الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Summary

ويمكن الاستدلال على فيروس نقص المناعة البشرية من المنطقة tropism V3 من المغلف الفيروسية. V3 هو تضخيم PCR من ثلاث نسخ باستخدام المتداخلة RT - PCR ، متسلسلة ، وتفسيرها باستخدام البرمجيات بيوينفورمتيك. وتصنف مع عينات مع تسلسل 1 أو أكثر (s) مع عشرات g2P منخفضة غير R5 الفيروس.

Abstract

خلفية : قبل حصوله على المخدرات من فئة CCR5 - المتناحرين في علاج فيروس نقص المناعة البشرية ، يجب على المريض الخضوع لاختبار فيروس نقص المناعة البشرية tropism للتأكد من أن له أو لها السكان الفيروسية يستخدم coreceptor CCR5 لدخول الخليوي ، وليس coreceptor البديلة. نهج واحد لاختبار tropism هو دراسة تسلسل المنطقة V3 من المغلف فيروس نقص المناعة البشرية ، والتي تتفاعل مع coreceptor.

يتم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من بلازما الدم : الأساليب. يتم تضخيمه في المنطقة V3 في ثلاث نسخ مع متداخلة عكس المنتسخة - PCR. والتسلسل ثم التكبير وتحليلها باستخدام البرنامج ، RE_Call. ثم تقدم متواليات لخوارزمية بيوينفورمتيك مثل geno2pheno لاستنتاج tropism الفيروسية من المنطقة V3. ويستدل على أن يكون تسلسل غير R5 إذا بهم geno2pheno معدل ايجابية كاذبة ينخفض ​​5.75 ٪. إذا تم الاستدلال على أي واحد من ثلاثة من متواليات عينة غير قابلة للR5 ، والمريض من غير المرجح أن يستجيب لCCR5 - المتناحرين.

Protocol

الإجراء :

1. استخراج :

هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من بلازما الدم كمدخل العينة لهذا الاختبار الوراثي tropism فيروس نقص المناعة البشرية.

1. استخراج الحمض النووي الريبي من فيروس نقص المناعة البشرية 500μL البلازما باستخدام (bioMérieux) مستخرج easyMAG الآلي ، أو الأسلوب المفضل لاستخراج المختبر الخاص بك.
   أزل الحمض النووي الريبي المستخرج الفيروسية في قسامة 60 ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية أو تبدأ عكس المنتسخة - PCR مباشرة بعد استخراج.

2. RT - PCR :

سوف تتضخم 4μL لاستخراج عينة من ثلاث نسخ باستخدام المتداخلة RT - PCR الأساليب. يجب تعيين تفاعل RT - PCR في غرفة PCR - نظيفة.

1. حساب كمية كاشف اللازمة لعدد من العينات المراد توسيعها. اتبع الجدول أدناه يبين حجم الكاشف : 1 رد الفعل.
   

   الكاشف	الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل)
   المياه المعالجة DEPC	10.56
   2X رد فعل العازلة	20
   50 ٪ سكروز و 0.04 ٪ مزيج الأزرق bromophenol	4
   إلى الأمام التمهيدي التي تستهدف المنطقة V3 فيروس نقص المناعة البشرية	0.32
   عكس التمهيدي	0.32
   انزيم -- مرتفع الثالث من خطوة واحدة RT - PCR النظام مع البلاتين البلمرة DNA طق	0.8
   مجموع	36

