Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Riepilogo

Tropismo dell'HIV può essere dedotta dalla regione V3 della busta virale. V3 è amplificato mediante PCR in triplice copia tramite nested RT-PCR, in sequenza, e interpretato utilizzando il software bioinformatico. I campioni con con sequenza di 1 o più (s) con punteggi bassi G2P sono classificati come non-R5 virus.

Abstract

Premessa: Prima di ricevere un farmaco da CCR5-antagonista di classe nella terapia anti-HIV, un paziente deve sottoporsi a un test HIV tropismo per confermare che la sua popolazione virale utilizza il corecettore CCR5 per entrare cellulare, e non un corecettore alternativa. Un approccio ai test tropismo è quello di esaminare la sequenza della regione V3 della busta HIV, che interagisce con il corecettore.

Metodi: L'RNA virale è estratto dal plasma sanguigno. La regione V3 è amplificata in triplice copia con nidificate trascrittasi inversa-PCR. Le amplificazioni sono poi sequenziato e analizzato utilizzando il software, RE_Call. Le sequenze vengono poi sottoposti ad un algoritmo di bioinformatica come geno2pheno dedurre tropismo virale della regione V3. Sequenze sono considerati come se fossero non-R5 geno2pheno se il loro tasso di falsi positivi è inferiore al 5,75%. Se uno dei tre sequenze da un campione si deduce come non-R5, il paziente è improbabile che per rispondere a un CCR5-antagonista.

Protocollo

Procedimento:

1. Estrazione:

Almeno 500 ml di plasma sanguigno è necessaria come input di esempio per questa genotipiche prova tropismo dell'HIV.

1. Estratto da HIV RNA 500μL di plasma con un (bioMérieux) easyMAG estrattore automatico, o il metodo di estrazione preferito del vostro laboratorio.
   Eluire l'RNA virale estratto in una aliquota 60 microlitri. Conservare a -20 gradi Celsius o iniziare trascrittasi inversa-PCR subito dopo l'estrazione.

2. RT-PCR:

4μL di estratto di campione saranno amplificati in triplicato mediante nested RT-PCR metodi. La RT-PCR reazione deve essere installato in una PCR-camera bianca.

1. Calcolare la quantità di reagente necessario per il numero di campioni da amplificare. Seguite la seguente tabella indicando volumi di reagente per 1 reazione.
   

   Reagente	Volume (mL) (1X reazione)
   DEPC acqua trattata	10,56
   Reazione del buffer 2x	20
   50% di saccarosio e 0,04% mix bromofenolo blu	4
   Primer forward targeting della regione V3 di HIV	0,32
   Primer retromarcia	0,32
   Enzima - SuperScript III One-Step RT-PCR System con Platinum Taq DNA polimerasi	0,8
   Totale	36

   Tabella 1. Volumi dei reagenti necessari per 1 reazione di One-Step RT PCR.
   Ogni passo uno RT-PCR reazione richiede la seguente ricetta:
   • 10,56 microlitri di acqua trattata DEPC
   • 20 l di tampone di reazione 2x
   • 4μL del 50% di saccarosio e 0,04% mix bromofenolo blu
   • 0,32 ml di primer avanti targeting della regione V3 di HIV
   • 0,32 ml di primer reverse
   • 0,8 l di enzima
   Per un totale di 36μL per reazione.
2. Allineare i tubi estratto del campione in fila accanto a una vuota, etichettato a 96 pozzetti PCR.
3. Usando una pipetta ripetitore, aggiungere 36 ml di miscela campione in ciascun pozzetto della piastra di PCR, tale che ci sono 3 pozzi per ciascun campione.
   * Nota: Questa procedura deve essere eseguita in triplice copia, come minimo, per assicurare adeguato campionamento della popolazione virale.
4. L'utilizzo di un 8-canali pipetta multicanale, aggiungere 4μL dell'estratto del campione a ciascuno dei suoi 3 pozzi. Cambia punte tra ogni aggiunta.
5. Coprire i pozzetti con PCR tappi striscia.
6. Quando il trasferimento è comlete, posizionare la piastra PCR in un termociclatore. Impostare il termociclatore a correre con il seguente programma: 30 minuti a 52 ° C 2 minuti a 94 ° C di 40 cicli (15 secondi a 94 ° C, 30 secondi a 55 ° C e 1,5 minuti a 68 ° C) 5 minuti a 68 ° C
7. Rimuovere la piastra PCR da termociclatore. Piastra può essere conservato a temperatura ambiente.

Procedere alla seconda fase l'PCR

3. Secondo turno PCR:

1. Calcolare la quantità di reagente necessario per il numero di campioni da amplificare. Seguite la seguente tabella indicando volumi di reagente per 1 reazione.
   

   Reagente	Volume (mL) (1X reazione)
   DEPC acqua trattata	13,45
   60% di saccarosio, 0,08% cresolo miscela rosso	2
   Roche HiFi sistema buffer 2	2
   MgCl 2	0,8
   dNTP	0,16
   Avanti PCR Primer	0,15
   Reverse PCR Primer	0,15
   Expand HiFi enzima	0,29
   Totale	19

   Tabella 2. Volumi dei reagenti necessari per 1 reazione del 2 ^° turno PCR.
   Ogni secondo turno reazione PCR richiede la seguente ricetta:
   • 13,45 microlitri di acqua trattata DEPC
   • 2 microlitri di saccarosio 60%, 0,08% cresolo miscela rosso
   • 2 ml di Buffer Roche Hifi sistema 2
   • 0,8 ml di 25 mM MgCl ₂
   • 0,16 ml di 25 mM dNTP
   • 0,15 microlitri di entrambi gli avanti e indietro primer PCR
   • 0,29 microlitri Expand HiFi enzima
   Per un totale di 19 microlitri per reazione.
2. In una PCR-camera bianca, con una pipetta ripetitore, aggiungere 19 ml di tampone di reazione per bene a un piatto pulito PCR.
3. In una stanza posta amplificazione, con un 8-canali pipetta multicanale, trasferire 1 ml di RT-PCR modello nel secondo turno del buffer PCR. Cambia punte tra ogni aggiunta.
4. Coprire i pozzetti con PCR tappi striscia e trasferire il secondo turno piastra PCR ad un termociclatore.
5. Impostare il termociclatore a correre con il seguente programma: 2 minuti a 94 ° C di 35 cicli (15 secondi a 94 ° C, 30 secondi a 55 ° C, 1 minuto a 72 ° C) 7 minuti a 72 ° C
6. Rimuovere la piastra dal termociclatore dopo che la temperatura è tornata a 25 ° C.

4. Gel elettroforesi:

Al fine di confermare che la regione V3 è stato amplificato con successo, un passo elettroforesi su gel viene eseguita.

1. Preparare un gel di agarosio con 0,8 g di agarosio in polvere in 50 ml di tampone TAE 1X. Mescolare e fondere nel forno a microonde per circa 1 minuto o fino a quando agarosio è completamente sciolto.
2. Aggiungere 6 ml di gel SYBR sicuro macchia e mescolare.
3. Versare la soluzione in un vassoio gel, e aggiungere abbastanza gel pettini per accogliere il numero di PCR pozzi.
4. Una volta che il gel è asciutto, rimuovere i pettini e posizionare il gel nell'apparato gel, assicurandosi che sia completamente immersi in tampone TAE 1X.
5. Utilizzando un 10 microlitri pipetta multicanale, aggiungere 8μL di ogni campione PCR al suo bene proprio nel gel. Coprire la piastra PCR dopo le amplificazioni sono state aggiunte al gel.
6. Aggiungere 6 ml di scala del DNA per almeno un pozzetto per riga.
7. Eseguire l'apparato gel a 100V ~ per ~ 10 minuti, facendo attenzione che la band non si esegue il gel.
8. Posizionare il gel su un trans-illuminatore UV e scattare una foto del gel.
   Wells con PCR-amplificato DNA di colore chiaro, indicando una amplificazione di successo.
9. Prendere nota di tutti i campioni, dove tre amplificazioni sono state successo. Se necessario, ripetere RT-PCR per i campioni con meno di 3 amplificazioni.

