Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Resumen

El nematodo estudiado intensamente gusano Caenorhabditis elegans Puede ser transgénica para expresar lo humano β-amiloide (Aß). Indujo la expresión de Aß en C. elegans conduce a un fenotipo rápido, parálisis reproducible que puede ser usado para monitorear los tratamientos que modulan la toxicidad de Aß.

Resumen

La acumulación del péptido β-amiloide (Aß) que generalmente se cree que ser central en la inducción de la enfermedad de Alzheimer, pero el mecanismo correspondiente (s) de toxicidad aún no están claros. Aß también se deposita por vía intramuscular en miositis cuerpos de inclusión, una miopatía grave en el hombre. El estudió intensamente nematodo Caenorhabditis elegans gusano puede ser transgénica para expresar Aß humanos. Dependiendo del tejido o momento de la expresión Aß, gusanos transgénicos pueden tener fenotipos fácilmente mensurables que sirven como una lectura de la toxicidad del Aß. Por ejemplo, los gusanos transgénicos con expresión Aß pan-neuronal tienen defectos es el aprendizaje asociativo (Dosanjh y otros, 2009.), Mientras que los gusanos transgénicos con los músculos específicos de expresión constitutiva muestran un progresivo, dependiente de la edad fenotipo parálisis (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Uno particularmente útil C. elegans modelo emplea una mutación sensible a la temperatura en el sistema de vigilancia de ARNm para el ingeniero de la temperatura muscular de expresión inducible de un transgén Aß, lo que resulta en un fenotipo parálisis reproducible en cambio ascendente de la temperatura (Link et al. 2003). Tratamientos que la toxicidad contra Aß en este modelo [por ejemplo, la expresión de un transgén de protección (Hassan et al. 2009) o la exposición a los extractos de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproducible alterar la tasa de parálisis muscular causada por cambios ascendentes temperaturas de estos transgénicos gusanos. A continuación se describe el protocolo para la medición de la tasa de parálisis en el C. transgénicos modelo elegans, con especial atención a las variables experimentales que pueden influir en esta medición.

Protocolo

1) Preparación de los nematodos medios de cultivo para el ensayo de placas de la parálisis.

Los ensayos se llevan a cabo una parálisis en el estándar de crecimiento de los medios de nematodos (NGM) placas de procedimientos que para C. elegans propagación y la genética (Stiernagle, 2006).

1. Autoclave la solución que contiene NaCl NGM, y Agar peptona en un erlenmeyer y añadir las cantidades adecuadas de estéril _de CaCl2, uracilo, colesterol, 1M _MgSO4 y 1M KPO _4. Alícuota de 10 ml de líquido en cada NGM 60 mm x 15 mm placa de Petri. Permitir NGM para solidificar la noche a temperatura ambiente.
2. Si la prueba de los efectos de los compuestos / extractos, alícuota del extracto en cada plato y el uso de un esparcidor para distribuir uniformemente el extracto sobre la superficie de la placa. Dejar que el extracto seco de la noche a temperatura ambiente. Volúmenes de más de 1 mL requerirá más tiempo para secarse.
3. Lugar cada placa con 250 l de E. OP5O coli cepa crecido en medio LB durante la noche para una densidad óptica de 0,4-0,6. Permitir que las bacterias que se seque durante la noche a temperatura ambiente.

Variables relevantes

La edad de las placas tiene un efecto significativo en el ensayo de la parálisis, como placas más viejas tienden a secarse. Use placas de vertido dentro de una semana de ensayo de la parálisis. Para resultados óptimos, verter en las placas de 3-4 días antes del inicio de las poblaciones de gusanos sincrónico [ver (2) más abajo]. Para cualquier experimento, sólo el uso de placas de vertido del mismo lote.

La modificación del tamaño del césped (es decir, visto vs difusión) y / o el tipo de bacteria también modificar el comportamiento de los gusanos. Los ensayos de la parálisis se puede realizar utilizando la alternativa E. coli como fuente de alimento (por ejemplo, la cepa HT115 utilizado en experimentos de alimentación RNAi), pero esto puede cambiar la cinética de la parálisis, por lo que requieren controles internos apropiados.

2) Preparación de las poblaciones de gusanos edad síncrono

Cepa CL4176 (SMG-1 (cc546 ^ts) I; dvIs27 [mio-3 / Aß minigene + rol-6 (su1006) gen marcador] X es más comúnmente utilizado para el ensayo de Aß la parálisis inducida por esta cepa y otros modelos transgénicos están disponibles. a los investigadores académicos por un precio nominal del Centro de Genética Caenorhabditis (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Para maximizar la sincronía edad de la población de prueba, es preferible comenzar con una generación de sincronizar los padres. Una semana antes del inicio de la prueba de la parálisis de la población de prueba, utilice un selector de gusano de platino para la transferencia de 20 a 30 adultos grávidas en varias placas de 10 cm NGM se extendió con OP50 por un huevo de dos horas estaba a 16 ° C (la temperatura permisiva para CL4176 ). Retire los adultos grávidas y permitir que la progenie de crecer durante 7 días, momento en el cual se "segundo día" adultos grávidas.
2. (Día 1) Los adultos días grávidas segundos se utilizan para preparar la prueba de las poblaciones de edad sincrónica. Para cada condición experimental el objeto es la generación de placas por triplicado, que contiene 50 a 75 años-sincrónica gusanos. Mediante un selector de gusano de platino, la transferencia de 10 a 12 del día 2 adultos grávidas en 60 mm (10 ml de volumen) NGM placas con manchas OP50. Permitir a los gusanos a poner huevos a los 16 ° C durante 2 horas, y luego escoger de los adultos y permitir que los huevos para incubar y crecer a 16 ° C. En este punto, lo mejor es tener a alguien que no será anotar las placas para el código, por lo que el marcador se ciega a las condiciones experimentales.

Variables relevantes

La etapa del desarrollo embrionario, cuando los huevos son puestos (~ la etapa de 26 células para los gusanos de tipo salvaje en condiciones óptimas) es una función de la edad adulta y la nutrición. Si los adultos grávidas utilizado para la preparación de la población de prueba son mayores o muerto de hambre, los huevos en una etapa posterior se establecerán, la reducción de la sincronía de la edad de la población y la reproducibilidad de la cinética de la parálisis. Es esencial que los mono-axénicos (es decir, sólo OP50 bacterias) los cultivos se utilizan (los contaminantes microbianos pueden afectar seriamente a este ensayo), y la reproducibilidad es mayor si las placas por triplicado tienen números similares de gusanos.

3) transgénica de inducción y de ensayo Parálisis

1. (Día 3) placas de cambio ascendente a 25 ° C 48 horas después del final del huevo sincrónica laicos, los gusanos deben estar en la tercera etapa larvaria (L3). Las placas deben ser dispuestas sin apilar en una incubadora de 25 ° C para permitir que todas las placas hasta alcanzar los 25 ° C, al mismo tiempo.
2. (Día 4) Comience a anotar la paralización de los gusanos (cepa CL4176) a las 18-20 horas después del inicio del cambio ascendente. En este punto, todos los gusanos de la población debería haber llegado a la larva de cuarto (L4) el escenario. Continuar con calificaciones dentro de dos horas hasta que todos los incrementos de los gusanos en cada una de las placas se encuentran paralizados. Por razones desconocidas, la parálisis no es uniforme en toda la longitud del cuerpo: la región de la cabeza es la última parte del gusano dejan de moverse. Por lo tanto, wORM que recientemente han iniciado la parálisis no se puede traducir en la placa, pero se puede mover la cabeza, lo que se allanaba las bacterias en torno a su anterior y dejando un "halo" de las bacterias despejado. Estos gusanos siempre será completamente paralizado, y por lo tanto, los gusanos con halos se clasifican como paralizado. Algunos gusanos no tienen halos, pero tampoco mostrar un movimiento espontáneo, que son probados por pinchar con el selector de gusano. Si un gusano pinchó no pueden someterse a una propagación de onda completa en el cuerpo insistencia, también se anotó como paralizado. Para la puntuación eficiente, es más fácil mover los gusanos paralizados a un sector de la mancha de la placa para que no se involuntariamente rescored el período de puntuación siguiente. (Esto también permite que mal categorizado gusanos para demostrar el movimiento, lo que permite una corrección de puntuación).
3. Para generar una curva de la parálisis, en cada momento la fracción de los gusanos en cada plato que no se han paralizado se convierte en un porcentaje, y el promedio "unparalyzed" porcentaje en función del tiempo desde el inicio del cambio ascendente. (La razón para el trazado de esta manera es que la curva resultante es formalmente análoga a una curva de supervivencia, y por lo tanto pueden ser analizados usando estándares estadística no paramétrica de la supervivencia.)

Variables relevantes

El cambio ascendente de los gusanos transgénicos myo-3/Aβ debe ocurrir antes de que lleguen a la etapa de mediados de L4 para la parálisis que se inició, como el mio-3 es promotor de desarrollo regulado, y ha reducido significativamente su expresión en L4 tarde o gusanos adultos. Del mismo modo, la expresión de este transgén se bloquea si los gusanos se privan, por lo que es esencial que los gusanos están bien alimentados durante todo el experimento. Nunca hemos observado un gusano paralizada a recuperar en cualquier situación, y después de 12-16 horas de cambio ascendente, todos los gusanos CL4176 se paraliza, incluso si son downshifted a 16 ° C. En la cepa CL4176, upregulation suficiente de expresión de los transgenes a causa de la parálisis puede ocurrir a temperaturas más bajas (es decir, 20-25 ° C), aunque el tiempo de parálisis se verá alterada. La tasa de parálisis depende de la cepa específica de transgénicos utilizados (se han construido cepas myo-3/Aβ con tasas más rápido y más lento que CL4176), por lo que con otras cepas de la ventana de puntuación puede ser necesario ajustar.

4) Los resultados representativos

Se muestra en la Figura 1 es un gráfico de una curva de la parálisis de CL4176, tanto sin tratar y se expone a 6,27 mM de cafeína (concentración final en la placa de NGM). Este tratamiento da como resultado un retraso estadísticamente significativa en la parálisis de aproximadamente 4 horas, lo que se interpreta como indicativo de la supresión de la toxicidad del Aß en este modelo. Muestra en la Figura 2 es un experimento independiente analizando los efectos de cafestol, otro compuesto que se encuentra en el café. Este gráfico es típico de los tratamientos que no afectan la toxicidad Aß. Tenga en cuenta que en ambos experimentos alrededor de la mitad de la población no tratada CL4176 están paralizadas a las 24 horas, y la parálisis es completa por 28 horas. Estos son los plazos típicos de la parálisis de control CL4176 poblaciones. Desviaciones significativas de este momento son indicativos de alteración de las condiciones ambientales o la eliminación espontánea de copias del transgén. (CL4176 contiene una amplia transgénicos cromosómicamente integrado con varias copias del transgén myo-3/Aβ. A pesar de esta variedad transgénica suele ser bastante estable, la propagación de la deformación a temperaturas> 16 ° C se selecciona para los gusanos raros que han sufrido un eliminación espontánea de los transgenes, resultando en variantes que se han reducido expresión Aß y más lento resultados parálisis).

Figura 1. Curva de la parálisis de la cepa CL4176 gusanos tratados o expuestos a la cafeína 6,27 mM (Sigma). Los tiempos indicados son desde el inicio del cambio ascendente de la temperatura. Las barras de error = SEM

Figura 2. Curva de la parálisis de CL4176 gusanos expuestos a 0,48 mm cafestol (Sigma). Las barras de error = SEM

Discusión

El protocolo que hemos descrito puede ser utilizado con eficacia para analizar los efectos de los compuestos sobre la toxicidad de Aß. Ejemplos publicados incluyen los efectos de los componentes de extracto de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) y la reserpina (Arya et al. 2009). Compuestos que han sido de protección contra la toxicidad del Aß en otros sistemas también han demostrado tener un efecto protector en este modelo (por ejemplo, la memantina, nuestros resultados no publicados). Una razón importante para el establecimiento de este modelo es que las herramientas bien desarrolladas genéticos y moleculares disponibles en C. elegans pueden ser utilizados para investigar los mecanismos de toxicidad de Aß. Por lo tanto, las mutaciones de los efectos específicos sobre la toxicidad de Aß se puede probar (por ejemplo, el efecto de la reducción de la insulina como la señalización mediante la introducción de un daf-2 la pérdida de la función de la mutación, Florez-McClure et al. 2007), y este modelo también se puede se utiliza para examinar los efectos de los transgenes sobre-expresión (Fonte et al. 2008). Recientemente hemos hecho un amplio uso de este modelo para examinar los efectos sobre la toxicidad de una sola sustitución de aminoácido en Aß (datos no publicados).

El modelo transgénico se describe aquí el efecto de los ensayos de expresión Aß agudos sobre la función de las células musculares. En el momento de las células musculares y parálisis de sus sarcómeros están intactos, el fenotipo de la parálisis no es el resultado de la muerte de las células musculares. Sin embargo, después de la parálisis (~ 48 horas después del cambio ascendente inicial) se produce una ruptura de la integridad del músculo y la eventual muerte de los gusanos. No hemos investigado el efecto aguas abajo de expresión Aß o lo han utilizado como un marcador de toxicidad.

El modelo de expresión inducible Aß se describe aquí no es apropiado para la investigación de tratamientos que modulan la formación de β-amiloide en sí. Aunque los gusanos transgénicos con forma de expresión constitutiva depósitos de amiloide Aß fácilmente detectables (Fay et al, 1998;.. Link et al 2001), los gusanos transgénicos con expresión inducible Aß rara vez tienen los depósitos de amiloide y el fenotipo de la parálisis parece independiente de la deposición de amiloide (Drake et al. 2003). Nuestros resultados son consistentes con la opinión de que la toxicidad aguda inducida por los resultados de Aß expresión de la acumulación de Aß oligómeros solubles, no el depósito de amiloide.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivos	Quantity/2L	Compañía / Catálogo #	Comentarios
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Agar	40g	Sigma-Aldrich / A7002
Peptona	5g	Sigma-Aldrich / P0556
ddH2O	2L
1M CaCl2	2 ml		147.02mg/mL en ddH2O
Uracilo	2 ml		2mg/ml en ddH2O
Colesterol	2 ml		5mg/mL en etanol (no autoclave)
1M MgSO4	2 ml		246.5mg/mL en ddH2O
1M KPO 4	50 ml		98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL en ddH2O, pH
Erlenmeyer		VWR