عضوي النمط من الثقافة شريحة GFP - معربا عن أجنة الفئران لريال مدريد في الوقت ثمرة تصوير الأعصاب الطرفية

Summary

نقدم طريقة لتحضير شرائح عضوي النمط من أجنة فئران في منتصف الحمل للزراعة والتصوير مرور الوقت ، من ثمرة الأعصاب الطرفية.

Abstract

لأغراض كثيرة ، وزراعة الأجنة الحية الماوس السابقين وشرائح عضوي النمط غير مرغوب فيه. على سبيل المثال ، ونحن توظيف خط الماوس المعدلة وراثيا (tauGFP) الذي يعبر حصرا نسخة مطورة من البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في جميع الخلايا العصبية في تطور الجهاز العصبي المركزي والمحيطي ¹ ، مما يسمح لكلا احتمال الفيلم من تعصيب وforelimb والتلاعب هذه العملية مع تقنيات والدوائية الجينية ^2. المعلمة الأكثر أهمية في زراعة ناجحة لشريحة الثقافات مثل هذا الأسلوب الذي يتم إعداد الشرائح. بعد اختبارات مكثفة من مجموعة متنوعة من الأساليب ، أننا وجدنا أن vibratome هو الجهاز الأمثل لشريحة الأجنة بحيث يؤدي بشكل روتيني في ثقافة الذي يوضح جدوى على مدى أيام عدة ، والأهم من ذلك أنه في عصر تتطور بطريقة محددة. في منتصف الحمل الأجنة ، ويشمل هذا نتاج طبيعي للأعصاب العمود الفقري من الحبل الشوكي والعقد الجذرية الظهرية إلى أهدافهم في محيط والتصميم السليم للأنسجة العضلات والهيكل العظمي.

في هذا العمل ، فإننا نقدم وسيلة لمعالجة الأجنة كلها اليوم الجنينية (E) E10 E12 لفي 300 -- 400 ميكرومتر شرائح لزراعة الأنسجة في حاضنة الثقافة الموحدة ، والتي يمكن دراستها لمدة تصل إلى يومين بعد إعداد شريحة. حاسمة بالنسبة لنجاح هذا النهج هو استخدام vibratome لشريحة كل جنين agarose جزءا لا يتجزأ. ويتبع ذلك عن طريق زراعة شرائح عند إدراج Millicell غشاء الثقافة وضعت بناء على حجم صغير من المتوسط ​​، مما أدى إلى واجهة تقنية الثقافة. القمامة واحدة بمتوسط ​​7 أجنة بشكل روتيني وتنتج ما لا يقل عن 14 شرائح (2-3 شرائح من منطقة جنين في forelimb) ، والذي يختلف قليلا بسبب عمر الأجنة وكذلك سمك الشرائح. حوالي 80 ٪ من الشرائح المثقفة تظهر ثمرة العصبية ، والتي يمكن قياسها على زراعة ² througout الفترة. وأظهرت النتائج ممثل باستخدام سطر tauGFP الماوس.

Protocol

الجزء 1 : الاستعداد للتشريح والتثقيف.

1. إعداد لوحات 10 سم ، وزراعة الأنسجة مع تشريح المتوسطة (DMEM ، و 25 ٪ HBSS 1X ، و 25 ٪ مصل بقري جنيني والجلوكوز بنسبة 0.5 ٪ ، 1 الجلوتامين ملي و 2.5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.3) و 3 سم Millicell - CM - 0.4 ميكرومتر الثقافة إدراج والحفاظ على غشاء في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
2. حرارة منخفضة بنسبة 4 ٪ نقطة ذوبان agarose في برنامج تلفزيوني في الميكروويف وابقائه على لوحة التسخين بحيث يبقى في حوالي 37 درجة مئوية.
3. ملء 10 سم ، والبكتريولوجية أطباق بتري مع برنامج تلفزيوني (140 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 2.7 ملي بوكل ، 10 ملي نا ₂ هبو ₄ ، ص ₂ 1.8mM KH ₄₎ ووضعت على الجليد.
4. إعداد مشراح جهاز التبريد أو ضمان تخزين وتبريد علبة عازلة العناصر في الثلاجة لتبرد قبل ذلك.

الجزء 2 : تضمين الأجنة.

1. تشريح الأجنة من الرحم ودراستها مع مجهر مقلوب an الفلورسنت للتحقق من التعبير GFP.
2. أجنة مكان في صحن مقلوب بيتري 10 سم ، وتوجيهها باستخدام شرائط الورق Whatman لإزالة PBS المفرطة.
3. تنطبق على agarose جنين لاصلاحها في هذا الموقف. اسمحوا agarose يصلب.
4. الحد من المنطقة المحيطة بها الجنين عن طريق خفض بشفرة حلاقة.
5. تدوير الجنين جزءا لا يتجزأ من على الجانب الآخر.
6. تطبيق agarose إضافية على الأنسجة الجنينية للتأكد من أن يتم تضمين تماما الجنين.
7. إعداد agarose كتلة مع حواف نظيفة وعلى جبل تشوك vibratome باستخدام وكتايت 406 ، الغراء خاص يشبه "الغراء Krazy".

الجزء 3 : التقطيع الداخلي.

1. إعداد علبة عازلة precooled وعنصر التبريد.
2. إدراج تشوك مع نسيج لاصق وإضافة 1X HBSS (كا ^{2 + 2 +} ملغ خالية HBSS ، 10 العازلة HEPES الرقم الهيدروجيني 7.3 ملليمتر و 500 U / البنسلين مل / الستربتوميسين) حتى تغطيتها.
3. إدراج وإصلاح precleaned شفرة مشراح (70 ٪ إيثانول).
4. أبقى شرائح 450 ميكرون ونقلها باستخدام الزجاج تقصير ماصات باستور في زراعة الأنسجة لوحات على الجليد -- إعداد 350.
5. باستخدام زوج من الملقط ، agarose إزالة بعناية من كل شريحة ، ونقل إلى Millicell الأغشية الثقافة. يمكن تربيتها حوالي 4 شرائح على واحد في لوحة الغشاء نسيج الثقافة 10 سم ، وملأت مع 6 مل من المتوسط ​​الثقافة.
6. احتضان شرائح عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ (متوسطة الثقافة : DMEM ، و 25 ٪ HBSS 1X ، و 25 ٪ مصل بقري جنيني والجلوكوز بنسبة 0.5 ٪ ، 1MM الجلوتامين ، و 2.5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.3). إذا كان واحد ينفذ الوقت الفاصل بين التصوير سلسلة ينبغي للمرء أن إبقاء حجم ثابت المتوسطة. في حالة من سلسلة توقيت التصوير لفترة زمنية قصيرة يكفي لمغادرة المتوسط ​​كما هو عليه. الثقافة لمدة أطول فترات التغييرات الموصى بها بعد 12-20 ساعة.

الجزء 4 : التصوير ثمرة العصب الشوكي في المجهر.

1. صورة الأعصاب في العمود الفقري بوضع زراعة الأنسجة 10 سم ، لوحة ، والتي تحتوي على أغشية الثقافة Millicell مع شرائح ، تحت مجهر الفلورسنت تستقيم.
2. تسمية اتجاه الأغشية الثقافة Millicell على خشبة المسرح المجهر لموقف صحيح أثناء التصوير نقطة في المرة القادمة.
3. ثمرة صورة العصب الشوكي باستخدام 4X (الفتحة العددية [NA] 0.1) ، 10X (NA 0.3) ، أو 20X (NA 0.5) الأهداف.

الشكل 1 يبين سلسلة التصوير تصور ثمرة العصب الفقري خلال 20 ساعة من الثقافة مع أهداف 4x و10X.

سلسلة التصوير الرقم 1 من ثمرة العصب الشوكي في شريحة عرضية من جنين tauGPF متماثل. * = الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي بطني ، السهم = DRG. وأشار الظهراني (D) - بطني (V) محور شريحة. Scalebars : 200 ميكرومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في المقارنة واسعة من الأساليب لإعداد الثقافات شريحة الجنينية من أجنة فئران في منتصف الحمل (E10 -- E12) ، وقد لاحظنا أن vibratome تنتج دون شك نتائج الأكثر موثوقية فيما يتعلق جدوى على حد سواء العام للثقافات واستنساخ أنماط ثمرة العصبية. في المقابل ، أعدت شرائح الأنسجة باستخدام ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS 10x	GIBCO, by Life Technologies	14180
Dissection tools	Fine Science Tools	various
L.M.P. agarose	Invitrogen	15517-022
Whatmann paper	Whatman, GE Healthcare	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, by Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-glutamine 100x	GIBCO, by Life Technologies	25030
Vibratome	Microm International	HM 650 V
Fluorescent microscope	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Millicell-CM inserts	EMD Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Razor blades	Thermo Fisher Scientific, Inc.	none
Dissecting microscope	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
x4 objective	Olympus Corporation	PL series
x10 objective	Olympus Corporation	UPLFL –PH series
Filter	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD camera	Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171