Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Özet

Yoğun çalışılan bir nematod solucanı Caenorhabditis elegans Transgenically insan β-amiloid peptid (Aβ) ifade etmek için tasarlanmış olabilir. Aβ, İndüklenmiş ifade C. elegans Kas hızlı, tekrarlanabilir felç fenotip Aβ toksisite modüle tedavileri izlemek için kullanılabilecek bir yol açar.

Özet

Β-amiloid peptid (Aβ) birikmesi genellikle Alzheimer hastalığının indüksiyon merkezi inanıyordu, ancak ilgili toksisite mekanizma (lar) hala belirsiz. Aβ da İçerme Vücut Miyozit, ciddi bir insan miyopati intramüsküler yatırılır. Yoğun çalışılan nematod solucan Caenorhabditis elegans transgenically insan Aβ ifade etmek için tasarlanmış olabilir. Aβ ifade doku ya da zamanlama olarak, transgenik solucanlar Aβ toksisite okuma olarak hizmet kolaylıkla ölçülebilir fenotipleri olabilir. Cohen ve ark; Örneğin, Pan-nöronal Aβ ifade ile transgenik solucanlar kurucu kas-özel ifadesi ile transgenik solucanlar ilerici, yaşa bağlı felç fenotip (Link, 1995, kusurlar, ilişkisel öğrenme (. Dosanjh ve ark 2009) 2006). Bir özellikle yararlı C. elegans modeli, tekrarlanabilir bir felç fenotip sıcaklık upshift (Link ve ark 2003) üzerine çıkan bir Aβ transgen sıcaklık indüklenebilir kas ifade mühendisi mRNA gözetim sistemi ısıya duyarlı bir mutasyon istihdam. Bu modelde karşı Aβ toksisite [örneğin, bir koruyucu transgen (Hassan ve ark 2009) ifade Ginkgo biloba ekstreleri (Wu ve ark 2006) maruz kalma] tekrarlanabilir bu transgenik sıcaklık upshift tarafından tetiklenen felç oranı değiştiren tedaviler solucanlar. İşte biz bu transgenik C. felç oranı ölçmek için bizim protokol tarif Bu ölçüm etkisi deneysel değişkenlerin özellikle dikkat elegans modeli.

Protokol

1) felç tayini için nematodu Büyüme Medya plakaları hazırlamak.

Felç Testler, C için rutin olarak kullanılan standart nematodu Büyüme Medya (NGM) tabaklarda yapılmaktadır elegans yayılma ve genetik (Stiernagle 2006).

1. NaCl, Erlenmeyer şişesinin Agar ve Peptonlu içinde bulunduğu NGM çözüm Otoklav ve steril _{CaCl 2,} Urasil, Kolesterol, 1M _MgSO 4 ve 1M _KPO 4 uygun miktarda ekleyebilirsiniz . , Her biri 60 mm x 15 mm Petri Dish içine sıvı NGM kısım 10 ml. NGM gece oda sıcaklığında katılaşmasını sağlayın.
2. Her tabağa bileşikleri / özleri, kısım özü etkilerini test ve özü plaka yüzeyi üzerinde eşit olarak dağıtmak için bir ayırıcı kullanabilirsiniz. Gece oda sıcaklığında kuru ekstresi izin verin. 1 ml ciltlik kuruması için daha fazla zaman gerektirecektir.
3. E. 250 mcL ile her plaka Nokta coli suşu OP5O 0.4-0.6 bir optik yoğunluk için bir gecede LB Medya büyüdü. Bakteriler oda sıcaklığında bir gece kurumaya bırakın.

İlgili değişkenlerin

Plakaların yaş büyük plakalar kurumaya eğilimi gibi, felç tahlil üzerinde önemli bir etkisi vardır. Kullanım plakaları felç testinin bir hafta içinde dökülür. İdeal sonuçlar için, [(2) aşağıya bakınız] senkron solucan popülasyonlarının başlamadan 3-4 gün önce plakaları dökün. Herhangi bir deneme için, aynı partiden dökülür tabak kullanın.

Çim boyutu (yani benekli vs. Yayılma) ve / veya bakteri türü değiştirme solucanlar davranışını değiştirebilir. Felç testleri alternatif E. kullanılarak yapılabilir coli suşlarının bir besin kaynağı (örneğin, RNAi deneyler beslenmesinde kullanılan HT115 zorlanma), fakat bu, böylece uygun iç kontrol gerektiren, felç kinetiği değiştirebilirsiniz .

2) Yaş eşzamanlı Worm Populasyonlarının Hazırlık

Gerilme CL4176 (smg-1 (cc546 ^ts); dvIs27 [myo-3 / Aβ ​​minigene + rol-6 (su1006) işaretleyici gen X en sık Aβ indüklenen felç assaying için kullanılır Bu gerginlik ve diğer transgenik modelleri mevcuttur. Caenorhabditis Genetik Merkezi (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) nominal ücret karşılığında akademik araştırmacılar.

1. Yaş senkronize, senkronize bir ebeveyn nesil başlatmak için tercih edilir test nüfusun en üst düzeye çıkarmak için. Bir hafta önce test nüfusun felç tahlil başlatarak, 16 yaşında yatıyordu 20-30 gravid yetişkin 2 saatlik bir yumurta için OP50 yayılmış çok 10 cm NGM plakalar üzerine aktarmak için bir platin solucan toplayıcı ° C (müsamahakar sıcaklık CL4176 .) Gravid yetişkin çıkarın ve döl hangi zaman gravid yetişkin "ikinci gün" olacak, 7 gün boyunca büyümeye izin verir.
2. (Gün 1) ikinci gün gravid yetişkin yaşa eşzamanlı test nüfusu hazırlamak için kullanılır. Her deneysel koşul için 50-75 yaş senkron solucanları içeren üç nüsha plakaları oluşturmak için nesne. Platin solucan seçici kullanarak, OP50 ile fark 60 mm (10 ml hacim) NGM plakalar üzerine 2 gün gravid yetişkinlerin 10-12 aktarmak. Solucanların sonra yetişkinler almak ve yumurta kuluçkaya yatmak için izin ve 16 büyümeye, 2 saat boyunca 16 ° C'de yumurtalarını ° C izin verin Bu noktada onlara kod plakaları puanlama olmayacak birisi için en iyi golcü deneysel koşullara kör olacak.

İlgili değişkenlerin

Yumurtladığı embriyonik gelişim evresi (~ optimal koşullar altında vahşi tip solucanlar için 26-hücreli aşama), yetişkin yaş ve beslenme bir fonksiyonudur. Test nüfusun hazırlanması için kullanılan gravid yetişkin, eski ya da açlıktan iseniz, daha sonraki aşamalarda yumurta, nüfus ve felç kinetiği tekrarlanabilirlik yaş senkronize azaltarak belirtilen olacaktır. Farklı kültürlerin (mikrobik kirleticiler Bu testte ciddi etkiler) mono-axenic (yani, sadece OP50 bakteriler) daha önemlidir ve üç nüsha plakalar solucanlar benzer numaraları varsa tekrarlanabilirliği yüksek.

3) Transgen İndüksiyon ve Felç Testi

1. (Gün 3) 25 ° C senkron yumurta sona ermesinden sonra 48 saat Upshift plakaları yatıyordu; solucanlar üçüncü larva dönemi (L3) olmalıdır. Levhalar, plakalar, aynı zamanda 25 ° C ulaşmak için izin vermek için 25 ° C inkübatör istifleme olmadan düzenlenmelidir.
2. (4. Gün) upshift başlandıktan sonra 18-20 saat solucanlar felç (zorlanma CL4176) puanlama başlayın. Bu noktada, nüfusun tüm solucanlar, dördüncü larval (L4) evre ulaşmış olması gerekir. Her plakalar tüm solucanlar felç kadar iki saat aralıklarla puanlama devam edin. Bilinmeyen nedenlerden dolayı, felç, vücut uzunluğu boyunca bile değildir: baş bölgeye hareket durdurma solucanın son parçasıdır. Böylece, wfelç son zamanlarda başlatılan ORMs plaka üzerinde çevirmeyin, ancak böylelikle kendi anterior etrafında bakteri takas ve temizlenir bakteri "halo" bırakarak, başlarını taşıyabilirsiniz. Bu solucanlar değişmez tamamen felç olacak ve bu nedenle felç olarak haleler ile solucanlar kategorize edilir. Bazı solucanlar haleler yok ama spontan hareket göstermez, bu solucan seçici dürtüsüyle tarafından test edilmektedir. Kışkırtılması solucan dürtüsüyle üzerine bir tam vücut dalga yayılımı uğramaz, felç gibi, o da atılırsa. Verimli puanlama için, onlar istemeden bir sonraki puanlama süresi rescored olamaz böylece plaka lekesiz sektörü felç solucanlar taşımak için en kolay yoldur. (Bu aynı zamanda bir skor düzeltilmesine imkân verir, yanlış kategorize solucanlar hareketi göstermek için izin verir).
3. Bir felç eğrisi oluşturmak için her zaman bir noktada solucanlar kesir felç edilmiş her bir plaka üzerinde bir yüzdesi dönüştürülür ve ortalama "unparalyzed" yüzde upshift başlatılması zaman karşı çizilmiştir. (Bu şekilde çizmek için gerekçe çıkan eğri bir hayatta kalma eğrisi resmen benzer olduğunu ve bu nedenle standart non-parametrik sağkalım istatistikleri kullanılarak analiz edilebilir.)

İlgili değişkenlerin

Transgenik myo-3/Aβ solucanlar upshift myo-3 organizatörü gelişimsel düzenlenir başlanmalıdır, ve anlamlı geç L4 veya erişkin solucanlar ifade azalttı felç için orta aşama L4 ulaşmadan önce gerçekleşmesi gerekir. Benzer şekilde, solucanlar hasret kalırsanız bu transgen ifadesi engelleniyorsa, bu yüzden solucanları deney boyunca, iyi beslenmiş olması esastır. 16 ° C'ye kadar downshifted olsa bile, biz her türlü şartlar altında kurtarmak için bir felç solucan gözlenen asla ve 12-16 saat upshift sonra, tüm CL4176 solucanlar felç olacak Suşu CL4176, transgen ifadesi yeterli upregülasyonu neden felç zamanı değişmiş olmasına rağmen paralizi (yani, 20-25 ° C) daha düşük sıcaklıklarda oluşabilir. Felç oranı, kullanılan özel transgenik suşu (CL4176 daha hızlı ve yavaş oranları ile myo-3/Aβ suşları inşa ettik) bağlıdır, bu nedenle alternatif suşları ile skor penceresi ayarlanması gerekiyor olabilir.

4) Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1'de gösterildiği gibi tedavi edilmemiş ve 6.27 mM kafein (NGM plaka final konsantrasyon) maruz CL4176 bir felç eğri bir arsa. Bu tedavi, bu modeli Aβ toksisite baskılanması itibariyle gösterge niteliğindeki yorumlamak yaklaşık 4 saat, felç bir çok istatistiksel olarak anlamlı bir gecikme ile sonuçlanır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, kafestol, kahve bulunan başka bir bileşik etkileri assaying bağımsız bir deney. Bu arsa Aβ zehirlilik etkisi olmayan tedaviler için tipik bir örneğidir. Iki deneylerde tedavi edilmezse CL4176 popülasyonları yaklaşık yarısı 24 saat felç, felç, 28 saat olduğunu unutmayın. Bu kontrolü CL4176 popülasyonlarının felç için tipik zaman dilimleri. Bu zamanlama önemli sapmalar, değişen çevre koşullarına veya transgen kopya kendiliğinden silme göstergesidir. Sıcaklıklarda suşu (CL4176 myo-3/Aβ transgen birden fazla kopya ile kromozomal entegre transgenik dizi içerir. Bu transgenik dizi normalde oldukça istikrarlı olmasına rağmen, herhangi bir yayılma> 16 ° C bir geçirmiş nadir solucanlar için seçecek Aβ ifade ve yavaş felç sonucu düşer varyantları çıkan transgenlerin kendiliğinden silme.)

Şekil 1. CL4176 solucanlar tedavi edilmezse veya 6.27 mM kafein (Sigma) maruz gerginlik Felç eğrisi Belirtilen sıcaklık upshift başlangıcından itibaren vardır. Hata çubukları = SEM

Şekil 2. 0.48 mM kafestol (Sigma) maruz CL4176 solucanlar Felç eğrisi. Hata çubukları = SEM

Tartışmalar

Açıklanan protokol etkili Aβ toksisite bileşiklerin etkilerini tahlil etmek için kullanılabilir. Yayınlandı örnekler Ginkgo biloba ekstresi bileşenlerinin etkileri (Wu ve ark 2006) ve reserpin (Arya ve ark 2009) içerir. Diğer sistemlerde Aβ toksisitesine karşı koruyucu bileşikler de (örneğin, memantin, yayımlanmamış sonuçlar) bu modelde koruyucu olduğu gösterilmiştir. Bu modelin kurulması için önemli bir gerekçe C ile iyi geliştirilmiş genetik ve moleküler araçlar kullanılabilir. elegans Aβ toksisite mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Böylece, Aβ toksisitesi üzerindeki etkileri özel mutasyonlar (örneğin, daf-2-fonksiyon kaybı mutasyonu, Florez-McClure ve ark, 2007 tanıtan tarafından sinyalizasyon gibi insülin azaltmada etkisi) test ve bu model de olabilir (Fonte ve ark 2008) aşırı ifade transgenlerin etkilerini incelemek için kullanılır. Biz son zamanlarda Aβ tek bir amino asit değiştirmelerin (yayınlanmamış veri) toksisitesi üzerindeki etkilerini incelemek için bu modelin geniş kullanımı yaptık.

Transgenik bir model deneyleri burada kas hücre fonksiyonu akut Aβ ifade etkisi nitelendirdi. Felç kas hücreleri ve bunların sarkomer zamanda bozulmamış; felç fenotip kas hücre ölümü sonucu değildir. Ancak, kas bütünlüğünü ve solucanlar nihai ölümünden sonra felç (ilk upshift sonra ~ 48 saat) bir arıza var. Biz bu Aβ ifade aşağı etkisi araştırılmıştır veya bir toksisite belirteci olarak kullanılır.

Burada açıklanan indüklenebilir Aβ ifade modeli başına β-amiloid oluşumunu modüle tedavileri araştırmak için uygun değildir. (. Fay ve ark 1998; Link ve ark 2001) kurucu Aβ ifade formu kolaylıkla saptanabilir amiloid mevduat transgenik solucanlar rağmen, indüklenebilir Aβ ifade ile transgenik solucanlar nadiren amiloid mevduat ve felç fenotip amiloid birikimi (Drake ve ark bağımsız görünür. 2003). Çözünen oligomerik Aβ birikimi değil, amiloid birikimi bağlı Aβ ifade sonuçlarının akut toksisite sonuçları görünümü ile uyumlu.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifler	Quantity/2L	Şirket / Katalog #	Yorumlar
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Agar	40g	Sigma-Aldrich / A7002
Pepton	5g	Sigma-Aldrich / P0556
GKD 2 O	2L
1M CaCl 2	2mL		GKD 2 O içinde 147.02mg/mL
Urasil	2mL		GKD 2 O içinde 2mg/mL
Kolesterol	2mL		Etanol içinde 5mg/mL (otoklav değil)
1M MgSO 4	2mL		GKD 2 O içinde 246.5mg/mL
1M KPO 4	50ml		98mg KH 2 PO 4 mL, 48mg K2HPO4/mL GKD 2 O, pH
Erlenmeyer Flask		VWR