Aplicação de uma condutância do receptor NMDA em neurônios dopaminérgicos Rat Midbrain Usando a Técnica Clamp dinâmico

Resumo

Neste vídeo, demonstramos como aplicar uma condutância em um neurônio dopaminérgico gravada na configuração da célula inteira em fatias de cérebro de rato. Esta técnica é chamada a braçadeira dinâmico.

Resumo

Neurocientistas estudar a função do cérebro, investigando como os neurônios do cérebro se comunicam. Muitos investigadores olhar para as mudanças na atividade elétrica de um ou mais neurônios em resposta a uma entrada experimentalmente controladas. A atividade elétrica dos neurônios pode ser gravado em fatias de cérebro isoladas usando técnicas de patch clamp com micropipetas de vidro. Tradicionalmente, os experimentadores podem imitar a entrada de neurônios por meio de injeção direta de corrente através da pipeta, estimulação elétrica das outras células ou restantes ligações axonal na fatia, ou manipulação farmacológica de receptores localizados na membrana da célula neuronal registrada.

Injeção de corrente contínua tem a vantagem de passar uma forma de onda predeterminada atual com alta precisão temporal no local da gravação (geralmente a soma). No entanto, isso não muda a resistência da membrana neuronal como nenhuma canais iônicos são fisicamente aberta. Injeção de corrente geralmente emprega pulsos retangulares e, portanto, não o modelo de cinética de canais iônicos. Finalmente, a injeção de corrente não pode imitar as mudanças químicas na célula que ocorre com a abertura de canais iônicos.

Receptores podem ser fisicamente ativada pela estimulação elétrica ou farmacológica. O experimentador tem boa precisão temporal da ativação do receptor com a estimulação elétrica da fatia. No entanto, é limitada precisão espacial da ativação do receptor ea natureza exata do que é ativada após a estimulação é desconhecida. Este último problema pode ser atenuado parcialmente através de agentes farmacológicos específicos. Infelizmente, o tempo de ativação de agentes farmacológicos é tipicamente lento ea precisão espacial de insumos para a célula gravado é desconhecido.

A técnica de fixação dinâmica permite que um experimentador para mudar o atual passados ​​diretamente para a célula com base em feedback em tempo real do potencial de membrana da célula (Robinson e Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Para revisão, ver Prinz et al. 2004). Isso permite que um pesquisador para imitar a mudanças elétricas que ocorrem no local da gravação em resposta à ativação de um receptor. Em tempo real as mudanças na corrente aplicada são determinados por uma equação matemática implementado em hardware.

Temos recentemente usou a técnica de fixação dinâmica para investigar a geração de rajadas de potenciais de ação pela ativação de receptores NMDA fásica em neurônios dopaminérgicos da substância negra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. Neste vídeo, demonstramos os procedimentos necessários para aplicar uma condutância receptor NMDA em um neurônio dopaminérgico.

Protocolo

1. Preparação fatia

1. Cortar fatias de cérebro usando um micrótomo vibrando. Preparamos 240 mM fatias mesencéfalo horizontal de um isoflurano-anethetized Sprague-Dawley rato (Charles River Laboratories) usando um micrótomo vibrando (Microm HM 650V), de acordo com a Universidade do Texas em San Antonio Animal Care Institucional e Comitê de uso.
2. Mantenha as fatias em uma câmara de incubação até que esteja pronto para gravar. Usamos um recipiente de incubação aquecida a 32 ° C e preenchido com líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF, em mM): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _{4, 4} MgCl _2, CaCl 2 _2, 10 dextrose, 25 de NaHCO _3, 1,3 ácido ascórbico, piruvato de sódio 2,4 e 0,05 glutationa.

2. Gravação eletrofisiológicas

1. Transferir a fatia para o equipamento de gravação intracelular em que um fluido cerebrospinal artificial (ACSF) a 35 ° C está sendo perfundido. Nós usamos a mesma ACSF em 1,2 exceto que 2mM MgCl ₂ foi usado e glutationa foi omitido. Para fatias horizontalmente preparado, nós normalmente bisect a fatia ao longo da linha média.
2. Visualize o neurônio alvo. Foi visualizada individuais substantia nigra neurônios dopaminérgicos com um sistema de imagem gradiente de contraste.
3. Puxe um eletrodo usando um extrator de eletrodo eletrônicos. Puxamos eletrodos com uma resistência de ponta 10/04 mohms usando um P97 Micropipeta extrator (Sutter Instrument Company).
4. Preencher um eletrodo com a solução desejada interna. Usamos uma solução contendo (em mM): 138 K gluconato, 10 HEPES, 2 MgCl _2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl _2, 4-Na ATP, 0,4 Na-GTP. A solução interna foi ajustado para um pH de 7,3 com KOH 1M e uma osmolaridade de 270-275 MOSMS.
5. Faça um selo gigaohm para o neurônio desejado. Ruptura com o selo de sucção. Isto constitui uma gravação de células inteiras. A Multiclamp amplificador 700B foi usado em nossa configuração. O amplificador deve então ser colocado em modo 'I = 0' grampo atual.

3. Aplicação de condutância com Grampo dinâmico

1. RTXI (www.rtxi.org) foi executado no computador de fixação dinâmico. Um modelo personalizado escrito contendo um receptor NMDA foi carregado na memória. A corrente a ser injetado na célula em tempo real é calculado pela seguinte equação:
   Eu _NMDA =-g _NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * e ^(-V _m ^{* 0,062))]} * (V _m - E _NMDA), onde g é a condutância _NMDA desejada (em ns; por padrão definido como 0 ns), [Mg] é a concentração de magnésio (ajustado para 1,5 mM em nosso exemplo abaixo), E _NMDA é o potencial de reversão para o receptor NMDA (set a 0 mV), e V _m é o potencial de membrana da célula medido a partir do amplificador (em milivolts).
2. A saída do computador de fixação dinâmica foi conectado à entrada de comando do amplificador através de um conversor analógico-digital.
3. O amplificador foi colocado no modo 'IC' grampo atual.
4. Digite seu condutância receptor NMDA em RTXI desejado (por exemplo, 40ns). Você deverá ver uma explosão fásica de potenciais de ação. Alternativamente, uma condutância pode ser dado a RTXI através de uma saída analógica (Figura 1A, 'g (t)'). Um fator de escala apropriada deve ser utilizada dentro RTXI para converter o sinal de volts para a Siemens.

4. Resultados representante

Uma configuração de sucesso para aplicação de uma condutância dinâmica usando a braçadeira é mostrado na Figura 1A. Usando esta configuração, fizemos um todo células somáticas de gravação de um neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta. Células dopaminérgicas tipicamente fogo espontaneamente a taxas baixas com um padrão de pacemaker-like. Uma explosão de potenciais de ação podem ser evocadas pela aplicação de uma condutância fásica receptor NMDA com grampo dinâmico (Figura 1B).

Figura 1: Aplicação de uma condutância receptor NMDA usando a técnica de fixação dinâmico. A. configuração do hardware ilustrar as conexões entre o equipamento de gravação e computador intracelular clamp dinâmico. B. Uma rajada de potenciais de ação é evocado pela aplicação de uma condutância receptor NMDA 40ns em uma gravação de células inteiras a partir de uma substância negra pars compacta dopaminérgicos neurônio.

Discussão

A técnica de fixação dinâmica demonstrado aqui aperfeiçoa a técnica tradicional de injeção de corrente contínua, permitindo que o experimentador para imitar os efeitos elétricos da ativação de um receptor. Neste vídeo, mostramos que se pode adicionar os efeitos da ativação de um receptor NMDA para a atividade espontânea dos neurônios dopaminérgicos, isto é, uma rajada de potenciais de ação são evocados.

Devido à flexibilidade da implementação hardware / software, uma variedade de extensões podem ser usadas. O sinal da corrente injetada pode ser ligado de negativo para positivo, o que representa um cenário onde os efeitos do receptor ativado é removido de um neurônio. Neurônios modelo, representado na forma de uma série de equações diferenciais, também pode ser resolvido numericamente e permitir que o experimentador para investigar redes pequenas.

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview