הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Summary

HIV כמיהות ניתן להסיק באזור V3 המעטפה ויראלי. V3 הוא PCR מוגבר בשלושה עותקים באמצעות מקוננות RT-PCR, רצף, ופירשו באמצעות תוכנת bioinformatic. דוגמאות עם רצף עם 1 או יותר (ים) עם ציונים נמוכים g2P מסווגים וירוס לא R5.

Abstract

רקע: לפני קבלת התרופה ממעמד CCR5-אנטגוניסט ב-HIV הטיפול, המטופל חייב לעבור בדיקת איידס כמיהות לאשר שלו או שלה האוכלוסייה ויראלי משתמש coreceptor CCR5 לכניסת הסלולר, ולא coreceptor חלופיים. גישה אחת כמיהות הבדיקה היא לבדוק את הרצף של האזור V3 של מעטפת ה-HIV, אשר אינטראקציה עם coreceptor.

שיטות: רנ"א נגיפי מופק פלזמה דם. האזור V3 מוגבר בשלושה עותקים עם מקוננות הפוך transcriptase-PCR. Amplifications הם רצף אז ונותחו באמצעות התוכנה, RE_Call. רצפים מוגשים לאחר מכן אלגוריתם bioinformatic כגון geno2pheno להסיק כמיהות ויראלי מאזור V3. רצפים הם מוסק להיות בלתי R5 אם שיעור חיובי כוזב geno2pheno שלהם יורדת מתחת 5.75%. אם כל אחד משלושת רצפים ממדגם הוא להסיק כי לא R5, החולה לא סביר להגיב אנטגוניסט-CCR5.

Protocol

נוהל:

1. מיצוי:

לפחות 500 μL של פלזמה דם יש צורך כקלט דגימה לבדיקה זו HIV genotypic כמיהות.

1. תמצית ה-HIV-RNA של 500μL של פלזמה באמצעות (bioMérieux) easyMAG אוטומטיות חולץ, או את שיטת החילוץ העדיפו המעבדה שלך.
   Elute רנ"א נגיפי חילוץ לתוך aliquot 60 μL. חנות ב -20 מעלות צלזיוס או להתחיל Reverse transcriptase-PCR מיד לאחר חילוץ.

2. RT-PCR:

4μL של תמצית מדגם יהיה מוגבר בשלושה עותקים באמצעות מקוננות RT-PCR שיטות. התגובה RT-PCR יש להקים בחדר PCR-לנקות.

1. לחשב את כמות מגיב נדרש במספר דגימות להיות מוגבר. פעל על פי הטבלה שלהלן המציין כרכים מגיב על התגובה 1.
   

   מגיב	נפח (μL) (1X תגובה)
   DEPC טיפול במים	10.56
   תגובה 2x חיץ	20
   50% סוכרוז 0.04% לערבב כחול bromophenol	4
   פריימר קדימה מיקוד לאזור V3-HIV	0.32
   הפוך פריימר	0.32
   אנזימים - עילי השלישי צעד אחד RT-PCR המערכת עם ה-DNA פולימראז פלטינום תקי	0.8
   סך הכל	36

   1. טבלת מגיב כרכים נדרש תגובה 1 של One-Step RT-PCR.
   כל אחד RT-PCR התגובה צעד מחייב את המתכון הבא:
   • 10.56 μL מים מטופלים DEPC
   • 20 μL של חיץ התגובה 2x
   • 4μL של סוכרוז 50% ו 0.04% לערבב כחול bromophenol
   • 0.32 μL של פריימר קדימה מיקוד לאזור V3-HIV
   • 0.32 μL של פריימר הפוכה
   • 0.8 μL של האנזים
   עבור סכום כולל של תגובה לכל 36μL.
2. בשורה לחלץ דוגמיות ברציפות ליד ריקה, שכותרתו 96-PCR גם צלחת.
3. בעזרת פיפטה מהדר, להוסיף 36 μL תמהיל מדגם היטב כל הצלחת ה-PCR, כך יש 3 בארות מוכנים לחלץ כל המדגם.
   * הערה: הליך זה חייב להתבצע בשלושה עותקים, לכל הפחות, על מנת להבטיח הדגימה הולם של האוכלוסייה ויראלי.
4. בעזרת פיפטה 8 ערוצים רב, להוסיף 4μL של תמצית מדגם זה בארות 3 שלה. שינוי עצות בין כל תוספת.
5. מכסים את הבארות עם כובעים PCR רצועה.
6. כאשר ההעברה היא comlete, במקום את הצלחת ה-PCR ב thermocycler. הגדר את thermocycler לרוץ עם התוכנית הבאה: 30 דקות 52 ° C 2 דקות 94 ° C 40 מחזורי (15 שניות על 94 ° C, 30seconds ב 55 ° C ו 1.5 דקות 68 ° C) 5 דקות 68 ° C
7. הסר את צלחת מ thermocycler PCR. פלייט ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר.

