Применение NMDA-рецепторов в проводимости мозга крысы дофаминергических нейронов с помощью динамического Техника Clamp

Резюме

В этом видео показано, как применять проводимости в дофаминергических нейронов, записанные в целом конфигурации клетки в срезах мозга крыс. Эта техника называется динамическим зажимом.

Аннотация

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.

Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.

Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.

The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.

We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

протокол

1. Подготовка фрагментов

1. Вырезать мозга ломтиками использованием вибрирующей микротоме. Мы подготовили 240 мкм горизонтальных срезов мозга от ИФ-anethetized Sprague-Dawley крыс (Charles River Laboratories) использованием вибрирующей микротома (Microm HM 650V) в соответствии с Техасского университета в Сан-Антонио Институциональные уходу и использованию животных комитета.
2. Держите ломтики в камере инкубации пока не будете готовы к записи. Мы используем инкубационный контейнер нагревается до 32 ° C и наполнен искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF; в мм): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 4 ₂ MgCl 2, CaCl _2, 10 декстрозы, 25 NaHCO _3, 1,3 аскорбиновой кислоты, 2,4 пируват натрия и 0,05 глутатиона.

2. Электрофизиологические Запись

1. Передача квант внутриклеточных установки записи, в которых искусственным спинномозговой жидкости (aCSF) при 35 ° C в настоящее время перфузии. Мы используем те же aCSF как и в 1,2 исключением того, что 2 мМ MgCl ₂ был использован и глутатион был опущен. Для горизонтально подготовленные ломтики, которые мы обычно делят пополам ломтик вдоль средней линии.
2. Визуализируйте цель нейрона. Мы визуализировать отдельные черной субстанции дофаминергических нейронов с изображениями система отличие градиент.
3. Вытяните электрода с помощью электронной съемник электрода. Тянем электродами с наконечником сопротивлением 4-10 МОм использованием P97 микропипетки съемник (Саттер Instrument Company).
4. Заполнить электрод с желаемой внутреннее решение. Мы используем раствор, содержащий (в мм): 138 К-глюконат, 10 HEPES, 2 MgCl _2, 0,2 EGTA, 0.0001 ₂ CaCl, 4 Na-АТФ, 0,4 Na-GTP. Внутренние раствора доводили до рН 7,3 использованием 1М КОН и осмолярность 270-275 mOsms.
5. Сделать gigaohm печать на нужный нейрон. Разрыв печать с всасывания. В этом заключается весь записи клетки. Усилитель Multiclamp 700B был использован в нашей конфигурации. Усилитель должен быть помещен в текущем режиме зажим 'I = 0'.

3. Проводимость приложения с динамической Clamp

1. RTXI (www.rtxi.org) был выполнен на компьютере динамическую зажимом. Пользовательских письменного модели, содержащей NMDA-рецепторов был загружен в память. Тока, вводят в клетку в реальном времени рассчитывается по следующей формуле:
   Я _NMDA =-г _NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * е ^(-V _м ^{* 0,062))]} * (V _м - E _NMDA), где г _NMDA является искомой проводимости (в нс; По умолчанию установлено в 0 нс), [Mg] является концентрация магния (устанавливается до 1,5 мм в нашем примере ниже), E _NMDA есть потенциал реверсии для NMDA-рецепторов (установлен в 0 мВ) и V _м мембранный потенциал ячейки измеряется от усилителя (в милливольтах).
2. Вывод динамических компьютер зажим был подключен к командной вход усилителя через аналого-цифровой преобразователь.
3. Усилитель был помещен в текущем режиме зажим 'IC'.
4. Введите желаемый NMDA рецепторов проводимости в RTXI (например 40nS). Вы должны увидеть фазовый взрыв потенциалов действия. Кроме того, проводимость может быть предоставлена ​​RTXI через аналоговый выход (рис. 1А, "г (т) '). Соответствующий коэффициент масштабирования следует использовать в течение RTXI для преобразования сигнала от вольт для Siemens.

4. Представитель Результаты

Успешной установки для применения проводимости с помощью динамического зажима показан на рисунке 1а. С помощью этой установки, мы сделали все соматической клетки записи с дофаминергических нейронов в черной субстанции Парс компактов. Дофаминергической клетки обычно спонтанно огонь по низким ценам с кардиостимулятором, как шаблон. Взрыв потенциалы действия могут быть вызваны фазовыми применения NMDA-рецепторов проводимости с динамическим зажим (рис. 1В).

Рисунок 1: Применение NMDA-рецепторов проводимости с помощью динамического техника зажима. А. Аппаратное обеспечение иллюстрирующие связь между внутриклеточными установки записи и динамических компьютер зажимом. Б. взрыв потенциалов действия вызывается путем применения 40nS NMDA-рецепторов проводимость в целом запись клетки от черной субстанции Парс компактов дофаминергических нейронов.

Обсуждение

Динамический метод зажима продемонстрировали здесь улучшает традиционную технику постоянного тока инъекции, позволяя экспериментатором, чтобы имитировать электрических эффектов активации рецептора. В этом видео, мы показали, что можно добавить эффекты активации NMDA-рецепторов к спонтанной активности дофаминергических нейронов, то есть взрыв потенциалов действия вызываются.

Благодаря гибкости аппаратной / программной реализации, различные расширения могут быть использованы. Знак вводится ток может быть включен с отрицательного на положительный, что составляет сценарий, при котором эффекты активированного рецептора удаляется из нейрона. Модель нейронов, представить в виде серии дифференциальных уравнений, также может быть решена численно и позволяет экспериментатору для исследования малых сетей.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview