70 - 80G / G冰冻组织。 260/280和二百三十分之二百六诊断率通常都超过210更大，是良好的指标，RNA样品无任何重大的酚醛树脂或碳水化合物的污染，分别。 ETBR染色的琼脂糖凝胶电泳分析的样品应显示25S，18S和5S RNA（图1）三个不同的乐队。确定的28S化学计量琼脂糖凝胶电泳18S是有些主观，凝胶，染色，样品负载运行条件等因素，都可以产生效果。在一般情况下，28S：18S的比例将显示为> 1.5。然而，有些针叶样品有较低的比率。例如，安捷伦2100分析后，我们已经看到几个不同的组织类型的化学计量比接近1.2:1针叶树种样品的实例。因此，明显偏低28S：18S琼脂糖凝胶电泳化学计量并不一定表示一个质量差的样本。叶，拍摄，往往会产生更多的不同的频段目前由于叶绿体核糖体RNA锥样品。 ETBR染色的材料，不迁移以及从样品或分子质量高频段（> 8-10 KB），通常表明基因组DNA污染（图2）。在5S带和减少核糖体带染色或明显18S> 28S化学计量学是一个很好的指标，RNA降解发生（图3）或低于附近的低分子量涂片。在Agilent 2100电泳分析，基准线应与相应的18S和28S核糖体RNA有28S的主要峰低和相对平稳的的：18S的比例从1.2到2.0不等。安捷伦RNA的完整性号码（RIN）的值可能是一个更好的RNA质量的预测，并应至少为7或更大的RNA是用于制备芯片的目标。图4显示了一个典型的木质部与28S RNA的安捷伦2100电泳：18S比等于1.4和8.6的RIN值，而图5显示了一个穷人的木质部RNA的准备有一个非常高的基线明显下降，由28S透露：18S RA氧化钛等于0.65和3.4的RIN值。

图1：高品质的松树RNA 的琼脂糖凝胶电泳分析。 1巷2巷，NEB 1 kb的标准，显示了一个典型的总火炬松次生木质部与特色核糖体28S，18S，5S乐队和明显的28S RNA的提取：18S比值> 1。

图2。松树RNA样品琼脂糖凝胶电泳分析基因组DNA的污染。 1巷，NEB 1 kb的标准，2巷，木质部显示出基因组DNA污染的RNA样品。

图3。琼脂糖凝胶电泳分析显示RNA降解和基因组DNA污染的松树样品。 1巷，NEB 1 kb的标准，Lane2，木质部呈现出基因组DNA的污染和严重的RNA降解的RNA样品。

图4。安捷伦2100木质部总RNA电泳分离出所描述的方法使用火炬松木质部。 28S：18S的比例等于1.4，RIN值等于8.6

图5。安捷伦2100呈现出严重的退化和基因组污染的根尖提示总RNA电泳。 28S：18S比值等于0.65，RIN值等于3.4

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讨论

从针叶树种获得高质量的RNA可以是一个艰巨的任务，鉴于木本植物组织中发现的酚类和多糖化合物的高水平。开始与张等人开发的协议。 （1），我们已经发现，更严格的提取和清理步骤导致各种木本和非木本组织从多种针叶树种采样的质量非常高的总RNA的一致隔离。该视频已证明不仅是我们修改后的RNA分离协议，而且在实地收集和火炬松用于RNA分离前处理技术而采取的步骤。这些收获和准备步?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425