   حجم الجدول الكاشف 1. المطلوبة : 1 تفاعل PCR RT خطوة واحدة.
   كل خطوة واحدة RT - PCR تفاعل يتطلب وصفة التالية :
   • 10.56 ميكرولتر DEPC المياه المعالجة
   • 20 ميكرولتر من رد فعل العازلة 2X
   • 4μL السكروز 50 ٪ و 0.04 ٪ مزيج الأزرق bromophenol
   • 0.32 ميكرولتر من التمهيدي الى الامام التي تستهدف المنطقة V3 فيروس نقص المناعة البشرية
   • 0.32 ميكرولتر من التمهيدي العكسي
   • 0.8 ميكرولتر من أنزيم
   ليصبح المجموع من ردود الفعل في 36μL.
2. حتى خط أنابيب استخراج عينة في صف واحد بجانب فارغة ، المسمى كذلك لوحة 96 - PCR.
3. باستخدام ماصة مكرر ، إضافة 36 ميكرولتر من مزيج العينة إلى كل بئر من لوحة PCR ، مثل أن هناك 3 الآبار المعدة لاستخراج كل عينة.
   * ملاحظة : يجب تنفيذ هذا الإجراء في ثلاث نسخ ، على الأقل ، لضمان أخذ عينات كافية من السكان الفيروسية.
4. باستخدام ماصة 8 قنوات متعددة ، إضافة لاستخراج عينة 4μL إلى كل من الآبار 3 الخمسين. نصائح تغيير بين كل إضافة.
5. تغطية الآبار مع قبعات الشريط PCR.
6. عندما يتم نقل comlete ، وضع لوحة في thermocycler PCR. تعيين thermocycler لتشغيل مع البرنامج التالي : 30 دقيقة عند 52 درجة مئوية في 2 دقيقة 94 درجة مئوية 40 دورات (15 ثانية في 94 درجة مئوية ، 30seconds عند درجة حرارة 55 مئوية و 1.5 دقيقة عند 68 درجة مئوية) 5 دقائق عند 68 درجة مئوية
7. إزالة لوحة من thermocycler PCR. يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لوحة.

انتقل إلى الخطوة الثانية الجولة PCR

3. الجولة الثانية PCR :

1. حساب كمية كاشف اللازمة لعدد من العينات المراد توسيعها. اتبع الجدول أدناه يبين حجم الكاشف : 1 رد الفعل.
   

   الكاشف	الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل)
   المياه المعالجة DEPC	13.45
   60 ٪ سكروز ، 0.08 ٪ مزيج الأحمر كريسول	2
   روش هاي فاي نظام الاحتياطي 2	2
   MgCl 2	0.8
   dNTP	0.16
   إلى الأمام PCR التمهيدي	0.15
   عكس PCR التمهيدي	0.15
   توسيع فاي انزيم	0.29
   مجموع	19

   الجدول 2. الكميات المطلوبة لالكاشف 1 من 2 تفاعل PCR الجولة ^{الثانية.}
   كل ثانية تفاعل PCR الدور يتطلب وصفة التالية :
   • 13.45 ميكرولتر DEPC المياه المعالجة
   • 2 ميكرولتر السكروز 60 ٪ ، 0.08 ٪ مزيج الأحمر كريسول
   • 2 ميكرولتر من الاحتياطي روش نظام هاي فاي 2
   • 0.8 ميكرولتر من 25 ملم MgCl ₂
   • 0.16 ميكرولتر من dNTP 25 مم
   • 0.15 ميكرولتر كل من الاشعال إلى الأمام وعكس PCR
   • 0.29 ميكرولتر انزيم فاي توسيع
   ليصبح المجموع 19 ميكرولتر في رد الفعل.
2. في غرفة PCR - نظيفة ، وذلك باستخدام ماصة مكرر ، إضافة 19 ميكرولتر من العازلة في رد فعل جيدا لوحة PCR نظيفة.
3. في آخر الغرفة التضخيم ، وذلك باستخدام ماصة 8 قنوات متعددة ، ونقل 1 ميكرولتر من القالب RT - PCR PCR العازلة في الجولة الثانية. نصائح تغيير بين كل إضافة.
4. تغطية الآبار مع القبعات ونقل الشريط PCR PCR لوحة الجولة الثانية لthermocycler.
5. تعيين thermocycler لتشغيل مع البرنامج التالي : 2 دقيقة 94 درجة مئوية في دورات من 35 (15 ثانية في 94 درجة مئوية و 30 ثانية عند درجة حرارة 55 مئوية ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية) 7 دقائق عند 72 درجة مئوية
6. إزالة لوحة من thermocycler بعد درجة الحرارة قد عادت الى 25 درجة مئوية.

4. هلام إستشراد :

من أجل تأكيد أنه تم تضخيم V3 المنطقة بنجاح ، يتم تنفيذ خطوة هلام إستشراد.

1. يعد agarose هلام مع 0.8 غرام من مسحوق agarose في 50 مل من الاحتياطي تاي 1X. اثارة وتذوب في الميكروويف لمدة دقيقة 1 ~ أو حتى يذوب تماما agarose.
2. إضافة 6 ميكرولتر من هلام SYBR آمنة وصمة عار في دوامة المزيج.
3. من أجل الحل في علبة هلام ، وإضافة ما يكفي من هلام أمشاط لاستيعاب عدد من الآبار PCR.
4. بمجرد أن يجف الجل ، إزالة أمشاط ووضع جل جل في الجهاز ، والتأكد من الغارقة تماما في 1X TAE العازلة.
5. باستخدام ماصة الأقنية 10 ميكرولتر ، إضافة 8μL من كل عينة إلى جانب PCR الخاصة به في هلام. تغطية لوحة PCR بعد أن أضيفت الى التكبير هلام.
6. إضافة 6 ميكرولتر من سلم ال DNA واحدة على الأقل بشكل جيد لكل صف.
7. تشغيل الجهاز في هلام 100V ~ ~ لمدة 10 دقائق ، والتأكد من أن العصابات لا تعمل قبالة هلام.
8. وضع الجل في الصعود إلى منار العابرة للأشعة فوق البنفسجية والتقاط صورة من هلام.
   سوف الآبار مع PCR - تضخيم الحمض النووي تظهر الضوء ، مما يشير إلى نجاح التضخيم.
9. علما جعل جميع العينات فيها ثلاثة التكبير والنجاح. إذا لزم الأمر ، كرر RT - PCR لتلك العينات مع أقل من 3 التكبير.

انتقل إلى التسلسل

5. التسلسل :

بعد أن تضخمت الفيروسية [كدنا] ، يمكن أن تكون على استعداد لعينات التسلسل. ينبغي للتفاعل التسلسل تجري في غرفة ما بعد التضخيم.

1. إزالة BigDye من الفريزر والاشعال التسلسل من الثلاجة. السماح للذوبان BigDye في درجة حرارة الغرفة ، لمدة لا تزيد 1 ساعة.
2. حساب كمية كاشف اللازمة لعدد من العينات ليتم تشغيلها. اتبع الجدول أدناه يبين حجم الكاشف : 1 رد الفعل.
   

   الكاشف	الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل)
   BigDye	0.3
   BigDye العازلة	2.1
   كتاب تمهيدي	2.6
   مجموع	5.0

   حجم الجدول الكاشف 3. المطلوبة : 1 تفاعل التسلسل.
   * ملاحظة : تحضير مزيج منفصلة لكل التمهيدي.
   ** ملاحظة : يمكن أن تكون على استعداد لاستخدام الاحتياطي BigDye في تفاعل التسلسل على النحو التالي : ميكس 17.5 مل من محلول هيدروكلوريد Trizma العازلة (1 م) (pH9.0) و 0.125 مل من كلوريد المغنيسيوم (1 M). جلب الحجم النهائي إلى 100 مليلتر من الماء الصف كاشف. يجب أن يتم تخزينها في هذا 2-8 درجة مئوية.
3. استخدام العمليات الحسابية من 3.3 ، وإعداد رد فعل التسلسل يمزج لكل التمهيدي ودوامة لمدة لا تتجاوز 5 ثوان. قسامة في أنابيب الشريط 0.2mL.
4. قسامة 5 ميكرولتر من التسلسل مزيج التفاعل في الآبار لوحة المناسبة باستخدام ماصة الأقنية. تغطية لوحة (ق) التي تحتوي على مزيج تسلسل تفاعل مع Kimwipe وتوضع جانبا.
5. يعد التخفيف من الناتج 01:15 تضخيم PCR وذلك بإضافة 180 ميكروليتر من الماء المعقم باكستر للمنتج PCR المتبقية.
6. ماصة 1 ميكرولتر من العينة المخففة إلى قاع الآبار لوحة المناسبة ، وتغيير نصائح ماصة.
7. عند الانتهاء من نقل العينات ، وختم لوحة مع الشريط القبعات ودوامة ل1 ثانية
8. وضع لوحة في جهاز للطرد المركزي. ضبط السرعة ل145g ، عندما تصل سرعة الدوران 145g ، والتوقف عن الدوران.
9. وضع لوحة في thermocycler (ق) لتعيين البرنامج التالي : 25 دورات (10 ثانية @ 96 درجة مئوية ، 5 ثوانى @ 50 درجة مئوية و 55 ثانية @ 60 درجة مئوية...) الحجم يجب ان تكون على الاقل 6μL . وينبغي أن تأخذ دورة حوالي 1.2 ساعات.