המשך השלב השני PCR עגול

3. שנית בסיבוב PCR:

1. לחשב את כמות מגיב נדרש במספר דגימות להיות מוגבר. פעל על פי הטבלה שלהלן המציין כרכים מגיב על התגובה 1.
   

   מגיב	נפח (μL) (1X תגובה)
   DEPC טיפול במים	13.45
   סוכרוז 60%, 0.08% לערבב cresol אדום	2
   רוש HiFi למערכת הצפת 2	2
   MgCl 2	0.8
   dNTP	0.16
   קדימה PCR פריימר	0.15
   פריימר הפוך PCR	0.15
   הרחב HiFi אנזים	0.29
   סך הכל	19

   טבלה 2. כרכים מגיב נדרש תגובה 1 מתוך 2 ^nd עגול PCR.
   כל התגובה השנייה בסיבוב PCR מחייבת את המתכון הבא:
   • 13.45 μL מים מטופלים DEPC
   • 2 סוכרוז 60% μL, 0.08% לערבב cresol אדום
   • 2 μL של הצפת רוש מערכת רינגטוננים 2
   • 0.8 μL של 25 מ"מ MgCl ₂
   • 0.16 μL dNTP של 25 מ"מ
   • 0.15 μL שתיהן קדימה הפוך PCR primers
   • 0.29 μL הרחב HiFi אנזים
   עבור סכום כולל של 19 μL לכל תגובה.
2. בחדר PCR-לנקות, בעזרת פיפטה מהדר, להוסיף 19 μL של חיץ התגובה לכל היטב PCR צלחת נקייה.
3. בחדר הגברה לפרסם, באמצעות פיפטה 8 ערוצים רב, להעביר 1 μL של תבנית RT-PCR לתוך המאגר PCR סיבוב שני. שינוי עצות בין כל תוספת.
4. מכסים את הבארות עם כובעים PCR הרצועה ולהעביר את הצלחת סיבוב שני PCR כדי thermocycler.
5. הגדר את thermocycler לרוץ עם התוכנית הבאה: 2 דקות 94 ° C 35 מחזורי (15 שניות על 94 ° C, 30 שניות על 55 ° C, 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס) 7 דקות 72 ° C
6. הסר את צלחת מ thermocycler לאחר הטמפרטורה חזר 25 ° C.

4. ג'ל אלקטרופורזה:

על מנת לאשר את האזור V3 כבר מוגבר בהצלחה, צעד ג'ל אלקטרופורזה מבוצע.

1. הכן ג'ל agarose עם 0.8 גרם של אבקת agarose 50 מ"ל של הצפת טה 1X. מערבבים וממיסים במיקרוגל למשך דקה 1 ~ או עד agarose נמס לחלוטין.
2. הוסף 6 μL של ג'ל SYBR בטוח הכתם מערבולת לערבב.
3. יוצקים פתרון למגש ג'ל, ולהוסיף מספיק ג'ל מסרקים כדי להכיל את מספר ה-PCR בארות.
4. לאחר ג'ל יבש, להסיר מסרקים במקום ג'ל במנגנון ג'ל, כדי לוודא שהוא שקוע לחלוטין חיץ טה 1X.
5. בעזרת פיפטה 10 רב μL, להוסיף 8μL של המדגם כל PCR היטב משלה הג'ל. מכסים את הצלחת ה-PCR לאחר amplifications נוספו הג'ל.
6. הוסף 6 μL הסולם הדנ"א לפחות אחד טוב בכל שורה.
7. הפעל את מנגנון ג'ל ב ~ 100V ל ~ 10 דקות, ולוודא כי להקות לא להפעיל את הג'ל.
8. מניחים את הג'ל על הפנס trans-UV ו לצלם את הג'ל.
   וולס עם ה-DNA PCR מוגבר יופיע אור, מה שמעיד על הגברה מוצלח.
9. שים לב כל דגימות שבו שלוש amplifications היו הצלחה. במידת הצורך, חזור RT-PCR על דגימות אלה עם פחות מ 3 amplifications.

המשך רצף

5. סידור:

לאחר מוגבר ויראלי cDNA, דוגמאות ניתן להכין עבור סידור. התגובה סידור צריך להתבצע בחדר שלאחר הגברה.

1. הסר BigDye מהמקפיא primers רצף מהמקרר. תן BigDye להפשיר בטמפרטורת החדר, לא יותר משעה 1.
2. לחשב את כמות מגיב נדרש במספר דגימות להתנהל. פעל על פי הטבלה שלהלן המציין כרכים מגיב על התגובה 1.
   

   מגיב	נפח (μL) (1X תגובה)
   BigDye	0.3
   BigDye הצפת	2.1
   תחל	2.6
   סך הכל	5.0

   3. טבלת כרכים מגיב נדרש תגובה 1 של רצף.
   * הערה: להכין תערובת נפרד עבור כל צבע יסוד.
   ** הערה: הצפת BigDye המשמשים התגובה רצף יכול להיות מוכן כדלקמן: ערבבו 17.5 מ"ל של תמיסת hydrochloride Trizma חיץ (1 M) (pH9.0) ו - 0.125 מ"ל של מגנזיום כלוריד (1 ז). תביאו את נפח סופי 100 מ"ל מים כיתה מגיב. זה צריך להיות מאוחסן ב 2-8 ° C.
3. באמצעות חישובים של 3.3, להכין את התגובה רצף תערובות עבור פריימר כל מערבולת של לא יותר מ 5 שניות. Aliquot לתוך צינורות רצועת 0.2mL.
4. 5 Aliquot μL של רצף לערבב התגובה לתוך בארות צלחת המתאימה באמצעות פיפטה רב. מכסים את הצלחת (ים) תגובה תערובת המכילה רצף עם Kimwipe ומניחים בצד.
5. הכן דילול 1:15 PCR מוגבר של המוצר על ידי הוספת 180 μL מים בקסטר סטרילי למוצר PCR הנותרים.
6. פיפטה 1 μL המדגם בדילול לתחתית בארות צלחת המתאים, לשנות טיפים פיפטה.
7. בסיום העברת דגימת, חותם את הצלחת עם כובעים להתפשט מערבולת של 1 שניה
8. מניחים את צלחת בצנטריפוגה. קבע את המהירות ל 145g, כאשר מהירות הסחיטה מגיע 145g, להפסיק את הספין.
9. מניחים את הצלחת thermocycler (ים) להגדיר את התוכנית הבאה: 25 מחזורי (10 שניות @ 96 ° C, 5 שניות @ 50 ° C, 55 sec @ 60 ° C...) נפח צריך להיות לפחות 6μL . המחזור צריך לקחת כ 1.2 שעות.

המשך משקעים

6. רטיבות:

כדי "לנקות" את cDNA ויראלי הבאה התגובה רצף, לבצע משקעים באמצעות אתנול אתנול 95%.

1. אחזר צלחת מ thermocycler ומביאים ampli פוסטמתלקחת החדר.
2. הסר כמוסות רצועה ומקום אותם בסדר על מגבת נייר Kimwipe נקי או.
3. פיפטה 4μL הפתרון EDTA-Sodium Acetate עבודה לצד המדגם כל טוב. הקש על צלחת בעדינות, כך הפתרון EDTA-Sodium נופל לתחתית הבאר. טיפים זהה ניתן להשתמש כל עוד הם לא פנה מדגם בתחתית הבאר.
   * הערה: הפתרון EDTA-Sodium Acetate עובד יכול להיות מוכן כדלקמן:
   1. הכן 3M נתרן אצטט ידי המסת 246.1 גרם של נתרן אצטט ב L 1 מים כיתה מגיב. סנן את הפתרון באמצעות 0.45 מיקרו פילטר ולהכין aliquots 50 מ"ל.
   2. הכינו מלאי EDTA-נתרן אצטט פתרון (1.5 מ 'NaOAc, 250 mM EDTA) על ידי ערבוב כמויות שוות של נתרן אצטט (3 M) פתרון של EDTA (500 מ"מ) pH 8.0.
   3. הכן עובד EDTA-נתרן אצטט פתרון על ידי ערבוב one המניות חלק EDTA-נתרן אצטט פתרון עם שלושה חלקים של מים מגיב בכיתה (10 מ"ל + 30 מ"ל).
4. 40μL פיפטה של ​​95% אתנול קר על הצד הנגדי של בארות מדגם להחליף את כובעי רצועה.
5. החותם כובעים המערבולת צלחת למשך 10 שניות. הקש על צלחת כדי לסלק כל הבועות.
6. מניחים את צלחת במקפיא ב -20 ° C למשך תקופה מינימלית של 30 דקות לכל היותר 2 שעות.
7. 1. לאחר משקעים התרחש, הסר את צלחת מהמקפיא ומכניסים לצנטריפוגה במשך 20 דקות ב 3700 סל"ד.
   2. הסר את הכמות המתאימה של Hi-Di לפוראמיד (Applied Biosystems) מהמקפיא כדי לאפשר לו להפשיר לפני denaturation.
   * הערה: denaturation צלחת 96-היטב דורש 960μL של לפוראמיד HiDi ולכן הוא יתרון להכין ~ 1.1mL aliquots מראש.
8. אחרי ספינינג את הצלחת להסיר ולסלק את פקקי רצועה. היפוך הצלחת על מיכל הפסולת (פח אשפה למשל) ו supernatant למזוג. להיפטר supernatant כל הנותרים על ידי סופג את הצלחות הפוך על מגבת נייר.
9. מקפלים 2 גיליונות של מגבת נייר ומניחים על פני הצלחת. מניחים את הצלחת על הבטן בצנטריפוגה ספין ב 145g, לעצור את הספין כאשר הוא מגיע 145g.
10. הסר את צלחת מ בצנטריפוגה לבדוק כדי להיות בטוח בארות ריקות. פיפטה 155μL של אתנול 95% צונן לתוך בארות.
11. בטל supernatant לתוך המיכל פסולת כתם על נייר מגבת וחזור על צנטריפוגה ב 4.10.
12. לאחר הסרת צלחת מ בצנטריפוגה, להשליך מגבת נייר המשמשים ולהניח צלחת לעמוד עם הפנים כלפי מעלה עבור 2-5 דקות, כדי לאפשר לכל אתנול הנותרים להתאדות.

המשך denaturing

7. Denaturing

1. אחזר את לפוראמיד HiDi מופשר למזוג לתוך מיכל גדול מספיק עבור טפטפת רב,
   * הערה: אם אתם משתמשים טרום aliquoted אמצעים כפי שמצוין 6.7b, אחד צינור נדרש כל צלחת 96-היטב להתנהל.
2. בעזרת טפטפת רב, להפיץ 10μL של לפוראמיד HiDi לתוך בארות כל בצלחת, כולל אלה כי הם ריקים.
3. מכסים את הצלחת עם מחצלת septa כדי ליצור חותם.
4. מניחים את הצלחת thermocycler ב 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
5. בעקבות denaturation, במקום את הצלחת מחזיק צלחת מכן לטעון לתוך ברצף. טען פריסת רצף מוכן. פלטות יכולים להישמר ב -20 ° C עד שבוע לפני ביצוע רצף לרוץ.

8. ניתוח נתונים Resultant באמצעות תוכנת שיחות במאגר.

1. באמצעות לזכור לבצע בסיס אוטומטי קורא ללא מגע יד אדם, כיסוי פריימר אחד מקובל. זוכר הוא בסיס המנהג לקרוא התוכנה ניתן למצוא בכתובת הבאה: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   * הערה: חשבון נדרש להתחבר. כדי להגדיר חשבון, לחץ על "הרשמה" כפתור על דף הכניסה. לאחר חשבון נוצר תוכל לגשת לדף ההעלאה.
2. כאשר מחובר, אתה יכול לבחור קבצים מדגם להעלאה. שימוש באפשרות לגלוש ניתן לאתר נתונים גולמיים שלך רצף להעלאה עם מקסימום ההעלאה של 20Mb.
   * הערה:... כזכור אינטרנט רק לקבל קבצי הנתונים כפי ABI קבצים SCF ב-zip, זפת או קובץ tar.gz
3. ברגע קבצים להעלאה נבחרו, לבחור רצף לעיונך. במקרה זה, כדי להיות בטוח את רצף ההתייחסות מוגדר "V3." כעת אתה מוכן ללחוץ על "נתונים תהליך".
4. הנתונים מעובדים יופיע בצד ימין של הדף תחת הכותרת "דוגמאות מהעבר". כל סט לרוץ או מדגם מעובד יוצב בתיקייה שכותרתו עם התאריך. אלה יכולים להיות מחדש שכותרתו ידי לחיצה על "שינוי" כפתור.
5. לחיצה על התיקייה תציג רשימה של דוגמאות. אלה כי הם אדום נכשלו; אלה הירוקים עברו. על ידי לחיצה על מדגם מסוים על כפתור "תצוגה", אתה יכול לבחון את רצף. בצע את ההוראות בצד ימין של הדף כדי לנווט throuGH את הרצף.
   * הערה: שיטה זו, מקובל לייצא רצפים שעוברים זוכר (מוצג ירוק) באופן אוטומטי, ללא התערבות ידנית.
6. אם אתה מרוצה מהתוצאות שאתה יכול לבחור להוריד את רצפי עובר ידי לחיצה על "הורדה". הקבצים יורדו בתיקייה מכווצת.
   * הערה: תחת "הגדרות" ניתן לבחור אפשרויות להוריד דואר אלקטרוני, כולל סוג הקובץ.
7. דוגמאות שלא הצליח לייצר רצפים בשלושה עותקים צריך להיות נקי reamplified בשלושה עותקים מתוך לחלץ. אם RePCR נכשל לספק רצף נקי, מינימום 2 רצפים מקובל לשימוש היקש כמיהות.

9. הסיק כמיהות ויראלי של רצפים שנוצר על ידי רצף, אוכלוסייה מבוססת באמצעות אלגוריתם Co-קולטן Geno2pheno.

1. רצפים ניתן להפעיל באמצעות השירות geno2pheno coreceptor בכתובת הבאה: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
2. דוגמאות להעלות יכול להיות מתויג בתור ראו לנכון. מתוך התפריט הנפתח של הגדרת משמעות, בחר את "הפסקות אופטימיזציה המבוסס על ניתוח של נתונים קליניים מתוך מוטיבציה (2% ו - 5.75 FPR%)"
3. בחר להעלות או להדביק רצף לניתוח, קבצים fasta מקובלים.
4. FPR geno2pheno ניתן לפרש כדלקמן: G2P FPR> 5.75 הוא מייצג של האוכלוסייה R5-באמצעות ויראלי, צפוי להגיב היריבים CCR5 G2P FPR <5.75 מייצג של האוכלוסייה הלא R5 ויראלי, סביר להגיב היריבים CCR5. G2P <2 סביר מאוד לקבל כל תגובה היריבים CCR5. אם כל אחד משלושת רצפים ממדגם הוא להסיק כי לא R5, החולה אינו צפוי להגיב אנטגוניסט-CCR5.

10. נציג תוצאות

כאשר פרוטוקול מבוצע כהלכה צריך לצפות רצף 2 או 3 בהצלחה משכפל עבור כל דגימה. נגטיב לרוץ לצד דגימות צריך שום סימן של רנ"א. רוב רצפי צריך "לעבור" basecalling ידי להיזכר.

בהתבסס על התפלגות R5 ולא R5 בתוך האוכלוסייה הקהילה ויראלי, רוב דגימות החולה שנבחרו באקראי יהיה צפוי להיות R5-באמצעות וירוס. לכן אלא אם כן העיצוב הפרויקט מציע דרך אחרת, צריך לצפות שיהיה R5 יותר מאשר אי - R5 דגימות.

טבלה 1.) הכרכים מגיב נדרש תגובה 1 של שלב אחד RT-PCR ו - ב ') את התוכנית thermocycler הדרושים כדי לבצע את התגובה RT-PCR.

א)

מגיב	נפח (μL) (1X תגובה)
DEPC טיפול במים	10.56
תגובה 2x חיץ	20
50% סוכרוז 0.04% לערבב כחול bromophenol	4
קדימה תחל SQV3F1	0.32
הפוך פריימר CO602	0.32
אנזימים - עילי השלישי צעד אחד RT-PCR המערכת עם ה-DNA פולימראז פלטינום תקי	0.8
סך הכל	36

* הערה:
SQV3F1 רצף פריימר: 5 "GAG המרכז לאמנות עכשווית ATT ATA CCC CAT תאת TGT 3"
CO602 רצף פריימר: 5 "GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3"

ב)

מספר מחזורים	זמן	טמפרטורה
1	30minutes	52 ° C
1	2minutes	94 ° C
40	15seconds	94 ° C
	30seconds	55 ° C
	1.5minutes	68 ° C
1	5minutes	68 ° C

טבלה 2.) הכרכים מגיב נדרש 1 תגובה שנייה בסיבוב PCR ו-B) את התוכנית thermocycler הדרושים כדי לבצע את התגובה השנייה בסיבוב PCR.

א)

מגיב	נפח (μL) (1X תגובה)
DEPC טיפול במים	13.45
סוכרוז 60%, 0.08% לערבב cresol אדום	2
רוש HiFi למערכת הצפת 2	2
MgCl 2	0.8
dNTP	0.16
קדימה תחל SQV3F2	0.15
פריימר הפוך CD4R	0.15
הרחב HiFi אנזים	0.29
סך הכל	19

* הערה:
SQV3F2 רצף פריימר: 5 "TGT GCC המרכז לאמנות עכשווית GCT GGT TTT מהפקולטה לרוקחות אוכלים AT 3"
CD4R רצף פריימר: 5 "תאת AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3"

ב)

מספר מחזורים	זמן	טמפרטורה
1	2minutes	94 ° C
35	15seconds	94 ° C
30seconds	55 ° C
1minute	72 ° C
1	7minutes	72 ° C

לוח 3.) הכרכים מגיב נדרש תגובה 1 של רצף ו-B) את התוכנית thermocycler צורך לבצע את רצף התגובה.

א)

מגיב	נפח (μL) (1X תגובה)
BigDye	0.3
BigDye הצפת	2.1
תחל קדימה V3FO2F הפוך SQV3R1	2.6
סך הכל	5.0

* הערה: אין לשלב primers; תערובת נפרד יש להכין עבור כל צבע יסוד
V3O2F רצף פריימר: 5 "AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3"
SQV3R1 רצף פריימר: 5 "GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3"

ב)

מספר מחזורים	זמן	טמפרטורה
25	10seconds	96 ° C
5seconds	50 ° C
55seconds	60 ° C

Discussion

השיטה המוצגת כאן היא שיטת סידור סטנדרטי ליישם בדיקות כמיהות. היישום הקליני של לולאה המעטפה HIV V3 רצף לחזות כמיהות ויראלי יש עד מאוחר היה מוגבל. שיטה זו הוכח, בניתוח רטרוספקטיבי של (Viiv Healthcare) ניסויים קליניים maraviroc, להיות לפחות באותה מידה מסוגל לחזות כמיהות ויראלי בהשוואה מבחני תוקף אחרים המשמשים קלינית.

ישנם יתרונות רבים על ביצוע ניתוח genotypic של הלולאה V3 לחיזוי כמיהות. בראש ובראשונה, הליך זה יכול להתבצע בכל מתקן עם ציוד רצף תפעולי, מאוד להגדיל את הנגישות וצמצום זמן אספקה ​​של בדיקות כמיהות. לשם השוואה, Trofile פנוטיפי משופר רגישות Assay (esta) (Monogram Biosciences), אשר שימש תקן הזהב עבור בדיקות כמיהות, מבוצע במרכז ואחד בדרום קליפורניה. יתרונות נוספים כוללים את הדרישה של חומר המוצא פחות עומס מינימלי הנדרש פלזמה ויראלי של 500copies/mL. כמו כן, את עלויות התפעול של הפעלת assay genotypic נמוכים יחסית לאלה של assay פנוטיפי. השימוש בתוכנה להיזכר בפרט מבטלת את הדרישה לבדיקה רצף ידני, שנוטה להיות חלק אינטנסיבית העבודה של מנתח גנוטיפ.

השיטה המוצגת כאן היא פשוטה למדי, עם כל צעד מסוים outweighing אחר חשיבות. אנו כן ממליצים לרוץ PCR וסדר בשלושה עותקים כדי להגדיל את הסיכויים של מינים לכידת מיעוט בתוך האוכלוסייה ויראלי של מדגם. משכפל יותר משלושה יכול להתבצע, אולם מצאנו triplicates להיות גם יעיל ואמין. כמו כן, אנו ממליצים להשתמש צעד אחד לאחור transcriptase PCR Kit (Qiagen) אשר מבצעת הן RT-PCR ו הראשון בסיבוב PCR בתגובה דומה, תוך שמירה על רגישות וספציפיות גבוהה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0	bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water	Ambion	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	cat. # 1 759 078	Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide	Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences