الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

Summary

يمكن استخدام EpiMark 5 - 5 - مؤسسة حمد الطبية وأدوات التحليل MC لتحليل وquantitate methylcytosine 5 و 5 hydroxymethylcytosine داخل موضعا cific جمعية مهندسي البترول. عدة يميز MC - 5 - 5 من مؤسسة حمد الطبية عن طريق إضافة السكر إلى مجموعة الهيدروكسيل من HMC - 5 عبر رد فعل الأنزيمية باستخدام β - ناقلة الغلوكوزيل (T4 - BGT). عند 5 - HMC يحدث في سياق CCGG ، يحول هذا التعديل MspI شطورة موقع إلى موقع غير شطورة.

Abstract

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5^th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells.

Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol.

Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected.

This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC.

The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site.

In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

Protocol

1. Glucosylation الحمض النووي ومراقبة ردود الفعل

1. في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر على الجليد ، مزيج 50-10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني (لتركيز النهائي 30 ميكروغرام / ملليلتر) ، 12.4 microliters من UDP - الجلوكوز (لتركيز النهائي من 80 micromolar) ، و 31 من microliters NEBuffer 4 وتصل إلى 310 microliters nuclease خالية من المياه لتحقيق الحجم الكلي إلى 310 microliters.
2. تقسيم هذا الخليط التفاعل إلى أنبوبين من 155 microliters لكل منهما.
3. ثم إضافة 30 وحدة ، أو microliters 3 من T4 - ناقلة الغلوكوزيل - β لأنبوب واحد. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. الأنبوب الثاني هو رد فعل السيطرة ، إضافة لذلك microliters 3 من المياه ، بدلا من BGT - T4.
4. احتضان كل من أنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 18 ساعة ، وخلال الوقت الذي T4 - BGT سيضيف الجلوكوز إلى مجموعة الهيدروكسيل من 5 hydroxymethylcytosine المجموعات في العينة.

2. تقييد انزيم الهضم

1. التسمية three - PCR 0.2 ملليلتر الشريط الأرقام من 1 إلى 3 أنابيب. قسامة 50 من المجاهدين في كل خليط التفاعل.
2. التسمية three - PCR 0.2 ملليلتر الشريط أعداد أنابيب من 4 إلى 6. قسامة 50 ماي من خليط التحكم في كل منها.
3. إضافة 100 وحدة ، أو ميكروليتر 1 من MspI في أنابيب 1 و 4. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
4. إضافة 50 وحدة ، أو ميكروليتر 1 من HpaII في أنابيب 2 و 5. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
5. لا تضيف شيئا إلى أنابيب 3 و 6 ، كما هي الضوابط.
6. احتضان جميع أنابيب 6 إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
7. إضافة 1 ميكروليتر من بروتين كاف في كل أنبوب واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
8. تثبيط بروتين التي يحتضنها K في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.

3. تحليل الحمض النووي عن طريق PCR / qPCR

يستخدم هذا البروتوكول في NEB LongAmp طق لنقطة النهاية PCR وهو ما ثبت لأداء جيدا. يمكن أن تكون بديلا غيرها من البروتوكولات PCR.

1. إضافة المكونات التالية لأنبوب 0.2 ملليلتر تفاعل PCR على الجليد : 10 microliters من 5X LongAmp الاحتياطي الرد طق ، 1.5 microliters من 10 dNTPs millimolar ، 1 ميكروليتر التمهيدي من 10 انتقل micromolar ، 1 ميكروليتر من 10 عكس micromolar التمهيدي و 3 من قالب microliters الحمض النووي من الخطوات السابقة ، 1 ميكروليتر من البلمرة DNA LongAmp طق ، وخالية من المياه nuclease تصل إلى 50 microliters. قد تتغير هذه الكميات وفقا لبروتوكول PCR المستخدمة.
2. المزيج بلطف التفاعل. إذا لزم الأمر ، وجمع كل السائل إلى أسفل الأنبوب التي تدور بسرعة.
3. تراكب العينة مع الزيوت المعدنية في حالة استخدام thermocycler دون غطاء ساخنة.
4. نقل أنابيب PCR من الجليد لthermocycler مع الكتلة محمى إلى 94 درجة مئوية وبدء برنامج ركوب الدراجات. لروتين 3 - PCR الخطوة ، ينبغي أن تكون هناك خطوة واحدة تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية تمسخ و 55 إلى 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية الصلب ، و 65 درجة مئوية التمديد لمدة 20 ثانية ، أو 50 ثانية لكل كيلوبايت. وينبغي أن يتبع ذلك من قبل أحد التمديد النهائي في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ويمكن أيضا في الوقت الحقيقي PCR أن يؤديها لquantitate مبالغ methylcytosine - 5 و 5 hydroxymethylcytosine. يرجى الرجوع إلى دليل المنتجات ، والعثور على neb.com عن معلومات محددة.

4. ممثل النتائج :

الشكل 1. مقارنة بين 5 - hydroxymethylcytosine المبالغ في 12 موضعا في عينات الأنسجة المختلفة الماوس BALB / C. (A) ، نقطة النهاية PCR. (B) ، في الوقت الحقيقي PCR.

وقد تم تحليل الحمض النووي من الأنسجة الماوس الأربعة. لأغراض المقارنة ، تم تطبيع PCR الوقت الحقيقي للبيانات الحمض النووي غير المصقول. واستخدمت لتحديد المنحنى القياسي في عدد النسخ. ويمكن تطبيع عينات بقسمة عدد نسخ أي من العينات 1-6 قبل عدد نسخة من التحكم الذي هو عسر الهضم (رقم 5). محاصر حارة هلام يظهر التباين في 5 HMC الحالي.

Discussion

هناك أشياء عدة حاسمة في الاعتبار عند إعداد هذه التجربة. أولا ، من المهم أن glucosylation من الحمض النووي الجينومي العائدات على الانتهاء. ولا يعرف خصوصية تسلسل BGT - T4 ، ويبدو أن لا خيار لتسلسل الركيزة. ولذلك ، في بعض الحالات ، قد تكون أوقات أطول الحضانة اللازمة. ثانيا ، يجب MspI HpaII الهضم وتكون كاملة من أجل تجنب إشارة الخلفية. لتقييد هذه الإنزيمات ، نوصي وقت الحضانة من 4 ساعات ، ولكن لا يمكن أن يؤديها يعد حضانات عندما لوحظ انقسام غير مكتملة. ثالثا ، يمكن تعديلها إدخال كمية الحمض النووي اعتمادا على توافر ، يمكن استخدامها منذ 20 NGS من الحمض النووي لنقطة النهاية PCR. وأخيرا ، فإننا نوصي باستخدام الحمض النووي التحكم الموردة والتي قد تكون بالتوازي مع الحمض النووي الجيني لMC - 5 - 5 وتقدير مؤسسة حمد الطبية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit	New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest			Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0323
dNTPs	New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water