انتقل إلى هطول الأمطار

6. الأمطار :

ب "تنظيف" [كدنا] الفيروسية في أعقاب رد الفعل التسلسل ، نفذ الأمطار الإيثانول باستخدام الايثانول 95 ٪.

1. استرداد لوحة من thermocycler وتقديمهم إلى ampli بالوظائفfication الغرفة.
2. إزالة الشريط القبعات ووضعها في النظام على منشفة ورقية نظيفة أو Kimwipe.
3. ماصة 4μL من محلول العامل خلات الصوديوم EDTA ، إلى جانب كل عينة بشكل جيد. اضغط على لوحة بلطف حتى أن الحل الصوديوم EDTA - يسقط إلى قاع البئر. ويمكن استخدام نفس نصائح طالما أنها لا تتصل عينة في قاع البئر.
   * ملاحظة : يمكن تحضير المحلول يعمل خلات الصوديوم EDTA ، على النحو التالي :
   1. إعداد 3M خلات الصوديوم عن طريق إذابة 246،1 غراما من خلات الصوديوم في 1 لتر من الماء الصف كاشف. تصفية الحل عن طريق التصفية الدقيقة 0.45 وتجهيز 50 aliquots مل.
   2. تحضير ألبوم الحل خلات الصوديوم EDTA - (1.5 M NaOAc ، 250 مم EDTA) عن طريق خلط كميات متساوية من خلات الصوديوم (3 م) وحل EDTA (500 ملم) 8.0 درجة الحموضة.
   3. إعداد العمل EDTA - الصوديوم محلول خلات عن طريق خلط المرء لسهم جزء EDTA - الصوديوم مع محلول خلات ثلاثة أجزاء من الماء الصف كاشف (10 مل + 30 مل).
4. 40μL ماصة للمبردة الايثانول 95 ٪ على أن الجانب الآخر من عينة الآبار واستبدال القبعات القطاع.
5. ختم والقبعات ودوامة لوحة لمدة 10 ثانية. اضغط على لوحة لطرد أي فقاعات.
6. وضع لوحة في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، وبحد أقصى 2 ساعة.
7. 1. مرة واحدة حدث هطول الأمطار ، وإزالة لوحة من الثلاجة وضعها في جهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3700 دورة في الدقيقة.
   2. إزالة كمية مناسبة من دي مرحبا ، Formamide (النظم البيولوجية التطبيقية) من الفريزر لتمكينه من ذوبان الجليد قبل تمسخ.
   * ملاحظة : تمسخ من لوحة كاملة 96 - جيدا يتطلب من 960μL Formamide HiDi وبالتالي فإنه من المفيد أن تعد ~ 1.1mL aliquots مسبقا.
8. بعد إزالة لوحة الغزل وتجاهل القمم القطاع. عكس لوحة فوق حاوية النفايات (مثل صندوق للقمامة) وطاف على صب. التخلص من أي طاف المتبقية النشاف لوحات مقلوبة على منشفة ورقية.
9. 2 أضعاف ورقة من منشفة ورقية ومكان على سطح اللوحة. ضع وجهها إلى أسفل لوحة في أجهزة الطرد المركزي وتدور في 145g ، ووقف تدور عندما يصل إلى 145g.
10. إزالة لوحة من أجهزة الطرد المركزي والتحقق للتأكد من الآبار الفارغة. 155μL ماصة للمبردة الايثانول 95 ٪ في الآبار.
11. تجاهل طاف في حاوية النفايات وصمة عار على منشفة ورقية وكرر الطرد المركزي في 4.10.
12. عند إزالة لوحة من أجهزة الطرد المركزي ، ونبذ استخدام منشفة ورقية ، والسماح لوحة تقف مواجهة لمدة 2-5 دقائق للسماح أي الإيثانول المتبقية لتتبخر.

انتقل إلى تغيير طبيعة

7. تغيير طبيعة

1. استرداد Formamide HiDi المذوبة وصب في وعاء كبير بما فيه الكفاية لماصة الأقنية ،
   * ملاحظة : إذا كنت تستخدم قبل aliquoted التدابير كما لوحظ في 6.7b ، مطلوب أنبوب واحد عن كل لوحة 96 - جيدا ليتم تشغيلها.
2. باستخدام ماصة الأقنية ، وتوزيع 10μL من Formamide HiDi في جميع الآبار على لوحة ، بما في ذلك تلك التي هي فارغة.
3. تغطية صحن مع حصيرة الحاجز على شكل خاتم.
4. وضع لوحة في thermocycler في 90 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
5. تمسخ التالية ، وضع لوحة في حامل لوحة ثم تحميل في التسلسل. إيداع تخطيط تسلسل المعدة. يمكن أن تبقى في لوحات -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل تنفيذ تشغيل التسلسل.

8. تحليل البيانات الناتجة باستخدام قاعدة برامج الاتصال.

1. يذكر باستخدام قاعدة تنفيذ التلقائي الاتصال مع أي تدخل بشري واحد ، تغطية التمهيدي هو مقبول. ولنتذكر هو استدعاء قاعدة العرف البرمجيات التي يمكن العثور عليها على العنوان التالي : http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   * ملاحظة : مطلوب حساب للدخول. لإنشاء حساب ، انقر فوق "سجل" الموجود في صفحة تسجيل الدخول. بمجرد إنشاء حساب يمكنك الوصول إلى صفحة التحميل.
2. عند دخولك ، قد قمت بتحديد الملفات عينة للتحميل. تصفح باستخدام الخيار يمكنك تحديد تسلسل البيانات الخاصة بك الخام للتحميل بأقصى قدر من تحميل 20MB.
   * ملاحظة : نذكر ويب لن تقبل سوى ملفات البيانات والملفات وABI SCF في البريدي ، والقطران أو tar.gz الملف.
3. مرة واحدة وقد تم اختيار الملفات للتحميل ، واختيار التسلسل المرجعي الخاص بك. في هذه الحالة ، تأكد من تعيين تسلسل الإشارة إلى "V3". أنت الآن على استعداد لانقر فوق "البيانات العملية".
4. وتظهر البيانات التي تتم معالجتها على الجانب الأيمن من الصفحة تحت عنوان "نماذج الماضي". سيتم وضع كل مجموعة أو تشغيل نموذج معالجتها في المجلد المسمى مع التاريخ. ويمكن إعادة تسمية هذه بالنقر على "إعادة تسمية" الزر.
5. وبالنقر على مجلد إحضار قائمة من العينات. وقد فشلت تلك حمراء ، وتلك التي مرت الخضراء. بالنقر على عينة محددة و"عرض" الزر ، كنت قادرا على النظر في التسلسل. اتبع التعليمات التي تظهر على الجانب الأيمن من الصفحة للانتقال throuغ التسلسل.
   * ملاحظة : للحصول على هذا الأسلوب ، هو مقبول لتصدير متواليات التي تمر نذكر (كما هو موضح باللون الأخضر) تلقائيا ، دون تدخل يدوي.
6. إذا كنت راضيا عن النتائج التي يمكن أن تختار لتحميل سلاسل تمرير بالنقر على "حمل". سيتم تحميل الملفات الموجودة في مجلد مضغوط.
   * ملاحظة : في إطار "إعدادات" يمكنك تحديد خيارات التحميل والبريد الإلكتروني ، بما في ذلك النوع من الملفات.
7. وينبغي عدم reamplified عينات لانتاج متواليات ثلاث نسخ نظيفة في ثلاث نسخ من استخراجها. إذا فشل RePCR لتوفير تسلسل نظيفة ، والحد الأدنى من 2 متواليات مقبولة للاستخدام في الاستدلال tropism.

9. استنتاج Tropism الفيروسية من متواليات التي تم إنشاؤها بواسطة تسلسل عدد السكان استنادا به الرئيسان مستقبلات Geno2pheno الخوارزمية.

1. يمكن تشغيل الخدمة من خلال تسلسل coreceptor geno2pheno على العنوان التالي : http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
2. يمكن أن يكون المسمى لإيداع العينات كما تناسب المشاهدة. من القائمة المنسدلة لتحديد أهمية ، حدد "بقطع الأمثل على أساس تحليل البيانات السريرية من تحفيز (2 ٪ و 5،75 ٪ FPR)"
3. اختيار لتحميل أو لصق تسلسل للتحليل ، الملفات fasta مقبولة.
4. ويمكن تفسير FPR geno2pheno على النحو التالي : G2P FPR> 5.75 ممثلة للسكان R5 التي تستخدم الفيروسية ؛ المرجح للرد على الخصوم CCR5 G2P FPR <5.75 تمثيلية من السكان غير R5 الفيروسية ؛ المرجح للرد على الخصوم CCR5. G2P <2 من المستبعد جدا أن يكون أي رد على الخصوم CCR5. إذا تم الاستدلال على أي واحد من ثلاثة من متواليات عينة غير قابلة للR5 ، والمريض ليس من المرجح أن يستجيب لCCR5 - المتناحرين.

10. ممثل النتائج

عندما يتم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح وينبغي للمرء أن يتوقع أن تسلسل بنجاح أو 2 أو 3 مكررات لكل عينة. وينبغي أن تعمل جنبا إلى جنب مع عينات من السلبيات لا يوجد مؤشر على الحمض النووي الريبي. ينبغي أن الغالبية العظمى من متواليات "تمرير" basecalling التي تذكر.

على أساس توزيع R5 وغير R5 داخل السكان المجتمع الفيروسية ، يتوقع أن غالبية عينات من المرضى تم اختيارها عشوائيا لR5 التي تستخدم الفيروس. ما لم يكن ذلك في تصميم المشروع من شأنه أن توحي بغير ذلك ، ينبغي للمرء أن يتوقع أن يكون أكثر من غير R5 R5 العينات.

الجدول 1 ألف) وحدات التخزين المطلوبة : 1 كاشف رد فعل خطوة واحدة RT - PCR وباء) برنامج thermocycler اللازمة لتنفيذ رد فعل RT - PCR.

أ)

الكاشف	الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل)
المياه المعالجة DEPC	10.56
2X رد فعل العازلة	20
50 ٪ سكروز و 0.04 ٪ مزيج الأزرق bromophenol	4
SQV3F1 التمهيدي إلى الأمام	0.32
عكس التمهيدي CO602	0.32
انزيم -- مرتفع الثالث من خطوة واحدة RT - PCR النظام مع البلاتين البلمرة DNA طق	0.8
مجموع	36

* ملاحظة :
SQV3F1 تسلسل التمهيدي : 5 'CCA ATT GAG CCC ATA CAT TAT TGT 3'
CO602 تسلسل التمهيدي : 5 'دول مجلس التعاون الخليجي لجنة مناهضة التعذيب AGT GCT TGC TGC TCC TCC CAA GAA CC 3'

ب)

عدد دورات	مرة	درجة الحرارة
1	30minutes	52 درجة مئوية
1	2minutes	94 درجة مئوية
40	15seconds	94 درجة مئوية
	30seconds	55 درجة مئوية
	1.5minutes	68 درجة مئوية
1	5minutes	68 درجة مئوية

الجدول 2 ألف) وحدات التخزين المطلوبة : 1 كاشف تفاعل PCR الجولة الثانية وباء) برنامج thermocycler اللازمة لتنفيذ ثاني رد فعل PCR الجولة.

أ)

الكاشف	الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل)
المياه المعالجة DEPC	13.45
60 ٪ سكروز ، 0.08 ٪ مزيج الأحمر كريسول	2
روش هاي فاي نظام الاحتياطي 2	2
MgCl 2	0.8
dNTP	0.16
SQV3F2 التمهيدي إلى الأمام	0.15
عكس التمهيدي CD4R	0.15
توسيع فاي انزيم	0.29
مجموع	19

* ملاحظة :
SQV3F2 تسلسل التمهيدي : 5 'CCA TGT دول مجلس التعاون الخليجي GCT GGT TTT فريق التنسيق العالمي في 3'
CD4R تسلسل التمهيدي : 5 'TCA TAT AAT CTT TCC CTC TTG CAA 3'

ب)

عدد دورات	مرة	درجة الحرارة
1	2minutes	94 درجة مئوية
35	15seconds	94 درجة مئوية
30seconds	55 درجة مئوية
1minute	72 ° C
1	7minutes	72 ° C

الجدول 3 ألف) وحدات التخزين المطلوبة : 1 كاشف تفاعل التسلسل وباء) برنامج thermocycler اللازمة لتنفيذ رد فعل التسلسل.

أ)

الكاشف	الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل)
BigDye	0.3
BigDye العازلة	2.1
كتاب تمهيدي إلى الأمام V3FO2F عكس SQV3R1	2.6
مجموع	5.0

* ملاحظة : لا تجمع بين أجهزة الاشعال ، وينبغي إعداد مزيج منفصلة لكل التمهيدي
V3O2F تسلسل التمهيدي : 5 'AAT AGY GTC ACA GTA الجهاز المركزي للمحاسبات TGT ACA C 3'
SQV3R1 تسلسل التمهيدي : 5 'TTC AAA GAA TCC CCT ACA ATT AAA 3'

ب)

عدد دورات	مرة	درجة الحرارة
25	10seconds	96 درجة مئوية
5seconds	50 درجة مئوية
55seconds	60 درجة مئوية

Discussion

الطريقة المعروضة هنا هي طريقة التسلسل القياسية المطبقة على اختبار tropism. التطبيق السريري لفيروس نقص المناعة البشرية المغلف حلقة V3 تسلسل للتنبؤ tropism الفيروسية وحتى وقت متأخر كان محدودا. وقد تبين أن هذا الأسلوب ، في تحليلات بأثر رجعي للمحاكمات (فييف الرعاية الصحية) maraviroc السريرية ، لتكون قادرة على قدم المساواة في الحد الأدنى للتنبؤ الفيروسي في tropism بالمقارنة مع غيرها من فحوصات التحقق من صحة استخدامها سريريا.

هناك العديد من الفوائد لأداء تحليل الوراثي من الحلقة V3 للتنبؤ tropism. أولا وأخيرا ، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أي منشأة بمعدات تسلسل العمليات ، زيادة كبيرة في الوصول وتقليل الفترة الزمنية اللازمة لاختبار tropism. في المقارنة ، يتم تنفيذ المظهري Trofile الحساسية الفحص المعزز (ESTA) (حرف واحد فقط العلوم البيولوجية) ، والتي كانت بمثابة معيار الذهب لاختبار tropism ، في مركز واحد في جنوب كاليفورنيا. مزايا إضافية تشمل متطلبات أقل من المواد ابتداء والحد الأدنى المطلوب تحميل البلازما الفيروسية 500copies/mL. كذلك ، فإن التكاليف التشغيلية لتشغيل الفحص الوراثي منخفضة نسبيا بالمقارنة مع تلك التي لفحص المظهري. استخدام البرمجيات نتذكر بشكل خاص يلغي الحاجة إلى استعراض التسلسل اليدوي ، الذي يميل إلى أن يكون جزءا من العمل المكثف يحلل التركيب الوراثي.

الطريقة المعروضة هنا واضحة إلى حد ما ، مع عدم وجود خطوة معينة أخرى تفوق في أهميتها. نحن لا نقترح تشغيل PCR والتسلسل في ثلاث نسخ لزيادة احتمالات الأنواع التقاط أقلية بين السكان الفيروسية لعينة. لا يمكن أن يؤديها يعيد أكبر من ثلاثة ، إلا أننا وجدنا أن كلا triplicates كفاءة وموثوق بها. علينا أيضا أن توحي باستخدام خطوة واحدة عكس المنتسخة PCR كيت (Qiagen) الذي ينفذ على حد سواء RT - PCR PCR وأول جولة في نفس رد الفعل مع الحفاظ على خصوصية وحساسية عالية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0	bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water	Ambion	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	cat. # 1 759 078	Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide	Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences