Technique pour collecter des fongiformes (goût) Papilles de la langue de l'homme

Résumé

La connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents de transduction gustative a récemment connu des avancées significatives, en grande partie due à l'utilisation de modèles animaux. Cependant, la grande diversité de la sensibilité gustative et la spécificité des études de mammifères justifie dans les tissus humains. Nous décrivons une technique de biopsie pour collecter les cellules gustatives de vie des papilles sur la langue humaine.

Résumé

Le sens du goût est essentiel pour la vie humaine. Il informe l'organisme sur la qualité des aliments qui seront potentiellement ingérée et stimule les processus métaboliques qui préparent le tube digestif pour la digestion. Des progrès constants ont été accomplis vers la compréhension des événements précoces biochimiques et moléculaires sous-jacents transduction du goût (pour une revue, Breslin et Spector, 2008 ^1). Toutefois, les progrès à ce jour a largement résulté de modèles animaux. Pourtant, depuis des différences marquées dans la spécificité du récepteur et de la densité des récepteurs varient selon les espèces, transduction du goût humaine ne sera compris en utilisant des tissus humains goût. Nous décrivons ici une technique de biopsie à recueillir humaine fongiformes papilles, visibles comme arrondies roses structures antérieures, d'environ 0,5 mm de diamètre qui contiennent les papilles. Ces papilles sont biopsiés utilisées à plusieurs fins, y compris l'isolement de cellules viables papilles, l'hybridation, l'immunohistochimie in situ et, grâce à des techniques de biologie moléculaire, l'identification de nouvelles protéines goût spécifique.

Protocole

1. Introduction et considérations générales

La procédure générale consiste anesthésie locale d'une petite taille (1 cm ²⁾ aire de la surface dorsale de la langue antérieure, suivie par l'élimination d'un nombre (6-8) du fongiformes (goût) papilles de cette région anesthésiée à l'aide d'un ressort courbée micro -ciseaux (McPherson Vannas tapez # SR 5603, Roboz, Rockville, MD). Les papilles sont retirés fongiformes d'environ 0,25 mm ³ chacun. Il ya très peu non papilles (goût) des tissus épithéliaux enlevés avec chaque papille. Nouveau formulaire de papilles dans ce domaine après 3 à 5 semaines et reprendre le fonctionnement papilles (Spielman et Brand, observations non publiées). Il n'ya pas d'effet notable sur le goût ou la saveur de la nourriture après le retrait de cette petite quantité de matériel de goût. À partir d'études qui ont compté papilles individuels dans la langue humaine adulte, il peut estimer que la langue humaine contient environ 5000 papilles. Notre procédure supprime la plupart de 20 à 25 de ces papilles (en moyenne, de 3,5 à 4 ~ papilles fongiformes par la papille chez l'homme) ^2, soit environ 0,4% du total. En outre, il n'ya pas de douleur associée à la perte chirurgicale de ce tissu. On sent, bien sûr, une légère douleur au site d'injection seulement, comme l'aiguille pénètre dans la langue. Après l'anesthésie a cessé, il ya un malaise parfois doux pour moins d'une journée, mais ce malaise est beaucoup moins que ce que l'on éprouve après avoir accidentellement "mordre" la langue petits.

Au cours des dernières années nous avons développé une procédure alternative qui ne comprend pas d'anesthésie. La technique de prélèvement de tissus est identique pour les deux. La seule différence dans la procédure est que le chirurgien n'est plus confiné à une zone de 1 cm de diamètre ^2, où l'anesthésie a été adressée. Plutôt il / elle peut choisir n'importe quel site à la surface dorsale de la langue où les papilles saillantes apparaissent. Le nombre total des papilles enlevés sont limités à 6-8 dans les deux techniques, avec ou sans anesthésie Si effectué correctement, la gêne d'enlever 6-8 papilles gustatives fongiformes est considéré comme moins d'un problème par rapport à la douleur associée à l'administration de anesthésie locale Une étude générale des personnes qui ont subi les deux procédures, c'est à dire, avec et sans anesthésie, a montré que l'écrasante majorité des sujets qui se dispenser sans anesthésie locale dans tous les biopsies avenir. Le chirurgien qui a développé cette technique (AIS) et plusieurs de ses collègues a enseigné par l'auteur qui a effectué des biopsies sans anesthésie, l'ai essayé sur eux-mêmes et témoignent que l'inconfort est temporaire et est considérée comme inférieure à celle de sa langue de mordre. Enfin, des dizaines de personnes qui ont accepté de faire une biopsie a été demandé s'ils seraient prêts à essayer de l'enlèvement d'une papille sans anesthésie et si elles le jugent à être trop douloureux qu'ils subissent une anesthésie, ont tous accepté de continuer avec le retrait des papilles, sans anesthésie.

