تطبيق المواصلة NMDA مستقبلات الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الجرذ الدوبامينية باستخدام تقنية المشبك الحيوي

Summary

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تطبيق تصرف في الخلايا العصبية الدوبامين سجلت في تكوين خلية كاملة في دماغ الفئران شرائح. وتسمى هذه التقنية المشبك الحيوية.

Abstract

علماء الأعصاب دراسة وظيفة الدماغ عن طريق التحقيق في كيفية الخلايا العصبية في الدماغ على التواصل. كثير من المحققين نظرة على التغيرات في النشاط الكهربائي واحد أو أكثر من الخلايا العصبية في استجابة لمدخلات التجربة التي تسيطر عليها. يمكن تسجيل النشاط الكهربائي للخلايا العصبية في الدماغ شرائح معزولة باستخدام تقنيات التصحيح مع المشبك micropipettes الزجاج. تقليديا ، يمكن إدخال المجربون تحاكي الخلايا العصبية عن طريق الحقن المباشر الحالي من خلال التحفيز ، ماصة الكهربائية للخلايا أخرى أو اتصالات محواري المتبقية في شريحة ، أو تلاعب من قبل الدوائية المستقبلات الموجودة على غشاء الخلية العصبية من تسجيلها.

الحقن المباشر الحالي لديه مزايا من تمرير الموجي الحالي سلفا بدقة عالية الزمنية في موقع التسجيل (عادة سوما). ومع ذلك ، فإنه لا يغير من المقاومة للغشاء الخلايا العصبية كما يتم فتح أي قنوات ايون جسديا. الحقن الحالية توظف عادة البقول مستطيلة ، وبالتالي لا نموذج حركية القنوات الأيونية. أخيرا ، يمكن حقن الحالية لا تحاكي التغيرات الكيميائية في الخلايا التي تحدث مع فتح قنوات أيون.

ويمكن تنشيط مستقبلات الجسدي من قبل التحفيز الكهربائي أو الدوائية. المجرب والدقة الزمنية جيدة لتنشيط مستقبلات مع التحفيز الكهربائي للشريحة. الدقة المكانية ومع ذلك ، هناك محدودية تفعيل مستقبلات وطبيعة بالضبط ما هو التحفيز على تنشيط غير معروف. ويمكن التخفيف من حدة هذه المشكلة الأخيرة جزئيا من قبل وكلاء الدوائية محددة. للأسف ، أثناء وقت التنشيط من وكلاء الدوائية بطيئة عادة والدقة المكانية المدخلات على الخلية تسجيل غير معروف.

تقنية المشبك دينامية يسمح للمجرب لتغيير الحالية مرت مباشرة في الخلية على أساس الوقت الحقيقي وردود الفعل المحتملة من غشاء الخلية (روبنسون وكاواي 1993 ، وشارب وآخرون ، 1993a ، ب ؛ للمراجعة ، انظر برينز وآخرون بن ، 2004). هذا يسمح للمجرب لمحاكاة التغيرات الكهربائية التي تحدث في موقع التسجيل في استجابة لتنشيط مستقبلات. ويتم تحديد التغييرات في الوقت الحقيقي الحالي الذي تطبقه في معادلة رياضية تنفذ في الأجهزة.

لقد اعتدنا في الآونة الأخيرة تقنية المشبك دينامية للتحقيق في الجيل رشقات نارية من إمكانات العمل من خلال تفعيل طوري من المستقبلات في الخلايا العصبية الدوبامين NMDA من المكتنزة substantia بارس أسود (Deister وآخرون ، 2009 ؛ لوب وآخرون ، 2010). في هذا الفيديو ، ونحن لشرح الإجراءات اللازمة لتطبيق تصرف NMDA مستقبلات الدوبامين في الخلايا العصبية.

Protocol

1. إعداد شريحة

1. قطع شرائح الدماغ باستخدام مشراح تهتز. نحن مستعدون 240 ميكرومتر شرائح الدماغ المتوسط ​​الأفقي من الفئران سبراغ داولي isoflurane - anethetized (تشارلز ريفر مختبرات) باستخدام مشراح تهتز (Microm جلالة 650V) وفقا لجامعة تكساس في سان انطونيو رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
2. الحفاظ على شرائح في غرفة الحضانة حتى تكون مستعدا لتسجيل. نحن نستخدم وعاء الحضانة تسخينها إلى 32 درجة مئوية ومليئة السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF ؛ مم) : 126 كلوريد الصوديوم ، 2.5 بوكل ، 1.25 ناه ₂ ص _{4 و 4} MgCl ₂ ، ₂ CaCl ₂ ، 10 الدكستروز ، 25 NaHCO ₃ حمض الاسكوربيك 1.3 ، 2.4 البيروفات الصوديوم والجلوتاثيون 0.05.

2. تسجيل الكهربية

1. نقل الشريحة إلى جهاز الحفر تسجيل الخلايا التي يكون فيها السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) في 35 درجة مئوية ويجري perfused. نحن نستخدم نفس aCSF 1.2 في ما عدا تلك المستخدمة 2mm وكان MgCl ₍₂₎ وحذفت الجلوتاثيون. أعدت لشرائح أفقيا ، ونحن عادة تقسم شريحة على طول خط الوسط.
2. تصور الخلايا العصبية المستهدفة. تصور أننا الفردية substantia أسود الخلايا العصبية الدوبامين مع نظام التصوير التدرج على النقيض.
3. سحب كهربائي باستخدام مجتذب القطب الالكترونية. نحن مع انسحاب أقطاب المقاومة غيض من 40-10 باستخدام MΩ a Micropipette P97 مجتذب (سوتر شركة الصك).
4. ملء إلكترود مع الحل الداخلي المطلوب. نستخدم محلول يحتوي على (مم) : 138 K - غلوكونات ، 10 HEPES ، 2 MgCl ₂ ، 0.2 EGTA ، 0.0001 CaCl ₂ ، 4 - ATP نا ، 0.4 - GTP نا. تم تعديل الحل الداخلي إلى درجة الحموضة من 7.3 باستخدام 1M KOH والأسمولية من mOsms 270-275.
5. جعل ختم gigaohm على الخلايا العصبية المطلوب. تمزق الختم مع الشفط. هذا يشكل تسجيل الخلية بأكملها. تم استخدام مكبر للصوت 700B Multiclamp في التكوين لدينا. وينبغي بعد ذلك مكبر للصوت يمكن وضعها في صيغة "أنا = 0' المشبك الحالي.

3. التطبيق تصرف مع المشبك الحيوي

1. أعدم RTXI (www.rtxi.org) على الكمبيوتر المشبك الحيوية. تم تحميل نموذج مخصص مكتوبة تحتوي على مستقبلات النمداوية في الذاكرة. ويتم احتساب الحالي ليتم حقنه في الخلية في الوقت الحقيقي من خلال المعادلة التالية :
   أنا = _{النمداوية NMDA} - G * [1 / (1 ​​+ ([مغ] / 3.57) * ه ^{​​(- V 0.062} _م ^*))] * (V _م -- E _NMDA) حيث ز _NMDA هو تصرف المطلوب (في NS ؛ افتراضيا تعيين إلى 0 NS) ، [مغ] هو تركيز المغنسيوم (مجموعة الى 1.5 ملم في مثالنا أدناه) ، E _NMDA هو احتمال انعكاس لمستقبلات NMDA (مجموعة إلى 0 فولت) ، والخامس _م هو غشاء المحتملة من الخلية تقاس من مكبر للصوت (في بالميليفولت).
2. ارتبط الإخراج من الكمبيوتر المشبك دينامي لإدخال الأوامر من مكبر للصوت عن طريق تحويل التناظرية إلى الرقمية.
3. مكبر للصوت وضعت في صيغة "IC" المشبك الحالي.
4. ادخل المطلوب تصرف مستقبلات النمداوية في RTXI (مثل 40nS). يجب أن تشاهد انفجار طوري من إمكانات العمل. بدلا من ذلك ، يمكن أن يعطى لRTXI تصرف عن طريق الانتاج التناظرية (الشكل 1A ، 'ز (ر)'). يجب استخدام عامل التحجيم المناسب داخل RTXI لتحويل الإشارة من فولت لشركة سيمنس.

4. ممثل النتائج

ويرد الإعداد ناجحة لتطبيق تصرف باستخدام المشبك دينامية في الشكل 1A. باستخدام هذا الإعداد ، بذلنا كل خلية جسدية من تسجيل إحدى الخلايا العصبية الدوبامين في المكتنزة substantia بارس أسود. خلايا الدوبامين النار عفويا عادة بمعدلات منخفضة مع وجود نمط منظم ضربات القلب مثل. يمكن أثار موجة عارمة من إمكانات العمل من خلال تطبيق طوري من تصرف مستقبلات NMDA مع المشبك الحيوي (1B الشكل).

الشكل 1 : تطبيق لتصرف مستقبلات NMDA باستخدام تقنية المشبك الحيوية. A. الإعداد الأجهزة التي توضح اتصالات بين الخلايا وتلاعب في تسجيل دينامية الكمبيوتر المشبك. وأثارت موجة من باء إمكانات العمل من خلال تطبيق لتصرف مستقبلات NMDA 40nS في تسجيل خلية كاملة من المادة السوداء الجزء الدوبامين العصبية المكتنزة.

Discussion

تقنية ديناميكية المشبك أظهرت يحسن هنا على تقنية الحقن التقليدية الحالية المباشرة عن طريق السماح للالمجرب لمحاكاة تأثيرات الكهربائية للتنشيط مستقبلات. في هذا الفيديو ، لقد أظهرنا أنه يمكن إضافة تأثيرات التنشيط لمستقبلات NMDA إلى النشاط العفوي من الخلايا العصبية الدوبامين ، أي موجة من إمكانات العمل وأثار.

نظرا لمرونة لتنفيذ الأجهزة / البرمجيات ، ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من الملحقات. يمكن أن تنتقل علامة الحالي حقن من السلبية إلى الإيجابية ، وهو ما يمثل السيناريو حيث يتم إزالة آثار تنشيط مستقبلات من الخلايا العصبية. ويمكن أيضا نموذج الخلايا العصبية ، ممثلة في شكل سلسلة من المعادلات التفاضلية ، ويمكن حلها من الناحية العددية ، والسماح للالمجرب للتحقيق في شبكات صغيرة.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview