تقنية لجمع كمئي (التذوق) النتوئات الإنسان من اللسان

Summary

تمتعت معرفة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تنبيغ ذوقي مؤخرا تقدما كبيرا ، إلى حد كبير بسبب استخدام النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، فإن التنوع الواسع في حساسية الذوق والنوعية بين الدراسات أوامر الثدييات في الأنسجة البشرية. وصفنا تقنية خزعة لجمع الخلايا الحية من طعم حليمات اللسان على الإنسان.

Abstract

حس الذوق أمر بالغ الأهمية للحياة البشرية. أن يبلغ الهيئة عن نوعية الأطعمة التي سيتم تناولها ويحتمل أن يحفز عمليات التمثيل الغذائي التي تعد القناة الهضمية للهضم. ويجري إحراز تقدم مطرد نحو فهم الأحداث البيوكيميائية والجزيئية الكامنة في وقت مبكر تنبيغ الذوق (للمراجعة ، وبريسلين سبيكتور ، 2008 ^1). ومع ذلك ، فقد أدى التقدم المحرز حتى الآن إلى حد كبير من النماذج الحيوانية. حتى الآن ، لأن الاختلافات الواضحة في نوعية وكثافة مستقبلات مستقبلات تختلف بين الأنواع ، لن الإنسان طعم تنبيغ أن يفهم باستخدام الأنسجة البشرية الذوق. نحن هنا وصف الأسلوب خزعة لجمع كمئي الحليمات البشرية وظاهرة للعيان وتقريب الهياكل الأمامية الوردي ، ونحو 0.5 مليمتر في القطر التي تحتوي على براعم الذوق. وتستخدم هذه الحليمات الخزعة لأغراض عدة بما في ذلك عزل خلايا قابلة للحياة طعم برعم ، في الموقع المناعية ، والتهجين ، من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية ، وتحديد البروتينات الرواية طعم خاص.

Protocol

1. مقدمة واعتبارات عامة

الإجراء عامة ينطوي التخدير الموضعي لمنطقة (1 سم ²⁾ صغير من السطح الظهري الأمامي من اللسان ، تليها إزالة عدد (6-8) من كمئي (الذوق) الحليمات من تلك المنطقة تخدير باستخدام المنحني الدقيقة الربيع - المقص (ماكفرسون - Vannas اكتب # 5603 ريال ، Roboz ، روكفيل ، دكتوراه في الطب). لإزالة ما يقرب من الحليمات كمئي 0.25 ³ ملم لكل منهما. هناك القليل جدا من المنظمات غير الحليمات (الذوق) الأنسجة الطلائية مع إزالة كل حليمة. الحليمات شكل جديد في هذا المجال بعد 3 إلى 5 أسابيع واستعادة أداء براعم الذوق (سبيلمان والعلامة التجارية ، والملاحظات غير منشورة). ليس هناك أي تأثير ملحوظ على طعم أو نكهة الطعام بعد إزالة هذه كمية صغيرة من المواد الذوق. من الدراسات التي تم احصاء براعم الذوق الفردي في اللسان البشري الكبار ، يمكن تقدير أن اللسان البشري يحتوي على براعم الذوق حوالي 5000. إجراءاتنا يزيل على الأكثر 20 إلى 25 من هذه البراعم الذوقية (في المتوسط ​​، ~ براعم الذوق 3،5-4 في الحليمة كمئي في الإنسان) ² ، أو نحو 0.4 ٪ من المجموع. بالاضافة لا يوجد ألم المرتبطة مع فقدان الجراحية من هذا النسيج. يشعر المرء ، بالطبع ، وألم بسيط في موقع الحقن فقط ، كما يدخل إبرة اللسان. بعد التخدير قد بليت ، هناك انزعاج خفيف في بعض الأحيان لمدة أقل من يوم واحد ، ولكن هذا الانزعاج هو أقل بكثير من ما وصفه بطريق الخطأ بعد التجارب "العض" منها اللسان.

على مدى السنوات العديدة الماضية قمنا بتطوير إجراء البديلة التي لا تشمل التخدير. تقنية لإزالة أنسجة مطابقة لكليهما. والفرق الوحيد في هذا الإجراء هو الذي لم يعد يقتصر على جراح إلى منطقة قطرها 1 سم ² حيث كانت موجهة التخدير. بل يمكن ق / انه اختيار أي موقع على السطح الظهري للسان فيها حليمات بارزة تظهر. محدودة العدد الإجمالي للإزالة حليمات إلى 6-8 في كل من التقنيات ، مع أو بدون تخدير إذا أجريت بشكل صحيح ، ويعتبر من عدم الراحة لإزالة حليمات الذوق 6-8 كمئي أقل من قضية بالمقارنة مع الألم المرتبطة بالإدارة تخدير موضعي دراسة استقصائية عامة من الأفراد الذين خضعوا لكلا الإجراءين ، أي مع وبدون تخدير ، وأظهرت أن أغلبية ساحقة من الموضوعات سوف تستغني دون تخدير موضعي في جميع الخزعات المستقبل. وقد حاول الجراح الذي طور هذه التقنية (AIS) وزملاؤه عدة تدرس من قبل المؤلف الذي أنجز خزعات من دون تخدير ، على أنفسهم ونشهد أن الانزعاج هو مؤقت ، ويعتبر أقل من باللسان والعض. أخيرا ، وطلب من عشرات من الأفراد الذين وافقوا على أن تكون الخزعة إذا كانوا مستعدين لمحاولة إزالة أحد حليمة بدون تخدير وإذا القاضي أن يكون مؤلما جدا أنها ستتعرض التخدير ، فقد اتفق الجميع على الاستمرار في إزالة حليمات دون التخدير.

ينبغي للخزعة بأكمله لا يستغرق وقتا أطول من 5-10 دقائق. إذا استخدمت التخدير وأضاف آخر دقيقة 2-3. ويتم عادة خزعة في ساعات الصباح. قبل الخزعة ، يتم طلب من المتطوعين تناول وجبة خفيفة قبل ساعتين من بدء الوقت المحدد. في الخزعة ، يتم الحصول على الموافقة المسبقة عن مكتوب. معايير الاستبعاد في الوقت من الخزعة تشمل ذوي الأمراض المزمنة الخطيرة ، سواء كانت تحت سيطرة الدواء أم لا (على سبيل المثال ، أي أمراض الجهاز الهضمي ، والأمراض العصبية والسرطان وdyscrasias الدم ، والحساسية لأدوية التخدير الموضعي ، الخ) تلك مع معدل ضربات القلب أكبر من 100 أو أقل من 60 ؛ ضغط الدم الانقباضي أكثر من 145 أو أقل من 100 ؛ ضغط الدم الانبساطي أكثر من 90 أو أقل من 60 عاما ، ورأي الطبيب الجراح أن هذا الموضوع يمكن أن تشارك في الدراسة.

أخيرا ، من المهم أن نرى أنه ينبغي إجراء خزعة قامت بها في نفس المبنى حيث ستتم معالجة الأنسجة للفحص منذ فقدان سلامة الأنسجة بسرعة كما لاحظنا في كثير من الأحيان من جانب تدني نوعية مرنا. وينبغي للتقليل من هذه المشاكل يمكن معالجتها النسيج اللسان في أسرع وقت ممكن.

2. موضوع التحضير

1. يجلس على كرسي الموضوع في الأسنان أو على مقعد مع مسند الرأس.
2. فحص معدل ضربات القلب وضغط الدم في وقت الخزعة. وينبغي أن سقوط موضوع خارج نطاق ضغط الدم ومعدل ضربات القلب أو اختصاصها عن طريق الفم ، الجراح توصي الموضوع الذي هو / هي جعل التعيين الفوري لرؤية الطبيب.
3. فحص تجويف الفم للصحة الأنسجة عامة ، مع الانتباه إلى مؤشرات جفاف الفم ، واللسان الجغرافي أو أي آفات اللسان. يتم استبعاد اي موضوع تظهر عليها علامات المرض عن طريق الفم ، بما في ذلك آفات اللسان أو جفاف الفم من الدراسة. إرشاد تخضع لشطف الفم بالماء لإزالة كافة الانقاض من cavit الشفويي. إذا لزم الأمر يتم تنظيف اللسان مع المزيل اللسان المتاح لإزالة البلاك أو الحطام ، التي يمكن تنفيذها في لسانه خلال حقن تخدير. ويستخدم الجراح منصات شاش معقم القفاز في اليد لعقد ربع الأمامي من اللسان لأنه يمتد من تجويف الفم.
4. إذا تم استخدام التخدير ، وحقنة السلين 1cc مع قياس 28 × يتم حقنها ببطء ½ 'إبرة تحتوي على 0.25 مل يدوكائين (2 ٪) مع الإيبينيفرين (1:100،000) في موقع واحد فقط تحت السطح الظهري للجزء الأمامي من اللسان . موقع التخدير وقاص إلى موقع المجموعة على تجنب التدخل من قبل يدوكائين مع دراسات لاحقة. وعلى سبيل المقارنة ، فإن كمية يدوكائين حقن (0.25 مل) حوالي ربع مبلغ معين عادة لكتلة العصبية في طب الأسنان (0.8 مل إلى 1 مل). بعد إدخال الإبرة ، ولكن قبل حقن المخدر ، والطموح يضمن عدم ضرب الأوعية الدموية. يتم أخذ هذه الاحتياطات على الرغم من أنه من غير المرجح تشريحيا أنه سيتم ضرب سفينة كبيرة بالقرب من السطح الظهري. الشرايين فقط على السطح الظهري ، والشرايين الظهرية لسانية والأوعية الدموية الصغيرة الموجودة في المقام الأول إلى أكثر الخلفي الثالث الأمامي ، حيث حصد الأنسجة يحدث. أكبر الشرايين والأوردة لساني لساني تعمل على السطح البطني لسانه ، بعيدا من المنطقة الظهرية تلقي التخدير ^3. المنطقة 1 سم تخدير يبدو أن شاحب قليلا بالمقارنة مع الأنسجة المحيطة. هذا هو نتيجة لتورم في الأنسجة كما يضغط الأوعية الدموية الصغيرة. بل هو أيضا نتيجة لتأثير مضيق للأوعية من الادرينالين. بعد حوالي دقيقة واحدة ، يتم استخدام مسبار لاختبار المنطقة لخدر. إذا كانت المنطقة لا خدر ، قد تعطى حقنة الثانية (0،1-0،2 مل).

3. اللسان وتقنيات إزالة النتوئات

1. يتم التفاف الربع الأمامي من اللسان من هذا الموضوع في شاش معقم (الشكل 1) ، وعقد في اليد اليسرى للجراح (إذا كان أداء خزعة مع اليد اليمنى). ترك ركن من الشاش مفتوحة لتسمح للجراح لمسح اللسان خالية من اللعاب. يجب أن تعقد اللسان بحزم ، ولكن ، بالطبع ، وليس ذلك لسبب انزعاج لا لزوم لها. يتم وضع طرف السبابة في اليد اليسرى تحت اللسان مباشرة تحت موقع حيث يتم إجراء الخزعة. بالضغط على السبابة إلى أعلى ، يصبح اللسان امتدت أكثر من طرف الاصبع جعل الحليمات التمسك بها لخزعة سهلة.
2. معايير لاختيار الحليمات لخزعة : حليمات التذوق يمكن تمييزها بسهولة من الحليمات filliform المحيطة التي شكلها وحجمها. كمئي الحليمات مستديرة ومعزولة نوعا ما عن المناطق المحيطة. في جوارها المباشر هناك مساحة دائرية خالية من الحليمات filliform (الشكل 2A ، السهام الزرقاء). هذا الفضاء هو حوالي 1 ملم في القطر. ميزة أخرى للتمييز الحليمات كمئي هو تشجر الموسعة الشعرية واضحة على أعلى الحليمات كمئي معظم الشباب من الموضوعات. على الرغم من أن يجعل مكان تشجر كمئي الحليمات أسهل ، فهي ليست بالضرورة جيدة للتنبؤ وجود براعم التذوق في تلك الحليمة. باعتبارها قاعدة واحدة يبدأ الحصاد نحو الواجهة الأمامية ويتحرك بعيدا من طرف اللسان لتجنب أي نزيف شعيري من حجب الموقع لجمع الأنسجة المقبل.
3. مرة واحدة وقد تم التعرف على حليمة حسن ، ربيع الصغير المقص (ماكفرسون - Vannas ، منحنية ، طليعة حادة 5 ملم ، مشط ، والعرض 0.2 ملم طول الحافة الكلي 3 "(RS - 5603 ، Roboz) يستخدم لمقطع تشغيله. على الاستخدام الفعال لمقص الجراحية الدقيقة لا ينبغي للمرء أن استخدام غيض من شفرة لقطع ، بل حتى داخل شفرة ممكن (الشكل 1 ، صورة مكبرة والشكل 3) ، على مقربة من نقطة تقاطع مع شفرة المعاكس. ويتحقق إزالة حليمة مع تحرك القطع واحدة من مقص (الشكل 1). مزيد من داخل فتح شفرات الحليمة استهدفت يبدو ، وأكثر فعالية هو القطع. يجب الحذر من أن الموقف العام للمقص ويجب أن تتوازى مع السطح الظهري للسان.
4. أحيانا يصبح اللسان الجاف والجراح وتحاول تحديد حليمة من أجل إزالة. الجاف مرة واحدة ، وقدرة المشغل لرؤية واضحة وهي حليمة كمئي يصبح أكثر تحديا ويجعل من الانزلاق أكثر من ريش حليمة صعبة للغاية. واللسان الجاف بشكل مفرط وعادة ما يجعل العصا شفرة معدني في اللسان اتخاذ هذه الخطوة الحساسة الجراحية أقل السيطرة عليها. ترك هذا الموضوع وثيق له / لها لعاب الفم ويكون على تماس مع سطح اللسان يساعد في هذه العملية. مفرط اللسان الرطب ليست جيدة سواء. باستخدام زاوية من الشاش ان احد يستخدم لعقد اللسان يساعد في هذه العملية.
5. يتم التعامل مع أي نزيف الشعرية التي لا تحدث من قبل مع النشاف شاش معقم. وعادة ما يتوقف النزيف في غضون دقائق قليلة وutes لا تتداخل مع حصاد الأنسجة الإضافية. لأن حليمات تمتد فوق سطح الظهارية في اللسان ، ويتم إزالة الجزء العلوي فقط 04/03 لحليمة كمئي (الشكل 2B) ، ذلك الجزء من كمئي تظهر براعم الذوق ، ومن المتوقع أن النزيف قليلا.
6. باستخدام ملقط صغير دومون (نوع النقش) ، توضع في إزالة حليمات عازلة مبردة رينغر الأساسية (كلوريد الصوديوم 130 ملم ، 5 ملم بوكل ، 1 ملم CaCl ₂ ، 1 ملم MgCl ₂ ، 1 ملم نا البيروفات ، 20 ملي HEPES - نا ، ودرجة الحموضة 7.2 ؛ osmolality من ~ osmols ملي 305) للتلاعب لاحقة. من الضروري أبدا قرصة الحليمة بين لوحي من الملقط. النسيج لا يزال هشا للغاية وينبغي التعامل معها بحذر شديد.
7. بعد إزالة حليمات ، وهو موضوع لا يزال في مقعد الرئاسة لمدة عشر الى خمس عشرة دقيقة. وقال كل موضوع ليس لدغة على لغتهم تخدير ، ولكن للحفاظ على لغتهم في بقية. وينبغي رصد الموضوعات بصريا من قبل الجراح المعالج. ومن المتوقع أن يزول التخدير في حوالي 30-60 دقيقة. لأن موقع إزالة حليمات قد تكون مؤلمة قليلا بعد الخزعة ، وأوعزوا ليكون على بينة من المواد الغذائية (درجة الحرارة) حار أو الساخنة ، والمشروبات الغازية أو المشروبات التي هي إما شديدة البرودة أو الساخنة. وترد إشارة أخرى إلى أن أي مواد تلوين طفيف المحمر من اللعاب أمر طبيعي ، وسوف تتوقف عند انحلال الجلطة.
8. وينظر إلى الموضوعات التالية 30-40 يوما إزالة حليمات للتقييم من الموقع ، حيث تمت إزالة حليمات. وينبغي قبل هذا الوقت حليمات الذوق ومجدد بالكامل.

5. ممثل النتائج

ويمكن استخدام النسيج المجمعة لالمناعية ، RT - PCR ، التهجين في الموقع ، والتصوير الكالسيوم ، لقط التصحيح وزراعة الأنسجة. عندما يقوم بشكل صحيح ظهور الحليمات يتمتعون بصحة جيدة المظهر ، أبيض ، حول 0،5-1 ملم وقطرها (الشكل 2B).

تتم معالجة الحليمات التي جمعت لالمناعية على أساس البروتوكولات القائمة ونشرها ^4. يظهر برعم تذوق نموذجية من الحليمة طعم paraformaldehide ثابتة في الشكل 4A.

ويمكن أيضا أن يعامل الخزعة الحليمات إنزيمي ⁵ الى تحقيق تفكك خلايا براعم التذوق. بعد تفكك الأنزيمية ، ويمكن المحافظة على الخلايا لمدة تصل إلى 4 ساعات في طبق بتري في ترطيب 4C. ويمكن في هذه الحالة يمكن استخدامها لPCR خلية واحدة (الشكل 4B) ، CA - التصوير ، الخ.

الخلايا تظهر مجموعة متنوعة من الأشكال ، وكثير يجري مرهف والقطبين (الشكل 5A و 5B) كما هو متوقع من طعم الخلية برعم. عند جمع خلايا أو القيام الكالسيوم والتصوير ، وبعد حوالي 20 دقيقة تحت المجهر ، وتبدأ الخلايا لتطوير أفكارك الفقاعات (الشكل 6A و 6B والسهام) ، والكثير منهم أصبح الجولة. باستخدام تقنية طورت في المختبر ، تم القبض على الخلايا بشكل فردي باستخدام التصحيح ، ماصة ، كما هو مبين في الشكل 5A و 5B.

كما ذكر أعلاه ، لتنمو حليمات تبدأ بعد 5 إلى 8 أسابيع. 7A الرقم يدل على مظهر اللسان حيث تم إزالة 8 كمئي حليمات اللسان من الجانب الأيسر وهو متطوع في استخدام أي تخدير. 8 إشعار بقع حمراء طفيفة ، حيث تم إيقاف مقصوص على حليمات. لوحظ عدم وجود نزيف بعد الجراحة. لقد التقطت الصورة الحالية بعد 10 دقائق من الخزعة. 7B الرقم هو صورة عن لسان الموضوع نفسه شهدت 40 يوما بعد الخزعة. وقد لاحظ جميع الحليمات بإعادة تنمية. لتحديد ما إذا كان الحليمات مجدد وظيفية طلبنا من المتطوعين لدينا من أجل الاتفاق على خزعة الثانية ضمت في الحليمات نفسه بالضبط. للتعرف بشكل صحيح الحليمات المناسبة كنا نخطط لإعادة الحصاد ، ولدت لدينا شبكة (الشكل 7C) الذي يناسب الحليمات 8 التي تم إزالتها في المقام الأول ، وفرضه هو على لسان المتطوع نفسه بعد 40 يوما آخر خزعة الأولي . بمساعدة من كفاف اللسان والمسافة من الهامش إلى الشبكة ، التي تم تحديدها مرة واحدة ، قمنا بإزالة عدد قليل من الحليمات بالضبط نفس وتجهيزها لهم لالمناعية. الشكل 4A هي واحدة من هذه الحليمات. إشعار الخطوط العريضة لبراعم التذوق (باللون الأصفر) ، وتلطيخ لimmunopositive Cβ2 فسفوليباز (PLCβ2) ، خلية نوع طعم 2 تنبيغ المرتبطة الانزيم. هذه المعطيات تثبت أن استخدام هذا الإجراء كما هو موضح هنا خزعة ، والحليمات كمئي تجديد بما فيه الكفاية قبل 40 يوما لدينا أيضا في مكان من المرجح براعم الذوق وظيفية.

الشكل 1. يتم التفاف الربع الأمامي من اللسان من هذا الموضوع في شاش معقم ، وعقدت في اليد اليسرى من الجراح. يجب أن تعقد اللسان بحزم. صورة الموسع على الحق ويبين الموقف الصحيح من المقص وموقف حليمة فيما يتعلق النصل.

201/2201fig2.jpg "بديل =" الشكل 2 "/>
الشكل 2. (أ) ترد كمئي الحليمات مع الأسهم الزرقاء. هذه الجولة هي هياكل معزولة نوعا ما عن المناطق المحيطة بها والمناطق المجاورة لها وجود مسافة دائرية خالية من الحليمات filliform. (ب) حليمة طعم كمئي على غيض من الربيع الدقيقة مقص ثانية بعد إزالته.

الشكل 3. النفس خزعة من الحليمة كمئي باستخدام مرآة والتخدير لا. وأقحم يوضح الموقف العام للمقص ، والتي يجب أن تكون متوازية مع السطح الظهري للسان. إذا فعلت بشكل صحيح وatraumatically ، هو تخدير الضائعة من قبل متطوعين جميع تقريبا.

الشكل 4 أ. المناعية لبراعم التذوق. تصور ان حليمة كمئي بواسطة البصريات Nomarski باستخدام الأجسام المضادة لβ2 فسفوليباز والموسومة مع بروتين فلوري الأحمر. وتظهر الخطوط العريضة للبراعم التذوق وعدد قليل من خلايا التذوق المسمى باللون الأصفر.

B. RT - PCR لمستقبلات الطعم المر مرشح ، حمض استشعار ايون القناة 1 (ASIC1). M = علامة. وكانت الممرات من 1 إلى 4 خلية واحدة RT - PCR لASIC1 من أربعة متطوعين مختلفة. بعد جمع وكمئي الحليمات وفصلها إنزيمي ، التقطت خلايا منفردة صعودا وأجريت التعبير عن ASIC1. وكان 2 و 4 حارات التعبير العادي ASIC1.

الشكل 5. التقطت صورة لخلايا ألف طعم واحد حتى يتم باستخدام ماصة التصحيح. زنزانة كبيرة الظهارية مرئيا في الزاوية اليسرى السفلى (5A). اثنين من خلايا الدم الحمراء هي أيضا مرئية فوق ماصة التصحيح وراء الزجاج برميل. الخلية طعم حوالي 3-50 ميكرون طويلة واسعة نحو 6 ميكرون. للإشارة ، خلية الدم الحمراء هو حوالي 7-8 ميكرون في القطر. باء يظهر خلية أخرى مستقبلات التذوق محاط بأربعة الخلايا الظهارية. الخلية يبدو طعم هش.

الشكل 6. صور ألف من الخلايا التي بدأت في تطوير أفكارك الفقاعات (مثل شبح الفقاعات الجولة التي تعلق على خلية الذوق والسهام). لم تعد حصاد خلايا باء عند ظهورها التغييرات كما هو موضح هنا.

الشكل 7. A. عشر دقائق بعد إزالة حليمات الذوق 8 باستخدام أي تخدير. مواقع الجراحية مرئية على شكل بقع حمراء قليلا. ويلاحظ عدم وجود نزيف.
باء اللسان نفسه بعد 40 يوما من الخزعة. إشعار جميع الحليمات مجدد. للمساعدة على تحديد الحليمات إزالتها لبإعادة تنمية ، تم إنشاء شبكة مع الموقع على صورة الجانب الأيمن وتحولت على مدى الحليمات مجدد على الصورة الجانب الأيسر.
جيم ويبدو أن الحليمات المجددة في المكان نفسه بالضبط. حصاد الحليمات مرة أخرى من هذه المجموعة تليها المناعية أثبتت أن حليمات الذوق الخلايا المجددة الواردة الوظيفية (انظر الشكل 4A).

Discussion

ميزة واحدة بارزة لاستخدام الخلايا البشرية وخصوصيتها. الإجراء الموصوفة هنا بالتفصيل يوفر الأنسجة اللسان لعزل الخلايا مستقبلات التذوق من البشر. ويمكن استخدام هذه الخلايا طعم للدراسات الجزيئية ، والتي تسعى إلى اكتشاف جزيئات هامة للإنتقال المعلومات طعم ، والتصوير للد...

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3"		Roboz Surgical Instruments Co., Inc. Gaithersburg, MD 20898	RS-5603, Roboz
Small Dumont forceps		Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4915, Roboz