High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale

Riepilogo

Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l'aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.

Abstract

Hydroxymethylation DNA è una modificazione del DNA da tempo, ma recentemente è diventato un focus di ricerca epigenetica. DNA dei mammiferi è enzimaticamente modificati nella posizione di carbonio 5 ^° della citosina (C) residui a 5-MC, prevalentemente nel contesto di dinucleotidi CpG. 5-MC è suscettibile di ossidazione enzimatica a 5-HMC dalla famiglia Tet di enzimi, che si ritiene siano coinvolti nello sviluppo e nella malattia. Attualmente, il ruolo biologico di 5-HMC non è pienamente compreso, ma sta generando molto interesse a causa della sua potenzialità come biomarker. Ciò è dovuto a diversi studi innovativi di identificazione 5-hydroxymethylcytosine nel topo staminali embrionali (ES) e le cellule neuronali.

Tecniche di ricerca, compresi i metodi di sequenziamento bisolfito, non sono in grado di distinguere facilmente tra i 5-MC e 5-HMC. Un protocolli esistono pochi in grado di misurare quantità globale di 5-hydroxymethylcytosine nel genoma, tra cui la cromatografia liquida accoppiata con l'analisi di spettrometria di massa e cromatografia su strato sottile di nucleosidi singolo digerito dal DNA genomico. Gli anticorpi che colpiscono 5-hydroxymethylcytosine esistono anche, che può essere utilizzato per l'analisi dot blot, immunofluorescenza, o precipitazione del DNA hydroxymethylated, ma questi anticorpi non hanno singola aggiunta resolution.In di base, la risoluzione dipende dalle dimensioni del DNA immunoprecipitato e per esperimenti di microarray, dipende dal disegno della sonda. Dal momento che non si sa esattamente dove 5-hydroxymethylcytosine esiste nel genoma o il suo ruolo nella regolazione epigenetica, nuove tecniche, sono necessari in grado di identificare hydroxymethylation specifico locus. Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Analisi Kit offre una soluzione di distinzione tra questi due modifiche a loci specifici.

Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Analisi Kit è un metodo semplice e robusto per l'identificazione e quantificazione di 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un locus DNA specifico. Questo approccio enzimatica utilizza la sensibilità metilazione differenziale dei MspI isoschizomers e HpaII in un semplice 3-step del protocollo.

DNA genomico di interesse è trattato con T4-BGT, aggiungendo un moeity glucosio al 5-hydroxymethylcytosine. Questa reazione è sequenza-indipendente, quindi tutti i 5-HMC sarà glucosilati, non modificato o 5-mC DNA contenente non saranno interessati.

Questo glucosylation è poi seguita dalla digestione di restrizione endonucleasi. MspI e HpaII riconoscere la stessa sequenza (CCGG), ma sono sensibili a diversi stati di metilazione. HpaII si unirà solo un sito completamente modificato: ogni modifica (5-mC, 5-HMC o 5-ghmC) sia a scissione citosina blocchi. MspI riconosce e si unirà a 5 mC e 5-HMC, ma non 5-ghmC.

La terza parte del protocollo è interrogatorio del locus mediante PCR. Appena 20 ng di DNA di ingresso possono essere utilizzati. Amplificazione della sperimentazione (glucosilati e digerito) e di controllo (finto glucosilati e digerito) DNA bersaglio con primer che fiancheggiano un sito CCGG di interesse (100-200 bp) viene eseguita. Se il sito CpG contiene 5-hydroxymethylcytosine, una band viene rilevato dopo glucosylation e la digestione, ma non nel non-glucosilati reazione di controllo. PCR in tempo reale darà un'approssimazione di quanto hydroxymethylcytosine è in questo particolare sito.

In questo esperimento, analizzeremo il 5-hydroxymethylcytosine quantità in un Babl / C campione di cervello di topo per punto PCR finale.

Protocollo

1. DNA Glucosylation e controllare le reazioni

1. In un tubo di reazione 1,5 millilitri su ghiaccio, mescolare 5-10 microgrammi di DNA genomico (per una concentrazione finale di 30 microgrammi / millilitro), il 12,4 microlitri di UDP-glucosio (per una concentrazione finale di 80 micromolari), 31 microlitri di NEBuffer 4 e fino a 310 microlitri di nucleasi senza acqua per portare il volume totale a 310 microlitri.
2. Split questa miscela di reazione in due tubi di 155 microlitri ciascuno.
3. Quindi aggiungere 30 unità, o 3 microlitri, di T4-β-glucosiltransferasi a un tubo. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù. Il secondo tubo è la reazione di controllo, in modo da aggiungere 3 microlitri di acqua, invece di T4-BGT.
4. Incubare entrambi i tubi a 37 gradi centigradi per 12 a 18 ore, durante il quale il T4-BGT aggiungerà glucosio per il gruppo ossidrile di 5-hydroxymethylcytosine gruppi del campione.

2. Digestione degli enzimi di restrizione

1. Etichetta tre 0,2 millilitri PCR-strip numeri tubi da 1 a 3. Aliquota 50 ul della miscela di reazione in ogni.
2. Etichetta tre 0,2 millilitri PCR-strip numeri tubi da 4 a 6. Aliquota 50 ul della miscela di controllo in ciascuno.
3. Aggiungere 100 unità, o 1 microlitro, di MspI in tubi 1 e 4. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù.
4. Aggiungere 50 unità, o 1 microlitro, di HpaII in tubi 2 e 5. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù.
5. Non aggiunge nulla ai tubi 3 e 6, in quanto sono controlli.
6. Incubare tutte le 6 tubi a 37 ° C per almeno 4 ore.
7. Aggiungere 1 microlitro di proteinasi K in ciascuna provetta e incubare a 40 ° C per 30 minuti.
8. Inattivare il proteinasi K incubando a 95 gradi centigradi per 10 minuti.

3. Analizzare il DNA mediante PCR / qPCR

Questo protocollo utilizza NEB è LongAmp Taq per end-point PCR che ha dimostrato di funzionare bene. Altri protocolli di PCR può essere sostituito.

1. Aggiungere i seguenti componenti di una reazione di 0,2 tubo millilitro PCR in ghiaccio: 10 microlitri di tampone di reazione 5X LongAmp Taq, 1,5 microlitri di 10 dNTPs millimolare, 1 microlitro di 10 Primer micromolari Forward, 1 microlitro di 10 Primer Reverse micromolari, 3 microlitri di template DNA dai passaggi precedenti, 1 microlitro di Taq DNA polimerasi LongAmp e acqua priva di nucleasi fino a 50 microlitri. Questi volumi possono cambiare in base al protocollo di PCR utilizzato.
2. Mescolare delicatamente la reazione. Se necessario, raccogliere tutto il liquido sul fondo della provetta da un giro veloce.
3. Sovrapposizione del campione con olio minerale se si utilizza un termociclatore senza coperchio riscaldato.
4. Trasferire i tubi PCR dal ghiaccio ad un termociclatore con il blocco preriscaldato a 94 gradi Celsius e avviare il programma di ciclismo. Per una routine 3-step PCR, ci dovrebbe essere un passo denaturazione iniziale a 94 ° C per 30 secondi, seguita da 30 cicli di 94 gradi Celsius denaturazione per 15 secondi, da 55 a 65 gradi Celsius ricottura per 30 secondi, e 65 gradi Celsius estensione per 20 secondi, o 50 secondi per kb. Questo dovrebbe essere seguito da una estensione finale a 65 ° C per 5 minuti. Real-time PCR può essere eseguita anche per quantificare quantità di 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine. Si prega di fare riferimento al manuale del prodotto, che si trova sulla neb.com per informazioni specifiche.

4. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Confronto di 5-hydroxymethylcytosine ammonta a 12 nel locus diversi topo Balb / C campioni di tessuto. (A), End-point PCR. (B), Real time PCR.

DNA da quattro tessuti del mouse è stato analizzato. Ai fini comparativi, PCR in tempo reale i dati sono stati normalizzati al DNA non tagliato. Una curva standard è stato utilizzato per determinare il numero di copia. I campioni potrebbero essere normalizzati dividendo il numero di copie di campioni Nessun 1-6 dal numero di copie del controllo che viene digerito (n. 5). Corsia gel Boxed mostra variazione in 5-HMC presente.

Discussione

Ci sono parecchie cose fondamentali da considerare nella creazione di questo esperimento. In primo luogo, è importante che il glucosylation di DNA genomico procede al completamento. La specificità sequenza di T4-BGT non è nota, e sembra non avere altra scelta per la sequenza di substrato. Pertanto, in alcuni casi, i tempi di incubazione più lungo può essere necessario. In secondo luogo la digestione, MspI e HpaII deve essere completa in modo da evitare segnale di fondo. Per questi enzimi di restrizione, si consiglia un tempo di incubazione di 4 ore, ma più incubazioni può essere eseguita quando scissione incompleta è osservato. In terzo luogo, il DNA quantità di ingresso può essere regolata a seconda della disponibilità, dal 20 NGS del DNA può essere usato per end-point PCR. Infine, si consiglia l'uso del DNA di controllo in dotazione, che può essere eseguito in parallelo con il DNA genomico per 5 e 5-MC-HMC quantificazione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit	New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest			Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0323
dNTPs	New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water