يعاير β اميلويد السمية باستخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس النموذجي

Summary

الدودة الخيطية درس مكثف انواع معينة ايليجانس المهندسة transgenically للتعبير عن الإنسان β اميلويد ببتيد (Aβ). المستحث في التعبير عن Aβ C. ايليجانس العضلات يؤدي إلى السريع ، والنمط الظاهري استنساخه الشلل التي يمكن استخدامها لرصد العلاجات التي تعدل سمية Aβ.

Abstract

ويعتقد عموما تراكم الببتيد β اميلويد (Aβ) ليكون أساسيا في تحريض مرض الزهايمر ، ولكن الآلية ذات الصلة (ق) من السمية لا تزال غير واضحة. يترسب ايضا Aβ عضليا في العضل الهيئة إدراج ، وهو عضلي حاد الإنسان. يمكن أن تكون الدودة الخيطية ايليجانس انواع معينة درس مكثف المهندسة transgenically Aβ للتعبير عن الإنسان. بالاعتماد على الأنسجة أو توقيت التعبير Aβ ، يمكن الديدان المعدلة وراثيا والظواهر التي يمكن قياسها بسهولة بمثابة قراءة للخروج من سمية Aβ. على سبيل المثال ، والديدان وراثيا مع التعبير Aβ عموم العصبية جود عيوب هو التعلم النقابي (دوسانيه وآخرون 2009) ، في حين الديدان المعدلة وراثيا مع التأسيسية التعبير محددة العضلات تظهر تدريجيا ، والسن التي تعتمد على النمط الظاهري الشلل (لينك ، 1995 ؛ كوهين وآخرون 2006). جيم واحدة مفيدة بشكل خاص ايليجانس نموذج توظف طفرة حساسة للحرارة في mRNA نظام مراقبة لدرجات الحرارة مهندس محرض التعبير العضلات من التحوير Aβ ، مما أدى إلى النمط الظاهري الشلل استنساخه على التروس درجات الحرارة (وصلة وآخرون 2003). العلاجات التي سمية Aβ العداد في هذا النموذج [على سبيل المثال ، التعبير عن التحوير واقية (حسن وآخرون 2009) أو التعرض لالجنكه بيلوبا مقتطفات (وو وآخرون 2006)] بتكاثر تغيير معدل الشلل الناجم عن الحرارة التروس هذه المعدلة وراثيا الديدان. هنا نحن لدينا وصف بروتوكول لقياس نسبة الشلل في هذا جيم المعدلة وراثيا ايليجانس النموذج ، مع إيلاء اهتمام خاص للمتغيرات التجريبية التي يمكن أن تؤثر على هذا القياس.

Protocol

1) إعداد النيماتودا نمو وسائل الإعلام لوحات لفحص الشلل.

وتجرى فحوصات الشلل على نمو النيماتودا القياسية لوحات (NGM) تستخدم بشكل روتيني وسائل الإعلام لجيم ايليجانس الانتشار وعلم الوراثة (Stiernagle ، 2006).

1. الأوتوكلاف الحل NGM تحتوي على كلوريد الصوديوم ، وآجار ببتون في دورق مخروطي وإضافة كميات مناسبة من CaCl العقيمة ₂ ، يوراسيل ، الكولسترول ، MgSO ₄ و 1M 1M KPO _4. قسامة 10 مل من السائل في كل NGM 60 ملم × 15 ملم طبق بيتري. السماح لترسيخ NGM بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
2. إذا كان اختبار للآثار مركبات / مقتطفات ، قسامة في كل لوحة على استخراج واستخدام رش لتوزيع متساو للاستخراج على سطح اللوحة. السماح لاستخراج الجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. وأحجام أكثر من 1 مل تتطلب المزيد من الوقت لتجف.
3. كل لوحة البقعة مع 250 ميكرولتر من E. القولونية OP5O سلالة نمت في وسائل الإعلام LB بين عشية وضحاها لكثافة بصرية من 0،4-0،6. تسمح للبكتيريا لتجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

المتغيرات ذات الصلة

سن لوحات له تأثير كبير على مقايسة الشلل ، كما أقدم لوحات تميل إلى أن تجف. صب لوحات استخدام في غضون أسبوع من مقايسة الشلل. لنتائج مثالية ، صب لوحات 3-4 أيام قبل بدء السكان دودة متزامن [انظر : (2) أدناه]. عن أي تجربة ، فقط استخدام لوحات تدفقت من نفس الدفعة.

وسوف يغير حجم العشب (أي رصدت مقابل انتشار) و / أو نوع من البكتيريا أيضا تغيير سلوك الديدان. يمكن إجراء فحوصات الشلل باستخدام بديل E. سلالات بكتيريا كمصدر للغذاء (مثل السلالة المستخدمة في تغذية HT115 التجارب رني) ، ولكن هذا لا يمكن تغيير حركية من الشلل ، مما يتطلب وضع ضوابط داخلية ملائمة.

2) إعداد بالسكان دودة السن متزامن

CL4176 سلالة (SMG - 1 (cc546 ^TS) الأول ؛ dvIs27 [ميو - 3 / Aβ ​​minigene + رول - 6 الجين علامة (su1006)] X هو الأكثر استخداما لمعايرة Aβ الشلل الناجم عن هذه السلالة المعدلة وراثيا والنماذج الأخرى المتاحة. إلى الباحثين الأكاديميين لقاء رسم رمزي من مركز علم الوراثة انواع معينة (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. لتعظيم التزامن العمري للسكان اختبار فمن الأفضل أن تبدأ مع جيل الآباء متزامنة. قبل اسبوع من بدء الفحص الشلل من السكان اختبار ، واستخدام منتقي الدودة البلاتين لنقل 20-30 حامل البالغين على عدة لوحات NGM 10 سم مع انتشار OP50 عن البيضة 2 ساعة في وضع 16 درجة مئوية (درجة حرارة متساهلة للCL4176 ). إزالة حامل البالغين والسماح للنسل لتنمو لمدة 7 أيام ، وهو الوقت الذي سوف يكون "اليوم الثاني" البالغين حامل.
2. (يوم 1) وتستخدم الكبار اليوم الثاني حامل لإعداد السكان اختبار العمر متزامن. لكل حالة الكائن التجريبي لتوليد ثلاث نسخ لوحات تحتوي على 50-75 سن متزامن مع الديدان. استخدام البلاتين منتقي الدودة ، ونقل 10-12 من البالغين 2 يوم 60 ملم على حامل (10 مل الحجم) لوحات NGM رصدت مع OP50. السماح للديدان لوضع البيض على 16 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، ثم اختيار قبالة البالغين والسماح فقس البيض وتنمو بمعدل 16 درجة مئوية. عند هذه النقطة فمن الأفضل أن يكون هناك شخص لن تكون لوحات تسجيل لرمز لهم ، لذلك سيكون هداف الأعمى للظروف تجريبية.

المتغيرات ذات الصلة

مرحلة التطور الجنيني عندما يتم وضع البيض (~ مرحلة 26 خلية للديدان نوع البرية تحت الظروف المثلى) هي وظيفة من سن البلوغ والتغذية. إذا كان الكبار حامل المستخدمة في إعداد واختبار السكان هم من كبار السن أو جوعا ، سيتم وضع البيض مرحلة لاحقة ، مما يقلل من التزامن العمري للسكان واستنساخ حركية الشلل. لا بد من أحادية ممحوضة (أي ، فقط OP50 البكتيريا) تستخدم الثقافات (الملوثات الجرثومية يمكن أن تؤثر بشدة على هذا الاختبار) ، واستنساخ هو أعلى إذا كان لديك أرقام لوحات ثلاث نسخ مماثلة من الديدان.

3) والتحوير التعريفي الفحص الشلل

1. (اليوم 3) لوحات التروس إلى 25 درجة مئوية بعد 48 ساعة من نهاية متزامن وضع البيض ؛ الديدان وينبغي في هذه المرحلة اليرقات الثالث (L3). وينبغي تنظيم لوحات دون التراص في الحاضنة 25 درجة مئوية للسماح لجميع لوحات لتصل إلى 25 درجة مئوية في نفس الوقت.
2. (يوم 4) بيغن بتسجيله الشلل من الديدان (سلالة CL4176) في 18-20 ساعة بعد بدء التروس. عند هذه النقطة ، يجب أن تصل إلى جميع الديدان في سكان اليرقات الرابعة (L4) المرحلة. يستمر التسجيل لمدة ساعتين في زيادات حتى يتم شل كل الديدان على كل من لوحات. لأسباب غير معروفة ، والشلل ليست حتى في طول الجسم : منطقة الرأس هو الجزء الأخير من الدودة إلى وقف التحرك. وبالتالي ، ثيمكن orms التي شرعت مؤخرا الشلل لم يترجم عبر لوحة ، ولكن يمكن ان تتحرك رؤوسهم ، ومن ثم تبادل المعلومات حول بكتيريا الأمامي ، وترك "هالة" من البكتيريا تطهيرها. وسوف تصبح هذه الديدان دائما بالشلل التام ، وبالتالي يتم تصنيف الديدان مع هالات كما بالشلل. وبعض الديدان ولكن لم يكن لديك هالات أيضا لن تظهر الحركة العفوية ، ويتم اختبار هذه بواسطة الحث مع لاقط دودة. إذا كان لا يمكن أن دودة حث الخضوع لكامل الجسم موجة الانتشار على الحث ، كما أنه سجل في بالشلل. لتسجيل فعالة ، فمن الأسهل لنقل الديدان بالشلل إلى القطاع غير مرقط من لوحة بحيث أنها لن تكون بدون قصد rescored فترة التسجيل المقبلة. (وهذا ما يسمح أيضا سوء تصنيف الديدان لإظهار الحركة ، والسماح لتصحيح الدرجات).
3. لإنشاء منحنى الشلل ، في كل نقطة زمنية يتم تحويل جزء من الديدان على كل صفيحة التي لم بالشلل إلى نسبة مئوية ، ويتم رسم المتوسط ​​"unparalyzed" النسبة المئوية ضد الزمن من بدء تغيير التروس. (والأساس المنطقي لتآمره في هذه الطريقة هو أن منحنى الناتج هو مماثل رسميا إلى منحنى البقاء ، وبالتالي يمكن تحليلها باستخدام معيار بقاء الإحصاءات غير المعلمية).

المتغيرات ذات الصلة

يجب أن تكون التروس من الديدان myo-3/Aβ المعدلة وراثيا يحدث قبل أن تصل إلى مرحلة منتصف L4 للشلل إلى أن تبدأ ، كما يتم تنظيم وتنمويا - 3 ميو المروج ، وخفضت إلى حد كبير في التعبير L4 في وقت متأخر أو الديدان البالغة. وبالمثل ، تم حظر التعبير عن هذا التحوير إذا أصبحت الديدان جوعا ، ولذلك فمن الضروري أن الديدان التي تتغذى بشكل جيد في كافة مراحل التجربة. نحن لم يلاحظ وجود دودة بالشلل لاستعادة تحت أي ظرف من الظروف ، وبعد 12-16 ساعة من التروس ، وجميع الديدان CL4176 سوف تشل ، حتى لو كانوا downshifted إلى 16 درجة مئوية. في سلالة CL4176 ، upregulation كافية للتعبير التحوير يسبب الشلل يمكن أن يحدث في درجات حرارة منخفضة (أي ، 20-25 درجة مئوية) على الرغم من أن يتم تغيير توقيت الشلل. معدل الشلل يعتمد على سلالة معدلة وراثيا المحددة المستخدمة (لدينا سلالات myo-3/Aβ شيدت مع كل من معدلات أسرع وأبطأ من CL4176) ، وذلك مع سلالات بديلة قد احرز إطار الحاجة إلى تعديلها.

نتائج الممثل 4)

هو مبين في الشكل رقم 1 هو مؤامرة من منحنى لCL4176 الشلل ، وكلاهما غير المعالجة ، ويتعرض ل6.27 ملي الكافيين (تركيز النهائي في لوحة NGM). نتائج هذا العلاج في تأخير كبير إحصائيا في شلل ما يقرب من 4 ساعات ، وهو ما يفسر كمؤشر إلى قمع سمية Aβ في هذا النموذج. هو مبين في الشكل 2 هو تجربة مستقلة يعاير آثار cafestol ، وآخر مركب موجود في القهوة. هذا المخطط هو الحال بالنسبة للعلاجات التي لا تؤثر سمية Aβ. علما أنه في كل التجارب مشلولة حوالي نصف السكان في علاج CL4176 24 ساعة ، والشلل اكتمال بحلول 28 ساعة. هذه هي الأطر الزمنية النموذجية للشلل السكان CL4176 السيطرة. انحرافات كبيرة من هذا التوقيت تدل على تغيير الظروف البيئية أو الحذف التلقائي للنسخ التحوير. (CL4176 يحتوي على مجموعة متكاملة صبغويا المعدلة وراثيا مع نسخ متعددة من التحوير myo-3/Aβ. المعدلة وراثيا على الرغم من أن هذه المجموعة هي عادة مستقرة تماما ، أي انتشار للسلالة في درجات حرارة> 16 درجة مئوية وحدد للديدان النادرة التي خضعت لعملية عفوية حذف الجينات المحورة ، مما أسفر عن المتغيرات التي من شأنها أن خفضت التعبير Aβ والنتائج أبطأ الشلل).

الشكل 1. منحنى الشلل لسلالة CL4176 الديدان غير المعالجة أو المعرضين لمادة الكافيين 6.27 ملي (سيغما) ، وأشار مرة هم من الشروع في تغيير التروس درجات الحرارة. أشرطة الخطأ = SEM

الشكل 2. أشرطة خطأ منحنى الشلل لCL4176 الديدان تتعرض لcafestol 0.48 ملي (سيجما) = SEM

Discussion

ويمكن للبروتوكول وصفناها استخدامها بفعالية لفحص آثار سمية المركبات على Aβ. نشرت الأمثلة تشمل آثار المكونة الجنكه بيلوبا انتزاع (وو وآخرون 2006) وريزيربين (آريا آخرون 2009). كما تم المركبات التي تم واقية ضد سمية Aβ في أنظمة أخرى أظهرت أن تكون وقائية في هذا النموذج (على سبيل المثال ، memantine ، نتائجنا غير منشورة). والأساس المنطقي لإنشاء مهمة هذا النموذج هو أن الأدوات المتطورة الوراثية والجزيئية المتاحة في C. ويمكن استخدام آليات للتحقيق في ايليجانس سمية Aβ. وبالتالي ، يمكن أن يعاير الطفرات آثار محددة على Aβ سمية (على سبيل المثال ، فإن تأثير الحد الذي يشبه الانسولين عن طريق إدخال إشارة DAF - 2 - فقدان وظيفة من الطفرات وفلوريز ، مكلور وآخرون 2007) ، وهذا النموذج يمكن أيضا يمكن استخدامها لدراسة آثار الإفراط في التعبير عن الجينات المحورة (فونتي وآخرون 2008). لقد قمنا مؤخرا الاستخدام الواسع النطاق لهذا النموذج لدراسة الآثار المترتبة على سمية واحدة استبدال الأحماض الأمينية في Aβ (بيانات غير منشورة).

وصف النموذج المعدلة وراثيا هنا المقايسات تأثير التعبير Aβ الحاد على وظيفة الخلايا العضلية. في ذلك الوقت من خلايا العضلات والشلل قسيم عضلي هم سليمة ، والشلل هو النمط الظاهري ليست نتيجة لموت الخلايا العضلية. ومع ذلك ، بعد الشلل (~ 48 ساعة بعد تغيير التروس الأولي) أن هناك توزيعا للسلامة العضلات والموت في نهاية المطاف من الديدان. نحن لم نحقق هذا الغرض المصب التعبير Aβ أو استخدامه كعلامة السمية.

التعبير Aβ نموذج محرض صفها هنا ليست مناسبة للتحقيق في العلاجات التي تعدل تشكيل β اميلويد في حد ذاتها. على الرغم من أن الديدان المعدلة وراثيا مع التأسيسية Aβ شكل التعبير الودائع اميلويد كشفها بسهولة (فاي وآخرون 1998 ؛. رابط وآخرون 2001) ، والديدان وراثيا مع التعبير Aβ محرض ونادرا ما يكون الودائع اميلويد والنمط الظاهري الشلل يظهر مستقلة عن ترسب الأميلويد (دريك وآخرون. 2003). نتائجنا تتفق مع الرأي القائل بأن من السمية الحادة الناجمة عن النتائج التعبير Aβ من تراكم Aβ oligomeric القابلة للذوبان ، وليس ترسب الأميلويد.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
الكواشف	Quantity/2L	الشركة / كتالوج #	تعليقات
كلوريد الصوديوم	6G	سيغما الدريخ / S9888
آغار	40G	سيغما الدريخ / A7002
الببتون مادة تنشأ عن البروتينات	5G	سيغما الدريخ / P0556
DDH 2 O	2L
1M CaCl 2	2mL		147.02mg/mL في DDH 2 O
اليوراسيل	2mL		2mg/mL في DDH 2 O
كولسترول	2mL		5mg/mL في الإيثانول (لا الأوتوكلاف)
1M MgSO 4	2mL		246.5mg/mL في DDH 2 O
1M KPO 4	50mL		98mg KH 2 PO 4. مل ، 48mg K2HPO4/mL في DDH 2 O ، ودرجة الحموضة
قارورة مخروطي		VWR