Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

Resumo

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Resumo

Hydroxymethylation DNA é uma modificação muito conhecida de DNA, mas recentemente tornou-se um foco em pesquisa epigenética. DNA de mamíferos é enzimaticamente modificado na posição do carbono 5 ^º da citosina (C) os resíduos a 5-mC, predominantemente no contexto de dinucleotídeos CpG. 5-mC é passível de oxidação enzimática de 5-HMC pela família Tet de enzimas, que são acreditados para ser envolvido no desenvolvimento e na doença. Atualmente, o papel biológico de 5-HMC não é totalmente compreendido, mas está gerando muito interesse devido ao seu potencial como biomarcador. Isto é devido a vários estudos revolucionários identificar 5 hydroxymethylcytosine no tronco embrionárias de camundongos (ES) e células neuronais.

Técnicas de pesquisa, incluindo métodos de seqüenciamento bissulfito, são incapazes de distinguir facilmente entre 5-mC e 5-HMC. A protocolos existem poucos que podem medir montantes globais de 5-hydroxymethylcytosine no genoma, incluindo cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa com a análise ou cromatografia em camada delgada de nucleosídeos única digeridos de DNA genômico. Anticorpos que meta de 5-hydroxymethylcytosine também existem, o que pode ser usado para dot blot, imunofluorescência, ou precipitação de DNA hydroxymethylated, mas esses anticorpos não têm disso resolution.In única base, a resolução depende do tamanho do DNA e para immunoprecipitated experimentos de microarray, depende do projeto da sonda. Uma vez que se sabe exatamente onde 5-hydroxymethylcytosine existe no genoma ou o seu papel na regulação epigenética, novas técnicas são necessárias que podem identificar hydroxymethylation locus específico. O EpiMark 5-HMC e 5-mC Análise Kit fornece uma solução para a distinção entre essas duas modificações em loci específicos.

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Análise Kit é um método simples e robusto para a identificação e quantificação de 5-metilcitosina e 5 hydroxymethylcytosine dentro de um lócus específicas de DNA. Esta abordagem utiliza a sensibilidade enzimática metilação diferencial do MspI isoschizomers e HpaII em um protocolo de 3 passos simples.

DNA genômico de interesse é tratado com T4-BGT, adicionando um moeity glucose a 5-hydroxymethylcytosine. Esta reação é seqüência independente, portanto todos os 5-HMC será glucosylated; sem modificações ou 5-mC DNA contendo não será afetado.

Este glucosylation é seguida por digestão endonuclease de restrição. MspI e HpaII reconhecer a mesma seqüência (CCGG), mas são sensíveis aos estados de metilação diferentes. HpaII cliva apenas um site totalmente modificado: qualquer modificação (5-mC, 5-HMC ou 5-ghmC) em ambos os blocos de clivagem citosina. MspI reconhece e cliva 5-mC e 5-HMC, mas não de 5 ghmC.

A terceira parte do protocolo é o interrogatório do locus por PCR. Tão pouco como 20 ng de DNA de entrada pode ser usado. Amplificação do experimental (glucosylated e digerido) e controle (zombar glucosylated e digerido) DNA alvo com primers flanqueando um site CCGG de interesse (100-200 pb) é executada. Se o site contém 5 CpG-hydroxymethylcytosine, uma banda é detectado após glucosylation e digestão, mas não na reação controle não-glucosylated. PCR em tempo real dará uma aproximação de quanto é hydroxymethylcytosine neste site particular.

Neste experimento, vamos analisar a quantidade de 5 hydroxymethylcytosine em uma amostra de cérebro de camundongo Babl / C por ponto final PCR.

Protocolo

1. Glucosylation DNA e Controle de Reações

1. Em um tubo de reação de 1,5 milímetro no gelo, misture 10/05 microgramas de DNA genômico (para uma concentração final de 30 microgramas / mililitro), 12,4 microlitros de UDP-glicose (para uma concentração final de 80 micromolar), 31 microlitros de NEBuffer 4 e até 310 microlitros nuclease livre de água até que o volume total para 310 microlitros.
2. Dividir esta mistura de reação em dois tubos de 155 microlitros cada.
3. Em seguida, adicione 30 unidades, ou 3 microlitros, de T4-β-glicosiltransferase de um tubo. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. O segundo tubo é a reação controle, então adicione 3 microlitros de água, em vez de T4-BGT.
4. Incubar ambos os tubos a 37 graus Celsius por 12 a 18 horas, durante o qual o T4-BGT irá adicionar glicose ao grupo hidroxila de 5-hydroxymethylcytosine grupos na amostra.

2. Digestão enzimática de restrição

1. Rótulo três 0,2 mililitro PCR-strip números tubos de 1 a 3. Alíquota de 50 ul da mistura de reação em cada um.
2. Rótulo três 0,2 mililitro PCR-strip números tubos de 4 a 6. Alíquota de 50 ul da mistura de controle em cada.
3. Adicionar 100 unidades, ou 1 microlitro, de MspI em tubos 1 e 4. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo.
4. Adicionar 50 unidades, ou 1 microlitro, em tubos de HpaII 2 e 5. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo.
5. Não acrescentar nada aos tubos 3 e 6, como são os controles.
6. Incubar todos os tubos de 6 a 37 graus Celsius por pelo menos 4 horas.
7. Adicione 1 microlitro de proteinase K em cada tubo e incubar a 40 graus Celsius por 30 minutos.
8. Inativar a proteinase K, incubando a 95 graus Celsius por 10 minutos.

3. Analisar DNA por PCR / qPCR

Este protocolo usa LongAmp NEB de Taq para ponto final-PCR, que tem se mostrado um bom desempenho. Outros protocolos PCR pode ser substituído.

1. Adicione os seguintes componentes para um tubo de reação 0,2 mililitro PCR em gelo: 10 microlitros de 5X Tampão de reacção LongAmp Taq, 1,5 microlitros de 10 milimolar dNTPs, 1 microlitro de 10 Primer micromolar Forward, 1 microlitro de 10 Primer reverssa micromolar, 3 microlitros de modelo DNA das etapas anteriores, 1 microlitro de LongAmp Taq DNA polimerase e água livre de nuclease até 50 microlitros. Estes volumes podem mudar de acordo com o protocolo de PCR utilizado.
2. Misture suavemente a reação. Se necessário, recolher todo o líquido até o fundo do tubo por uma rotação rápida.
3. Sobreposição da amostra com óleo mineral se estiver usando um termociclador sem tampa aquecida.
4. Transferir os tubos de PCR de gelo para um termociclador com o bloco pré-aquecido a 94 graus Celsius e iniciar o programa de ciclismo. Para uma rotina de 3 passos PCR, deve haver uma etapa de desnaturação inicial a 94 graus Celsius por 30 segundos seguido de 30 ciclos de 94 graus Celsius desnaturação por 15 segundos, 55 a 65 graus Celsius de recozimento para 30 segundos e 65 graus Celsius de extensão por 20 segundos ou 50 segundos por kb. Isto deve ser seguido por uma extensão final a 65 graus Celsius por 5 minutos. PCR em tempo real também pode ser realizada para quantificar quantidades de 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine. Por favor, consulte o manual do produto, encontrado em neb.com para obter informações específicas.

4. Resultados representativos:

Figura 1. Comparação de 5-hydroxymethylcytosine quantidades no locus 12 em diferentes amostras do mouse Balb / C tecidos. (A), ponto final-PCR. (B), PCR em tempo real.

DNA de quatro tecidos de camundongos foi analisada. Para fins comparativos, PCR em tempo real os dados foram normalizados para DNA uncut. A curva padrão foi utilizado para determinar número de cópias. As amostras poderiam ser normalizado pela divisão do número de cópias de amostras 06/01 Não pelo número de cópia do controle que é digerido (n º 5). Lane gel box mostra a variação em 5-HMC presente.

Discussão

Existem várias coisas importantes a considerar aquando da constituição desta experiência. Primeiro, é importante que o glucosylation do DNA genômico prossegue até a conclusão. A especificidade seqüência de T4-BGT não é conhecida, e parece não ter outra opção para a seqüência do substrato. Portanto, em alguns casos, maior tempo de incubação pode ser necessária. Digestão segundo, MspI e HpaII deve ser completa, a fim de evitar sinal de fundo. Para estas enzimas de restrição, recomendamos um período de incubação de quatro horas, mas já incubações podem ser realizadas quando clivagem incompleta é observado. Terceiro, a quantidade de DNA de entrada pode ser ajustada dependendo da disponibilidade, desde 20 ngs de DNA pode ser usado para ponto final-PCR. Finalmente, recomendamos o uso de DNA controle fornecido que pode ser executado em paralelo com o DNA genômico para 5-mC e 5-HMC quantificação.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit	New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest			Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0323
dNTPs	New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water