Procedere al sequenziamento

5. Sequencing:

Dopo aver amplificato cDNA virale, i campioni possono essere preparati per il sequenziamento. La reazione di sequenziamento dovrebbe avvenire in una camera di post-amplificazione.

1. Rimuovere BigDye dal congelatore e primer di sequenziamento dal frigorifero. Lasciate che il disgelo BigDye a temperatura ambiente, per non più di 1 ora.
2. Calcolare la quantità di reagente necessario per il numero di campioni da eseguire. Seguite la seguente tabella indicando volumi di reagente per 1 reazione.
   

   Reagente	Volume (mL) (1X reazione)
   BigDye	0,3
   BigDye Buffer	2,1
   Primer	2,6
   Totale	5.0

   Tabella 3. Volumi dei reagenti necessari per 1 reazione di sequenziamento.
   * Nota: preparare una miscela separata per ogni primer.
   ** Nota: il buffer BigDye utilizzato nella reazione di sequenziamento può essere preparato come segue: mescolare 17,5 mL di soluzione tampone cloridrato Trizma (1 M) (pH9.0) e 0,125 ml di cloruro di magnesio (1 M). Portare il volume finale a 100 mL con acqua per reagenti. Questo deve essere conservato a 2-8 ° C.
3. Utilizzando i calcoli da 3,3, preparare la reazione di sequenziamento miscele per ciascun primer e vortex per non più di 5 secondi. Aliquota in tubi striscia 0,2 ml.
4. Aliquota 5 l di sequenziamento miscela di reazione nei pozzetti della piastra appropriato utilizzando una pipetta multicanale. Coprire la piastra (s) contenente miscela di reazione di sequenziamento con un Kimwipe e mettere da parte.
5. Preparare una diluizione 1:15 del prodotto di PCR amplificato con l'aggiunta di 180 ml di acqua sterile Baxter per il prodotto rimanente PCR.
6. Pipettare 1 ml di campione diluito al fondo dei pozzetti piastra appropriato, puntali.
7. Una volta terminato il trasferimento del campione, sigillare il piatto con tappi striscia e vortex per 1 secondo
8. Porre la piastra in una centrifuga. Impostare la velocità di 145 g, quando la velocità di centrifuga raggiunge i 145 g, arrestare la spirale.
9. Porre la piastra in un termociclatore (s) impostata al seguente programma: 25 cicli di (10 sec @ 96 ° C, 5 sec a 50 ° C, 55 sec a 60 ° C...) Il volume deve essere almeno 6μL . Il ciclo dovrebbe prendere circa 1,2 ore.

Procedere alla precipitazione

6. Precipitazioni:

Per "ripulire" il cDNA virale in seguito alla reazione di sequenziamento, eseguire precipitazione in etanolo con etanolo al 95%.

1. Recuperare piastra dal termociclatore e portare a un post-amplicazione stanza.
2. Rimuovere i tappi di striscia e metterli in ordine su un tovagliolo di carta pulito o Kimwipe.
3. Pipettare 4μL di lavoro con EDTA la soluzione di sodio acetato a lato di ogni campione. Toccare la piastra delicatamente in modo che l'EDTA-Soluzione cade sul fondo del pozzo. Le punte stesso può essere utilizzato a patto che non entrino in contatto con il campione sul fondo del pozzo.
   * Nota: L'EDTA-Soluzione di acetato di lavoro può essere preparato come segue:
   1. Preparare acetato di sodio 3M sciogliendo 246,1 g di acetato di sodio in 1 l di acqua per reagenti. Filtrare la soluzione attraverso un micro-filtro da 0,45 e preparare aliquote di 50 ml.
   2. Preparare Archivi-EDTA la soluzione di sodio acetato (1,5 M NaOAc, 250 mM EDTA) mescolando volumi uguali di acetato di sodio (3 M) e la soluzione di EDTA (500 mm) pH 8.0.
   3. Preparare lavoro-EDTA la soluzione di sodio acetato mescolando uno stock parte EDTA la soluzione di sodio acetato con tre parti di acqua per reagenti (10 ml + 30 ml).
4. 40μL pipetta di acqua refrigerata etanolo al 95% sul lato opposto a dei pozzetti del campione e sostituire i tappi striscia.
5. Sigillare i tappi e vortice la piastra per 10 secondi. Toccare la piastra per rimuovere eventuali bolle.
6. Posizionare la piastra in freezer a -20 ° C per un minimo di 30 minuti e un massimo di 2 ore.
7. 1. Una volta che le precipitazioni si è verificato, rimuovere la piastra dal freezer e posto in una centrifuga per 20 minuti a 3700 giri al minuto.
   2. Rimuovere la giusta quantità di Hi-Di Formammide (Applied Biosystems) dal freezer per permettergli di scongelare prima di denaturazione.
   * Nota: denaturazione di un piatto pieno a 96 pozzetti richiede 960μL di Formammide Hidi e quindi è vantaggioso per preparare ~ 1.1mL aliquote in anticipo.
8. Dopo la filatura la piastra di rimuovere ed eliminare i tappi striscia. Capovolgere la piastra sopra il contenitore dei rifiuti (cassonetto per esempio) e decantare il surnatante. Eliminare eventuali surnatante rimanente tamponando le piastre rovesciata su carta assorbente.
9. Piegare 2 fogli di carta assorbente e posto sulla superficie della piastra. Posizionare la piastra faccia in giù nella centrifuga e far girare a 145 g, fermare la rotazione quando raggiunge 145g.
10. Rimuovere la placca dalla centrifuga e controllare per essere sicuri che i pozzi sono vuoti. 155μL pipetta di acqua refrigerata etanolo al 95% nei pozzetti.
11. Scartare il sopranatante nel contenitore dei rifiuti e asciugare su carta assorbente e ripetere la centrifugazione a 4.10.
12. Al momento di rimuovere la placca dalla centrifuga, scartare fazzoletto di carta usato e lasciate stare piatto rivolto verso l'alto per 2-5 minuti per consentire l'etanolo residuo di evaporare.

Procedere alla denaturazione

7. Denaturazione

1. Recuperare il Formammide Hidi scongelati e decantare in un contenitore abbastanza grande per una pipetta multicanale,
   * Nota: In caso di utilizzo pre-aliquotati misure come indicato nel 6,7 B, un tubo è richiesto per ogni piastra con 96 pozzetti da eseguire.
2. Utilizzando una pipetta multicanale, distribuire 10μL di Formammide Hidi in tutti i pozzetti sulla piastra, compresi quelli che sono vuoti.
3. Coprire la piastra con una stuoia setti per formare un sigillo.
4. Porre la piastra in un termociclatore a 90 ° C per 2 minuti.
5. Previa denaturazione, posizionare il piatto in un portatarga quindi caricare nel sequencer. Carica un layout preparato sequenziamento. Piastre possono essere conservati a -20 ° C fino ad una settimana prima di effettuare la corsa di sequenziamento.

8. Analizzando i dati risultanti utilizzando Calling software di base.

1. Utilizzando ReCall eseguire base di automatica chiamando senza alcun intervento umano, la copertura innesco singolo è accettabile. ReCall è un software personalizzato chiamata di base che si possono trovare al seguente URL: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   * Nota: Un conto è necessario effettuare il login. Per configurare un account, fare clic sul pulsante "Registrati" alla pagina di login. Una volta che l'account è stato creato è possibile accedere alla pagina di upload.
2. Quando connesso, è possibile selezionare file di esempio per l'upload. Utilizzando l'opzione Sfoglia è possibile individuare i vostri dati grezzi sequenziamento per l'upload con un upload massimo di 20Mb.
   * Nota:... Ricordiamo Web accetterà solo i file di dati come file di ABI e SCF in un zip, tar o tar.gz
3. Una volta che i file da caricare sono stati selezionati, scegliere la sequenza di riferimento. In questo caso, assicurarsi che la sequenza di riferimento è impostato su 'V3'. Ora siete pronti a cliccare su "dati di processo."
4. Dati trattati appariranno sul lato destro della pagina sotto il titolo "I campioni del passato." Ogni set di eseguire o campione elaborati saranno inseriti in una cartella denominata con la data. Questi possono essere ri-etichettati facendo clic sul pulsante "Rinomina".
5. Cliccando sulla cartella, si apre un elenco di campioni. Quelli che sono di colore rosso hanno fallito, quelli che sono di colore verde sono passati. Facendo clic su un campione specifico e il pulsante "Visualizza", è in grado di valutare la sequenza. Seguire le istruzioni sul lato destro della pagina per navigare through la sequenza.
   * Nota: Per questo metodo, è accettabile per esportare le sequenze che passano richiamo (in verde) in modo automatico, senza intervento manuale.
6. Se si è soddisfatti dei risultati è possibile scegliere di scaricare le sequenze di passaggio facendo clic su "Download". I file verranno scaricati in una cartella zip.
   * Nota: alla voce "Impostazioni" è possibile selezionare le opzioni di download ed e-mail, tra cui il tipo di file.
7. I campioni in mancanza di produrre sequenze triplice copia pulita dovrebbe essere reamplified in triplice copia da estrarre. Se RePCR non riesce a fornire una sequenza pulita, un minimo di 2 sequenze è accettabile per l'uso in inferenza tropismo.

9. Inferendo tropismo virale da sequenze generate da basati sulla popolazione sequenziamento utilizzando il co-recettore Geno2pheno Algoritmo.

1. Le sequenze possono essere eseguite attraverso il servizio geno2pheno corecettore al seguente URL: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
2. I campioni di upload può essere etichettato come forma visto. Dal menu a discesa della regolazione significato, selezionare l'opzione "cut-off ottimizzata basata sull'analisi dei dati clinici da MOTIVATE (2% e al 5,75% FPR)"
3. Scegliere di caricare o incollare una sequenza di analisi, i file FASTA sono accettabili.
4. Il FPR geno2pheno può essere interpretato come segue: G2P FPR> 5,75 è rappresentativo di una R5-con popolazione virale; probabilità di risposta al antagonisti CCR5 G2P FPR <5,75 è rappresentativo di un non-R5 popolazione virale, probabilmente per rispondere alle antagonisti CCR5. G2P <2 è molto improbabile che qualsiasi risposta alle antagonisti CCR5. Se uno dei tre sequenze da un campione si deduce come non-R5, il paziente non è in grado di rispondere ad una CCR5-antagonista.

10. Rappresentante Risultati

Quando il protocollo è eseguita correttamente si dovrebbe aspettare di successo sequenza di 2 o 3 repliche per ogni campione. Negativi costeggiano i campioni devono avere alcuna indicazione di RNA. La maggior parte delle sequenze dovrebbe "passare" da basecalling ReCall.

Basato sulla distribuzione di R5 e non-R5 all'interno della popolazione virale comunità, la maggior parte dei campioni dei pazienti scelti a caso ci si aspetterebbe di avere R5-usando virus. Quindi a meno che il disegno del progetto possano indicare il contrario, ci si dovrebbe aspettare di avere più rispetto ai non-R5 R5 campioni.

Tabella 1. A) I volumi di reagente necessario per 1 reazione di One Step RT-PCR e B) il programma termociclatore necessarie per effettuare la RT-PCR, reazione.

A)

Reagente	Volume (mL) (1X reazione)
DEPC acqua trattata	10,56
Reazione del buffer 2x	20
50% di saccarosio e 0,04% mix bromofenolo blu	4
Avanti fondo SQV3F1	0,32
Primer reverse CO602	0,32
Enzima - SuperScript III One-Step RT-PCR System con Platinum Taq DNA polimerasi	0,8
Totale	36

* Nota:
SQV3F1 sequenza di fondo: 5 'GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3'
CO602 sequenza di fondo: 5 'GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3'

B)

Numero di cicli	Tempo	Temperatura
1	30 minuti	52 ° C
1	2 minuti	94 ° C
40	15 secondi	94 ° C
	30 secondi	55 ° C
	1,5 minuti	68 ° C
1	5 minuti	68 ° C

Tabella 2. A) I volumi di reagente necessario per 1 reazione di PCR e secondo turno B) il programma termociclatore necessarie per effettuare il secondo turno di reazione PCR.

