بمساعدة الحاسوب على نطاق واسع التصور النوعي والكمي لقداس جزيرة البنكرياس والتوزيع الحجم والعمارة

Summary

يتم وصف أساليب بمساعدة الحاسوب الرواية على نطاق واسع الشراء وتحليل العينات immunohistochemically البنكرياس الملون : (1) القبض على شريحة افتراضية للقسم كامل ، (2) التحليل الشامل للبيانات واسعة النطاق ، (3) إعادة بناء شرائح الظاهري 2D ، (4) رسم الخرائط 3D جزيرة ، و (5) التحليل الرياضي.

Abstract

في جزيرة البنكرياس هي فريدة من نوعها الدقيقة الجهاز يتكون من عدة خلايا الغدد الصماء إفراز هرمون مثل خلايا بيتا (الأنسولين) ، خلايا ألفا (الجلوكاجون) ، ودلتا الخلايا (السوماتوستاتين) التي هي جزء لا يتجزأ في أنسجة الاكسوكرين وتشمل 1 -- 2 ٪ من البنكرياس بأكمله. هناك علاقة وثيقة بين الجسم والوزن البنكرياس. مجموع بيتا كتلة الخلايا يزيد أيضا نسبيا للتعويض عن الطلب على الأنسولين في الجسم. ما يهرب هذا التوسع متناسب هو توزيع حجم الجزر. الحيوانات الكبيرة مثل البشر حصة مماثلة مع توزيعات حجم جزيرة الفئران ، مما يشير إلى أن هذا الجهاز الصغير الحجم له حد معين لتكون وظيفية. يتم تعويض عجز بنكرياسات الحيوانات الكبيرة لتوليد الجزر أكبر نسبيا نتيجة للزيادة في عدد من الجزر ، وزيادة في نسبة أكبر الجزر في الجزيرة بشكل عام حجم التوزيع. علاوة على ذلك ، تبدي مرونة الجزر ضرب في تكوين الخلايا والعمارة بين الأنواع المختلفة ، وأيضا داخل نفس النوع في ظل الظروف الفيزيولوجية المرضية المختلفة. في هذه الدراسة ، ونحن تصف رواية نهج لتحليل بيانات الصور البيولوجي في سبيل تسهيل أتمتة العمليات التحليلية ، والتي تسمح لتحليل مجموعات البيانات الكبيرة وغير المتجانسة في دراسة مثل هذه العمليات البيولوجية الحيوية والهياكل المعقدة. وقد أعاقت هذه الدراسات بسبب الصعوبات التقنية لأخذ العينات غير منحازة وتوليد واسعة النطاق للقبض على مجموعات البيانات بدقة مدى تعقيد العمليات البيولوجية البيولوجيا جزيرة. هنا نعرض أساليب لجمع "ممثل" غير منحازة البيانات ضمن محدودية العينات (أو للتقليل من جمع العينات) وإعدادات القياسية التجريبية ، وعلى وجه التحديد إلى تحليل معقد ثلاثي الأبعاد هيكل الجزيرة. بمساعدة الحاسوب الآلي يسمح لجمع وتحليل البيانات لمجموعات واسعة النطاق وغير منحازة ويؤكد أيضا تفسير البيانات. وعلاوة على ذلك ، فإن القياس الكمي الدقيق لحجم التوزيع المكاني وينسق جزيرة (أي X ، Y ، Z - مناصب) لا يؤدي إلى تصور دقيق لهيكل جزيرة البنكرياس وتكوينها ، ولكن أيضا يتيح لنا التعرف على الأنماط خلال التنمية والتكيف مع الظروف تغيير من خلال النمذجة الرياضية. الأساليب المتقدمة في هذه الدراسة تنطبق على دراسات للكثير من النظم الأخرى والكائنات كذلك.

Protocol

1. خلق شرائح الظاهري من صور Immunohistochemically الملون

1. فتح StereoInvestigator. ضع الشريحة النظيفة عقد العينة في حامل المجهر وذلك في تصور الباحث ستيريو بالنقر على "شراء" ثم "صورة لايف" (اقتناء → الصورة الحية). تحديد مستويات التعرض لكل قناة ، في مثالنا محددة ، يتم استخدام القناة 2 لدابي ، القناة 3 للGFP ، القناة 4 لطلب تقديم العروض ، وقناة (5) لCy5 ، والقناة 6 لCy7. استخدام "الرسم البياني فيديو" نافذة ، الذي يعرض كثافة مضان ، لتحديد مستوى التعرض. ويتم الوصول إلى كثافات مضان المناسبة عند ذيول قبالة كثافة في الطرف الأيمن من الرسم البياني الفيديو. يمكن تغيير مستويات التعرض في إطار "إعدادات الكاميرا". ويمكن أن تركز على الرسم البياني فيديو مع المجهر عجلة التركيز.
2. قبل إنشاء شريحة الظاهري ، كفاف العينة عن طريق النقر على الشاشة في نقطة بعيدة من العينة ، والتي ستمثل نقطة مرجعية ، ثم النقر فوق حول الخطوط العريضة للعينة. عند اكتمال كفاف ، انقر فوق الحق واختر "كونتور إغلاق" لربط بداية ونقطة نهاية.
3. بمجرد أن يتم إغلاق كفاف ، التقاط شريحة الظاهري للعينة (اقتناء → اكتساب شريحة الظاهري). عندما تكون النافذة شريحة الخيارات مفتوحة الظاهري ، حدد "الحصول على سرعة عالية" ، وكذلك التركيز التلقائي بواسطة إلغاء تحديد المربع بجوار "يدوي". حفظ الملف.
4. ويجب معايرة شريحة الظاهري prefocus بتحديد (انقر على الحق → أضف الى التركيز قائمة الموقع) والتركيز يدويا عدة أقسام عشوائية ، أي المواقع ، في المعاينة شريحة الظاهري. عندما تركزت العديد من المواقع بدء شريحة الظاهري (انقر على الحق → ابدأ مع شريحة الظاهري Prefocus). بعد شريحة الظاهري للعينة الاولى هي استكمال ، والتبديل إلى القناة التالية وضبط التعرض تبعا لذلك. كرر الخطوات 4 و 5 لكل قناة.

2. بمساعدة الحاسوب تحليل ثنائي الأبعاد

الكمي للالفشوت

1. ثم تتم معالجة الصور باستخدام ماكرو ImageJ المسمى "IHCVS" ، والتي تعد first تحميل الصور للتحليل الكمي ثم ميزات الجزر مثل تكوين الخلوية (أي كل مجال من مجالات بيتا ، ألفا ، والسكان في الدلتا والخلايا ، والجزيرة المنطقة في قيمة المبلغ). يتم تقسيم المكدس في قنواتها منفصلة في ImageJ ، حيث كل قناة منفردة يظهر صورة منفصلة استنادا إلى تلطيخ المناعى. ومن ثم كل صورة thresholded تلقائيا ، وبعد ذلك يتم إنتاج صورة 8 بت بالأبيض والأسود ، أو قناعا ، من الصورة thresholded. ثم تضاف الصور قناة منفصلة معا حسابيا إلى قناع مركب ، وإجراء تحليل لImageJ الجسيمات مضمنة على الصورة المركبة.
2. ثم يتم تحديد رويس مع استبعاد جسيمات أصغر من خلية واحدة بيتا واحد (<170 ميكرومتر ⁽²⁾ ؛ منطقة محسوبة باستخدام قطرها ميكرون 15 ~ ؛ الحارة وآخرون ، 2003). وحلل رويس الناتجة وكميا باستخدام ImageJ ؛ الكمي يمكن أن تشمل محيط (على مسافة المحيطة للمنطقة) ، دائرية (درجة من الاستدارة حيث عدد 1.0 يصور دائرة الكمال) ، وقطره فيريه في (أطول مسافة داخل منطقة) ، ومركز إحداثيات لكل منطقة تحليلها بحيث يمكن توزيع جزيرة تحليلها رياضيا باستخدام تركيبات مختلفة من هذه المعلمات والمرسومة في الرسم البياني 3D ، والبيانات التي سيتم استخدامها للنمذجة الرياضية. ويتم تحليل واحد صورة شريحة الظاهرية في 30 ثانية. ويمكن تحليل صور متعددة عن طريق تضمين معالجة الصور والتحليل النصي في بناء الجملة حلقة تدعمها لغة الماكرو ImageJ. حلقة يفتح كل الملفات في دليل معين ، يحلل الصور والنواتج النتائج إلى موقع جديد على شكل ملف إكسل.
3. ويتم حفظ نتائج مجمعة في جدول بيانات Excel ، تخزين البيانات مثل المنطقة ، المحيط ، دائرية ، قطرها فيريه ، ومركز الجزيرة للكل جزيرة ، جنبا إلى جنب مع الأرقام المقابلة المسمى في الصورة.

الحسابية التحليل وإعداد الرسم البياني

1. وتستخدم البرامج النصية الرياضيات ، التي تعمل تلقائيا بمجرد البدء ، لمعالجة البيانات التي جمعت البيانات والتي تبلغ مئات الآلاف من الإدخالات. واحدة من العمليات المهمة التي يتم تشغيلها هو تحليل التردد ، الذي يبني الرسم البياني المستخدمة لدراسة حجم التوزيع وأيضا لتحديد القيم المتطرفة في البيانات. في إطار السيناريو ، يتم قياس المساحة الكلية جزيرة وبالمقارنة مع غيرها من المعالم ، وبخاصة إلى نقاط زمنية أو عمر البنكرياس ، ومن ثم عرضها وفقا لذلك في الرسم البياني.

3. ثلاثي الأبعاد التعمير اثنين من الأبعاد الملون Immunohistochemically صور شريحة الظاهري

3D إعادة إعمار شرائح الظاهري

1. نسخ البرنامج النصي ("im_jp2_2_tiff") إلى الدليل (أي مجلد) انيحتوي على صور JP2. تشغيل البرنامج النصي مع شركة شل لينكس عن طريق كتابة "./im_jp2_2_tiff" في وحدة التحكم ثم الضغط على دخول. وسوف يستخدم هذا البرنامج النصي تلقائيا تحويل كافة الصور JP2 في الدليل إلى ملفات TIFF ، وهي الصيغة المستخدمة في البناء النوعي والكمي لثلاثي الأبعاد كدسات من شرائح الظاهري. (ملاحظة : اكتب في "شمود + س im_jp2_2_tiff" إذا لم يتم تشغيل البرنامج النصي ، والذي سيتم تحويل الملف النصي إلى برنامج نصي بحيث يمكن تشغيلها بشكل صحيح)
2. عندما تم تحويل جميع الصور الملتقطة من JP2 إلى ملفات TIFF ، انهم على استعداد لاستخدامها في التحليل في ImageJ.
3. مع ImageJ ، وفتح جميع الصور للنموذج الأول (خمس صور في هذه الحالة : دابي ، GFP ، RFP ، Cy5 ، Cy7) ودمجها في صورة واحدة (صورة لون → → دمج القنوات). كرر هذه العملية لكل من العينات. عندما تم الجمع بين كل من العينات كصور واحد ، وتنظيف الصور من خلال تحديد المناطق غير المرغوب فيها مع "بوليجون اختيارات" أداة وملء لهم في (تحرير → التعبئة). (تغيير حجم الصور إلى حجم أصغر ، إذا لزم الأمر). ثم تحويل كل صورة إلى صورة لون RGB (صورة → → نوع RGB اللون). أخيرا ، إنشاء كومة من الصور (صورة صورة → → الأكوام إلى الأكوام) ، وبعد ذلك يمكن كذلك أن تكون متوافقة مع البرنامج المساعد "المكدس ريج" ، إذا لزم الأمر. في نهاية المطاف ، ودمج القنوات والجمع بين الصور ثم يخلق المونتاج 3D لجميع الجزر في البنكرياس بأكمله. لعرض الصور ، انقر على "الإضافات" ثم "3D المشاهد".

4. جزيرة رسم الخرائط

جمع صورة الأكوام

1. وضعه في البنكرياس الجزر جبل بأكمله تحت المجهر.
2. افتح البرنامج Slidebook. الوصول إلى "التقاط والتركيز التحكم" بالضغط "على Ctrl + Shift + E." في إطار "التركيز التحكم" ، حدد الهدف 20X أو 40X ، اعتمادا على حجم جزيرة. تطبق في حالة استخدام مياه الغمر هدف عدسة الماء.
3. من اجل استخدام العدسة المجهر لتحديد الجزر ومجموعة "بن" إلى 2X وتعيين عامل تصفية لتعيين User1 في إطار "عناصر بؤرة التركيز". يجب تعيين "اختيار الانبعاث" لعيون 100 ٪ والكثافة المحايدة إلى 1. انقر على زر "GFP EY" ثم "فتح فلور".
4. لتصور نموذج في Slidebook ، والعودة إلى التركيز الضوابط النافذة والتبديل "تعيين تصفية" إلى "لايف" وانقر على زر "GFP س". استخدم عصا التحكم للجزيرة في في الإطار 1 الكاميرا ، فضلا عن مركز ممكن. التركيز على عمق في مكان ما بالقرب من وسط الجزيرة ، حيث يمكن تمييز الخلايا بسهولة.
5. في "إطار التركيز تحكم" ، حدد "علامة Z". انقر فوق تعيين في الزاوية اليسرى العليا من النافذة لضبط عمق الحالي كنقطة مرجعية. استخدام نطاق السيطرة للانتقال إلى عمق العلوي للجزيرة التي يمكن تمييزها بوضوح ملامح وانقر "تعيين الأعلى". انتقل إلى الجزء السفلي من الجزيرة ثم انقر على "تعيين القاع". انقر على زر "الذهاب" للعودة الى نقطة مرجعية.
6. في إطار لقطة ، تعيين "عامل بن" إلى "2X" ومجموعة "تعيين تصفية" إلى "لايف". تعيين "نوع لقطة" إلى "3D" (و 3D فقط). على الجانب الأيمن من النافذة ، انقر فوق "استخدام المناصب العليا والسفلى". انقر على زر "العودة إلى نقطة مرجعية وبعد التقاط". تعيين "حجم الخطوة" الى "3".
7. تحت "مربع تعيين تصفية" ، حدد دابي DSU ، GFP DSU ، DSU RFP ، وDSU Cy5. لكل واحد ، انقر فوق "البحث عن أفضل" تحت عنوان "ضبط التعرض للضوء" ، ثم انقر فوق "اختبار" للتأكد من أن التعرض المحدد هو مناسب. انقر على زر "ابدأ" لبدء الالتقاط.
8. عند الانتهاء من التقاط الصور ، ضبط مستويات حسب الضرورة ، وتغيير لون لعرض RFP إلى الأبيض. حفظ الشريحة ثم انتقل إلى عرض → → تصدير TIFF السلسلة. اكتب في اسم الشريحة مع اندفاعة في النهاية وحفظه. يتم إنشاء العشرات من ملفات TIFF الفردية ، لذلك قد يكون من المفيد للحفاظ على كومة كل جزيرة من الصور في مجلد منفصل.

تعيين صورة الأكوام

1. فتح المحقق ستيريو. تصور صورة عن طريق فتح مداخن صورة (ملف → المكدس المكدس صورة صورة → فتح). في "تحجيم صورة القائمة" تعيين "المسافة بين الصور" إلى 3.00 ميكرون. لتصحيح binning 2X في Slidebook ، حدد "تجاوز X و Y تحجيم" و "المستخدم لتحديد مصدر X و Y" تحجيم ، وأدخل 0.65 لكل من X و Y.
2. مركز الصورة عن طريق النقر في وسط جزيرة من الاهتمام في "إطار ماكرو". علامة واحدة على الأقل خلية باستخدام العلامة المناسبة. خلايا بيتا ستظهر الخضراء ، وسوف تظهر خلايا ألفا الحمراء ، وخلايا دلتا سوف تظهر بيضاء ؛ ماركر استخدام 2 (دائرة مجوفة) بمناسبة بيتا الخلايا ، ماركر 5 (مثلث جوفاء) للاحتفال خلايا ألفا ، وماركر 6 ( مثلث جوفاء) إلى خلايا دلتا. يجب وضع علامة الخلايا في مركز النواة ، والتي سوف تظهر إذا كان قد تم الأزرق الملون العينة مع دابي.
3. مرة واحدة تم وضع علامة على الأقل خلية واحدة ، وعرض "عرض متعامد" باستخدام رمز في القائمة العلوية. تحقق "Z - تصفية" و "المتناظر". ق نطاقhould يتم تعيين إلى 15.00. بدءا من مستوى 0.0 Z ، انتقل من خلال جزيرة باستخدام عجلة الماوس وعلامة كل خلية مع علامة المناسبة. وينبغي أن تكون وضعت كل خلية مرة واحدة فقط في المركز من عمقها. عند الانتهاء من الاحتفال كل من Z - المستويات ، "Z - تصفية" مربع يمكن التحقق منه. هذا وسوف تظهر جميع العلامات من جميع Z - المستويات.
4. عندما تم وضع علامة كل خلية ، حفظ الملف كملف "دات" ، ثم انتقل إلى ملف → تصدير للبحث عن المفقودين. حفظ تتبع كملف "TXT". انقر فوق "ملف بيانات جديد" لمسح مساحة العمل قبل محاولة لرسم خريطة جديدة الجزر.

5. ممثل النتائج :

إعداد شرائح الظاهري من أصل عينة بنكرياس ملطخة immunohistochemically تمكن واحد لفحص كافة الخلايا الصماء (ألفا ، بيتا ، وخلايا دلتا) في البنكرياس كله ، وكلاهما معا في الجزر (الشكل 1A) وبشكل فردي في قنوات منفصلة ( الشكل 1B). بمساعدة من برامج الكمبيوتر والبرامج النصية ، ويمكن إجراء تحليل شامل للبيانات واسعة النطاق على هذه الشرائح الظاهري. على وجه التحديد ، تحليل مركب الجسيمات من الأقنعة (الشكل 1C) يتم إخراج كجدول إحصاءات يتضمن معايير مثل منطقة الجزيرة ، المحيط (المسافة المحيطة للمنطقة) ، دائرية (درجة من الاستدارة ، حيث يمثل 1.0 دائرة الكمال) ، و اكتشاف قطره فيريه في (أطول مسافة داخل منطقة) لكل جزيرة (1D الشكل). تحليل واسع النطاق لهذه النتائج في إنتاج الصور من إجمالي عدد جزيرة رسوم بيانية وحجم التوزيع فضلا عن مقارنة تفصيلية ألفا وبيتا ، ومناطق دلتا الخلية و. بالإضافة إلى ذلك ، أخذ كل شريحة الظاهري على عمق حوالي 5 ميكرون ، ويتم تكديس مزيد من كافة شرائح الفردية الظاهري 2D لإنشاء التعمير 3D البنكرياس من العينة كلها. جزيرة الخرائط يوضح مثال آخر ، ليس فقط لالتقاط الجزر في 3D ، ولكن أيضا من التحليل بمساعدة الحاسوب مفصل. خرائط جزيرة تتكون من القبض على الجزر متميزة (الشكل 2A) ، وما تلاه من وضع علامات على ألفا وبيتا ودلتا الخلايا في مختلف Z - الطائرات (الشكل 2B) لتصور an جزيرة في 3D (الشكل 2C ، D). التحليل الرياضي الآلي من الجزر معين يعرض تركيبتها الخلوية والهندسة المعمارية ، بما في ذلك خلية خلية مسافات (2E الشكل) والاحتمالات التراكمية للتوزيعات مسافة خلية خلية (الشكل 2F).

الشكل 1. اسعة النطاق التقاط وتحليل توزيع جزيرة باستخدام شريحة الظاهري. ألف شريحة عرض الظاهري من قسم البنكرياس الإنسان. أ. تلطيخ المناعى للأنسولين (الأخضر) ، الجلوكاجون (الحمراء) ، السوماتوستاتين (أبيض) ودابي (الأزرق). ب. تحويل 8 بت قناع بعد thresholding التلقائي. ويضاعف ألف محاصر في منطقة المشاهدات باء من كل قناة. أ. دلتا الخلايا ، (ب) خلايا بيتا ، ج. خلايا ألفا ، ود دمج الصور المركبة. جيم تحليل أداء الجسيمات على قناع مركب. لاحظ أن يتم ترقيم كل بنية الجزيرة بما في ذلك مجموعات الخلايا الصغيرة (تسليط الضوء الأزرق). دال الاحصائيات جدول معلمات مختلف الهياكل الفردية للقياس ، والتي معرفات التي تتوافق مع علامات تظهر في C.

الشكل 2. تحليل شريحة الظاهري المناعى. A. 3D مؤامرة مبعثر في الشكل 1 يظهر حجم وشكل توزيع كل جزيرة من قبل المعلمات مثل المجال ، دائرية قطرها وفيريه و. باء مؤامرة مبعثر 3D في الشكل 1 يبين التركيبة الخلوية جزيرة والحجم. جيم توزيع حجم جزيرة تحليل المقطع البشرية كلها من الشكل 1 المجهزة لتوزيع كثافة الاحتمال lognormal. دال التحليل الرياضي نسب تكوين الخلايا (خلايا بيتا في الخضراء ، وألفا في الخلايا الحمراء وخلايا دلتا باللون الأزرق) لكل بن جزيرة قطر فعالة في الشكل 1. E. أ جزيرة حجم التوزيع للتحليل عينات عشوائية المناعى (يسار). جزيرة توزيع حجم شريحة من التحليل الظاهري (يمين). ب. سجل المعتاد مقارنة قطعة تحليل عينات عشوائية المناعى (الحمراء) ، وشريحة الظاهرية (الأزرق).

تعيين الرقم جزيرة 3. التحليل الرياضي وتكوين الخلايا والهندسة المعمارية. ج : التقاط الشاشة يظهر طائرة واحدة من التنسيق كومة 3D بناؤها من الصور لجزيرة الإنسان تم الرفع الى محقق ستيريو (خلايا بيتا في الخضراء ، وألفا في الخلايا الحمراء ، خلايا في دلتا بيضاء ، ونوى في الزرقاء) . باء : الصور الإسفار (يسار) والبيانات المعينة المقابلة (يمين) في ثلاثة مستويات مختلفة التنسيق أظهرت في الفترة الفاصلة من 10 ميكرون. C : عرض ممثل 3D إعادة رسم خرائط جزيرة البيانات. دال : إعادة الإعمار 3D للجزيرة في الربع شرائح تستند إلى إحداثيات الخرائط التي حصلت عليها الجزيرة. E : التحليل الرياضي للتركيبة الخلوية والهندسة المعمارية. LEFT. التردد النسبي للخلية خلية المسافات بين اثنين من الخلايا في خلية واحدة السكان. الحق. التردد النسبي للخلية خلية المسافات بين اثنين من السكان مختلفة من الخلايا. F : كولموغوروف - سميرنوف (KS) الاختبار. اليسار. الاحتمالات التراكمية للخلية الى خلية للتوزيعات المسافة ألفا ألفا إلى وبيتا بيتا إلى وخلايا دلتا إلى الدلتا. الحق. مسافات KS لاحتمالات three المقابلة التراكمي.

Discussion

قدم بمساعدة الحاسوب على نطاق واسع وتقدير تحمل التصور هنا أربع نقاط رئيسية في الدراسات جزيرة البنكرياس : (1) تحليل واسع النطاق للعينات البنكرياس يوفر رؤية شاملة للجزيرة العام توزيع حجم وهيكل الجزيرة. (2) وإعادة الإعمار 3D والتحليل الرياضي لتكوين بنية الخلوية وزيادة تيسي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation	IX-81
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook		Program	Olympus