L'ensemble de la biopsie ne doit pas prendre plus de 5-10 minutes. Si l'anesthésie est employée encore 2-3 minutes est ajoutée. La biopsie est généralement effectuée dans la matinée. Avant la biopsie, les bénévoles sont chargés de manger un repas léger deux heures avant l'heure prévue. A la biopsie, écrit le consentement éclairé est obtenu. Les critères d'exclusion au moment de la biopsie comprennent ceux avec une maladie chronique grave, que ce soit contrôlée par des médicaments ou non (par exemple, toute maladies gastro-intestinales, les maladies neurodégénératives, cancers, troubles sanguins, allergies aux anesthésiques locaux, etc) ceux avec une fréquence cardiaque supérieure à 100 ou inférieur à 60; pression artérielle systolique supérieure à 145 ou inférieur à 100; pression artérielle diastolique supérieure à 90 ou inférieur à 60, et l'avis du chirurgien que le sujet peut participer à l'étude.

Enfin, il est important de considérer que la procédure de biopsie doit être réalisée dans le même établissement où les tissus seront traitées à l'examen depuis l'intégrité des tissus est rapidement perdu comme nous avons souvent noté par la baisse de la qualité de l'ARNm. Afin de minimiser ces problèmes, les tissus langue devrait être traitée le plus rapidement possible.

2. Préparation Sujet

1. Le sujet est assis dans un fauteuil de dentiste ou d'un siège avec appui-tête.
2. Vérifier le rythme cardiaque et la pression artérielle au moment de la biopsie. Si la chute objet hors de la plage de la pression artérielle, rythme cardiaque ou la compétence orale, le chirurgien recommande à ce sujet qu'il / elle prendre rendez-vous immédiat à voir un médecin.
3. Inspectez la cavité buccale pour la santé des tissus en général, avec une attention aux indicateurs de la xérostomie, langue géographique ou de toute lésion langue. Tout sujet présentant des signes de maladies bucco-dentaires, y compris la langue ou de lésions xérostomie sont exclus de l'étude. Demandez le sujet pour se rincer la bouche avec de l'eau pour enlever tous les débris du Cavit oraley. Si nécessaire, la langue est nettoyé avec un racloir langue jetables pour enlever la plaque ou de débris, qui pourraient être menées dans la langue lors de l'injection de l'anesthésie. Le chirurgien utilise des tampons de gaze stérile dans une main gantée de tenir le ¼ antérieure de la langue car elle s'étend de la cavité buccale.
4. Si l'anesthésie est utilisé, une seringue à tuberculine 1cc avec une jauge de 28 x ½ 'aiguille contenant 0,25 mL de lidocaïne (2%) avec épinéphrine (1/100.000) est injecté lentement dans un site juste en dessous de la surface dorsale de la partie antérieure de la langue . Le site d'anesthésie est distale au site de collecte pour éviter les interférences par l'lidocaïne avec des études ultérieures. A titre de comparaison, le montant de la lidocaïne injectée (0,25 ml) est d'environ un quart de la quantité normalement donnée pour le bloc du nerf dans les procédures de soins dentaires (0,8 ml à 1 ml). Après insertion de l'aiguille, mais avant l'injection de l'anesthésique, l'aspiration assure qu'aucun vaisseau sanguin est frappé. Cette précaution est prise, même si elle est anatomiquement peu probable qu'un grand navire sera frappé près de la surface dorsale. Les artères seulement sur la surface dorsale, les artères dorsales multilingues sont des petits vaisseaux sanguins situés principalement aux plus postérieure le tiers antérieur, où la récolte des tissus se produit. Les grandes artères et les veines lingue lingue fonctionner sur la surface ventrale de la langue, loin de la zone dorsale recevant anesthésie ^3. La zone 1 cm anesthésiés semble être légèrement pâles comparés avec le tissu environnant. Cela est dû au gonflement des tissus car il compresse les petits vaisseaux sanguins. Il est également due à l'effet vasoconstricteur de l'adrénaline. Après environ une minute, une sonde est utilisée pour tester la zone d'engourdissement. Si la zone n'est pas engourdi, une deuxième injection (0,1 à 0,2 ml) peut être donné.

3. Langue technique de retrait Papilles

1. Le quart antérieur de la langue du sujet est enveloppé dans une gaze stérile (Figure 1) et tenu dans la main gauche du chirurgien (si vous effectuez la biopsie avec la main droite). Un coin de la gaze est laissé ouvert pour permettre au chirurgien d'essuyer la langue libre de salive. La langue doit être maintenu fermement, mais, bien sûr, pas au point de causer une gêne inutile. La pointe de l'index de la main gauche est placée sous la langue directement sous l'endroit où la biopsie est réalisée. En poussant l'index vers le haut, la langue devient tendue sur la pointe du doigt les papilles faisant tenir le coup pour faciliter la biopsie.
2. Critères de choix pour les papilles biopsie: papilles gustatives sont facilement identifiables à partir des environs papilles filliform par leur forme et leur taille. Fongiformes papilles sont ronds et un peu isolé du environnantes. Dans leur voisinage immédiat il ya un espace circulaire dépourvue de papilles filliform (figure 2A, flèches bleues). Cet espace est d'environ 1 mm de diamètre. Une autre caractéristique distinctive des papilles fongiformes est une arborisation étendue capillaires visibles sur le dessus de papilles fongiformes plupart des sujets jeunes. Bien arborisation papilles fongiformes rend la localisation plus facile, ils ne sont pas nécessairement de bons prédicteurs de l'existence de papilles dans cette papille. Comme une règle commence la récolte vers l'extrémité avant et s'éloigne de la pointe de la langue afin d'éviter tout saignement capillaire de masquer le site de la collection de tissus prochaine.
3. Une fois une papille bonne a été identifiée, un ressort de micro-ciseaux (McPherson Vannas, courbes, affûtée 5 mm, peigne, la largeur pointe de 0,2 mm Longueur de 3 "(RS-5603, Roboz) est utilisé pour le clip off. Pour utiliser efficacement les ciseaux micro chirurgie on ne doit pas utiliser la pointe de la lame pour couper, mais plutôt, autant à l'intérieur de la lame que possible (figure 1, l'image agrandie et figure 3), à proximité du point d'intersection avec la lame opposée. Retrait de la papille est réalisé avec un mouvement de coupe des ciseaux (figure 1). Le plus à l'intérieur des lames ouverte la papille ciblée apparaît, le plus efficace est la coupe. Il faut prendre soin que la position globale des ciseaux doit être parallèle avec la surface dorsale de la langue.
4. Parfois, la langue devient sèche que le chirurgien tente d'identifier une papille pour l'enlèvement. Une fois sèche, la capacité de l'opérateur de voir clairement ce qui est une papille fongiformes devient plus difficile et fait glisser des lames plus la papille très difficile. Une langue trop sec rend généralement le bâton de lame de métal à la langue faire le déplacement chirurgicale délicate moins contrôlable. Laisser le sujet fermer son / sa bouche et la salive ont été en contact avec la surface de la langue contribue à ce processus. Excessivement langue humide n'est pas bon non plus. Avec l'angle de la gaze que l'on utilise pour maintenir la langue contribue à ce processus.
5. Tout saignement capillaire qui se produit est traité en tamponnant avec de la gaze stérile. Saignement généralement s'arrête à quelques min Utes et ne pas interférer avec la récolte des tissus supplémentaires. Parce que les papilles s'étendre au-dessus de la surface épithéliale de la langue, et seuls les 3 / 4 supérieurs d'une papille fongiformes est enlevée (figure 2B), cette partie de la fongiformes montrant les papilles, peu de saignement est attendue.
6. En utilisant une petite pince Dumont (type de modèle), les papilles sont retirés placés dans un tampon de Ringer réfrigérée base (130 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 _mM de CaCl2, MgCl2 1 _mM, 1 mM de Na-pyruvate, 20 mM HEPES-Na , pH 7,2; osmolalité de ~ 305 milli osmols) pour des manipulations ultérieures. Il est impératif de ne JAMAIS pincer la papille entre les pales d'un forceps. Le tissu est très fragile et doit être manipulé avec un soin extrême.
7. Après le retrait des papilles, le sujet reste dans la chaise pendant dix à quinze minutes. Chaque sujet est dit de ne pas mordre sur sa langue anesthésiée, mais de garder leur langue au repos. Les sujets doivent être contrôlé visuellement par le chirurgien traitant. L'anesthésie est prévue à s'user dans environ 30-60 minutes. Parce que le site de l'enlèvement des papilles peut être légèrement douloureux après la biopsie, ils sont instruits d'être conscient de épicés ou chaud (température) des aliments, les boissons gazeuses ou des boissons qui sont soit extrêmement froides ou chaudes. Une autre indication est donnée à des sujets que toute légère coloration rougeâtre de la salive est normal et cessera lors de la dissolution du caillot.
8. Les sujets sont vus 30-40 jours après l'enlèvement des papilles pour l'évaluation du site où les papilles ont été enlevés. Par ce temps de papilles gustatives devraient avoir complètement régénérée.

5. Les résultats représentatifs

Tissu collectées peuvent être utilisées pour l'immunohistochimie, la RT-PCR, hybridation in situ, imagerie calcique, patch clamp et la culture des tissus. Quand elle est réalisée correctement l'aspect de la papille sont d'apparence saine, blanche, environ 0,5-1 mm de diamètre (figure 2B).

Papilles recueillies pour l'immunohistochimie sont traitées sur la base existante et publié protocoles ^4. Un bourgeon goût typique d'une papille goût paraformaldehide-fixe est montré dans la figure 4A.

Papilles biopsie peut aussi être traité enzymatiquement ⁵ pour atteindre la dissociation des cellules papilles. Après la dissociation enzymatique, les cellules peuvent être maintenues jusqu'à 4 heures dans un plat de Pétri humidifié à 4C. Dans cet état, ils peuvent être utilisés pour la PCR seule cellule (figure 4B), Ca-imagerie, etc

Les cellules montrent une variété de formes, dont beaucoup sont minces et les troubles bipolaires (figure 5A et 5B) comme on peut s'y attendre d'une cellule de papilles. Lors de la collecte des cellules ou effectuer Ca-imagerie, après environ 20 minutes sous un microscope, les cellules commencent à se développer bulles apoptotique (figure 6A et 6B, flèches) et plusieurs d'entre eux deviennent ronds. En utilisant une technique développée dans notre laboratoire, les cellules ont été pris individuellement à l'aide d'un patch-pipette, comme le montre la figure 5A et 5B.

Comme mentionné ci-dessus, les papilles commencent à repousser après 5 à 8 semaines. La figure 7A montre l'apparition d'une langue où les papilles fongiformes 8 ont été retirés du côté gauche la langue d'un volontaire en utilisant aucune anesthésie. Avis 8 légères taches rougeâtres, où les papilles sont hors ciselée. Aucun saignement est observée après la chirurgie. L'image actuelle a été prise 10 minutes après la biopsie. La figure 7B est une image de la langue du même sujet vu 40 jours après la biopsie. Notez toutes les papilles ont repoussé. Pour déterminer si les papilles régénérés sont fonctionnels, nous avons demandé notre bénévole à accepter une deuxième biopsie impliquant les papilles exactement les mêmes. Pour identifier correctement les papilles appropriés nous avions prévu de ré-récolte, nous avons généré une grille (figure 7C) qui correspond à la papille 8 qui ont été enlevés en premier lieu et c'est en surimpression sur la langue du volontaire même après 40 jours après la première biopsie . Aidé par le contour de la langue et la distance de la marge à la grille, une fois identifiés, nous avons supprimé quelques-uns des papilles exactement le même et les traités pour l'immunohistochimie. Figure 4A est une de ces papilles. Remarquez le contour d'un bourgeon du goût (en jaune) et la coloration des immunopositives phospholipase Cβ2 (PLCβ2), une cellule de goût de type 2 transduction associée enzyme. Ces données démontrent que l'utilisation de la biopsie comme décrit ici, les papilles fongiformes régénérer suffisamment par 40 jours d'avoir également mis en place susceptible papilles fonctionnelle.

Figure 1. Le quart antérieur de la langue du sujet est enveloppé dans une gaze stérile et tenu dans la main gauche du chirurgien. La langue ne doit être tenu fermement. L'image agrandie à droite montre la position correcte de la paire de ciseaux et de la position de la papille par rapport à la lame.

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Figure 2. (A) fongiformes papilles sont indiqués par des flèches bleues. Ce sont des structures rondes quelque peu isolé de son environnement et dans leurs environs immédiats il ya un espace circulaire dépourvue de filliform papilles. (B) papilles fongiformes goût sur le bout du ressort des micro-ciseaux secondes après qu'il a été enlevé.

Figure 3. Auto biopsie d'une papille fongiformes utilisant un miroir et sans anesthésie. L'encart montre la position globale de la paire de ciseaux, qui doit être parallèle à la surface dorsale de la langue. Si c'est fait correctement et de façon atraumatique, l'anesthésie sont abandonnées par pratiquement tous les bénévoles.

Figure 4 A. L'immunohistochimie d'un bourgeon du goût. Un papilles fongiformes visualisé par une optique Nomarski utilisant des anticorps à la phospholipase β2 et étiqueté avec la protéine fluorescente rouge. Le contour du bourgeon du goût et de quelques cellules goûts marqués sont indiqués en jaune.

B. RT-PCR d'un récepteur du goût candidat aigre, acide Sensing Ion Channel 1 (ASIC1). M = marqueur. Les pistes 1 à 4 ont été seule cellule RT-PCR pour ASIC1 de quatre volontaires différents. Après la collecte, fongiformes papilles ont été dissociées enzymatiquement, les cellules individuellement, ramassé et l'expression de ASIC1 ont été faites. Pistes 2 et 4 avaient une expression normale des ASIC1.

Figure 5. A. Image de cellules goût unique étant ramassés à l'aide d'une pipette de patch. Une cellule épithéliale grande est visible dans le coin inférieur gauche (5A). Deux globules rouges sont également visibles au-dessus de la pipette de patch et derrière le cylindre en verre. La cellule de goût est d'environ 30-50 microns de long et environ 6 microns de large. Pour référence, un globule rouge est d'environ 7-8 microns de diamètre. B. montre une autre cellule récepteurs gustatifs entourée de quatre cellules épithéliales. Les cellules gustatives paraît claire.

Figure 6. Images A. de cellules qui ont commencé à développer des bulles apoptotique (fantôme comme des bulles rondes attaché à la cellule goût, flèches). Cellules B. ne sont plus récoltées lorsque leur apparence change comme indiqué ici.

Figure 7. A. Dix minutes après le retrait de 8 papilles gustatives en utilisant aucune anesthésie. Les sites chirurgicaux sont visibles comme des taches légèrement rougeâtre. Aucun saignement est remarqué.
B. La même langue 40 jours après la biopsie. Notez toutes les papilles régénérée. Pour aider à identifier les papilles enlevé que repoussé, une grille a été créé avec le site sur l'image à droite et décalé sur les papilles régénérée sur l'image à gauche.
C. Les papilles régénérée paru dans exactement au même endroit. La récolte des papilles de nouveau de ce groupe suivi par immunohistochimie ont démontré que les papilles régénérée contenues cellules gustatives fonctionnelle (voir figure 4A).

Discussion

Un avantage notable à partir de cellules humaines est leur spécificité. La procédure décrite ici en détail fournit des tissus langue pour l'isolement de cellules réceptrices de goût d'êtres humains. Ces cellules du goût peut être utilisé pour des études moléculaires, cherchant à découvrir des molécules importantes pour la transduction des informations goût, et pour les études d'imagerie calcique qui surveillent l'activité des cellules du goût à des stimuli. En outre, les tissus lang...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3"	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5603, Roboz
Small Dumont forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4915, Roboz