A)

Reagente	Volume (mL) (1X reazione)
DEPC acqua trattata	13,45
60% di saccarosio, 0,08% cresolo miscela rosso	2
Roche HiFi sistema buffer 2	2
MgCl 2	0,8
dNTP	0,16
Avanti fondo SQV3F2	0,15
Primer CD4R retromarcia	0,15
Expand HiFi enzima	0,29
Totale	19

* Nota:
SQV3F2 sequenza di fondo: 5 'TGT GCC CCA GCT TTT GGT GCG A 3'
CD4R sequenza di fondo: 5 'TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'

B)

Numero di cicli	Tempo	Temperatura
1	2 minuti	94 ° C
35	15 secondi	94 ° C
30 secondi	55 ° C
1 minuto	72 ° C
1	7 minuti	72 ° C

Tabella 3. A) I volumi di reagente necessario per 1 reazione di sequenziamento e B) il programma termociclatore necessarie per effettuare la reazione di sequenziamento.

A)

Reagente	Volume (mL) (1X reazione)
BigDye	0,3
BigDye Buffer	2,1
Primer Avanti V3FO2F Reverse SQV3R1	2,6
Totale	5.0

* Nota: NON combinare primer, un mix separato deve essere preparato per ogni primer
V3O2F sequenza di fondo: 5 'AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1 sequenza di fondo: 5 'GAA AAA TTC CCT CCT ACA ATT AAA 3'

B)

Numero di cicli	Tempo	Temperatura
25	10 secondi	96 ° C
5 secondi	50 ° C
55 secondi	60 ° C

Discussione

Il metodo qui presentato è un metodo di sequenziamento standard applicata ai test tropismo. L'applicazione clinica di loop V3 busta HIV sequenziamento di prevedere tropismo virale è stata limitata fino alla fine. Questo metodo è stato dimostrato, nelle analisi retrospettiva del maraviroc (ViiV Healthcare) le sperimentazioni cliniche, devono essere al minimo ugualmente in grado di prevedere tropismo virale rispetto ad altri test validati nella pratica clinica.

Ci sono molti vantaggi per l'esecuzione di analisi genotipica del ciclo V3 per la previsione tropismo. In primo luogo, questa procedura può essere eseguita in qualsiasi struttura con attrezzature sequenza operativa, aumentando notevolmente l'accessibilità e riducendo i tempi di risposta del test tropismo. In confronto, l'analisi fenotipica avanzata Trofile Sensibilità (ESTA) (Monogram Biosciences), che ha servito come il gold standard per i test tropismo, sono effettuati presso un centro nel sud della California. Ulteriori vantaggi includono l'obbligo di meno materiale di partenza e un carico minimo richiesto virale plasmatica di 500copies/mL. Inoltre, i costi operativi di esecuzione del test genotipici sono relativamente bassi in confronto a quelle di un test fenotipici. L'utilizzo del software ricordiamo in particolare elimina la necessità di rivedere la sequenza manuale, che tende ad essere una parte del lavoro intensivo di analisi genotipo.

Il metodo qui presentato è abbastanza semplice, che non compensa un altro passo particolare importanza. Facciamo suggeriamo di eseguire PCR e il sequenziamento in triplice copia per aumentare le probabilità di catturare specie di minoranza all'interno della popolazione virale di un campione. Replica superiore a tre può essere eseguita, però abbiamo trovato triplica essere sia efficiente ed affidabile. Suggeriamo inoltre di utilizzare il One-Step della trascrittasi inversa PCR Kit (Qiagen), che esegue sia RT-PCR e PCR nel primo turno la stessa reazione, pur mantenendo alta sensibilità e specificità.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0	bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water	Ambion	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	cat. # 1 759 078	Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide	Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences