ampliPHOX الكشف اللونية على ميكروأري الحمض النووي لمكافحة الأنفلونزا

Kevin R. Moulton; Amber W. Taylor; Kathy L. Rowlen; Erica D. Dawson

doi:10.3791/2682

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

وتقدم تكنولوجيا الكشف ampliPHOX اللونية كبديل غير مكلف للكشف عن ميكروأرس مضان. استنادا بلمرة ضوئية المنشأ ، ampliPHOX تنتج البقع البوليمر الصلبة مرئية للعين المجردة في دقائق معدودة. ثم يتم تصوير النتائج وتفسيرها تلقائيا مع حزمة برامج بسيطة لكنها قوية.

Abstract

ظهرت ميكروأرس الحمض النووي كأداة قوية للكشف عن العوامل المسببة للأمراض. ^1-5 وعلى سبيل المثال ، أثبتت العديد من الأمثلة على القدرة على نوع وسلالة فيروس الانفلونزا. ^6-11 تحديد وتصنيف الفرعي لأنفلونزا على ميكروأرس الحمض النووي وتطبيقاتها في القطاعين العام الصحة وعيادة للكشف المبكر والتدخل السريع ، والتقليل من تأثير وباء الأنفلونزا. مضان التقليدية في الوقت الراهن الكشف ميكروأري الأكثر استخداما الأسلوب. لكن ، وكما استخدموا تكنولوجيا متطورة تقدم نحو الاستخدام السريري ⁽¹⁾ ، واستبدال الأجهزة غالية مع انخفاض تكلفة تكنولوجيا الكشف واظهار خصائص الأداء مماثلة لمضان جعل المقايسات ميكروأري أكثر جاذبية وفعالة من حيث التكلفة.

المقصود من الكشف اللونية ampliPHOX التكنولوجيا لتطبيقات البحوث ، ووضع حد للكشف داخل احدة من حيث الحجم من ¹¹ مضان التقليدية ، مع الميزة الرئيسية التي يجري تقريبي عشرة أضعاف تكلفة أقل مقارنة صك الماسحات الضوئية اللازمة لميكروأري مبائر ميكروأري مضان الكشف. ميزة أخرى هي من الحجم الصغير الصك الذي يسمح لقابلية ومرونة ، على عكس مضان الصكوك التقليدية. لأن التكنولوجيا البلمرة ليست كما الخطية بطبيعتها كما كشف مضان ، ومع ذلك ، هو الأنسب لانخفاض الكثافة ميكروأري التطبيقات التي المطلوب هو نعم / لا جواب عن وجود تسلسل معين ، مثل الكشف عن صفائف الممرض. في الوقت الحاضر كثافة بقعة أقصى متوافقة مع الكشف ampliPHOX هو ~ 1800 البقع / الصفيف. بسبب محدودية كثافة البقعة ، ميكروأرس العالي الكثافة ليست مناسبة للكشف عن ampliPHOX.

هنا ، نقدم ampliPHOX تكنولوجيا الكشف اللونية كوسيلة لتضخيم إشارة على ميكروأري منخفض الكثافة وضعت لكشف وتشخيص فيروسات الأنفلونزا (FluChip). على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم FluChip (أ ميكروأري الحمض النووي) ، وتطبيق واحد محدد للكشف ampliPHOX ، أي دمج ميكروأري الهدف biotinylated يمكن الكشف عن وصفت بطريقة مماثلة. تصميم وميكروأري biotinylation هدف ليتم القبض هي من مسؤولية المستخدم. مرة واحدة وقد تم القبض على الهدف biotinylated على الصفيف ، يمكن إجراء الكشف عن طريق وضع علامات ampliPHOX لأول مرة مع مجموعة المتقارن streptavidin التسمية (ampliTAG). عند التعرض للضوء باستخدام أداة قارئ ampliPHOX ، البلمرة حل مونومر (ampliPHY) يحدث فقط في المناطق التي تحتوي على ampliTAG المسمى الأهداف. ويمكن تشكيل البوليمر الملون في وقت لاحق مع حل غير سامة لتحسين النقيض البصرية ، تليها التصوير والتحليل باستخدام مجموعة من البرامج البسيطة (ampliVIEW). ويمكن إجراء فحص كامل من FluChip الامم المتحدة واستخراج عينة لينتج حوالي 6 ساعات ، ويمكن الانتهاء من الخطوات المذكورة أعلاه الكشف ampliPHOX في حوالي 30 دقيقة.

Protocol

1. التضخيم باستخدام عينة RT - PCR

استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من المواد الطبية أو الفيروسية. عزل الفيروسات باستخدام MinElute Qiagen كيت سبين بالاشتراك مع الآلية حمض النووي QIAcube منصة استخراج يتم تنفيذ عمليات الاستخراج على 200 عينة ميكرولتر مع حجم شطف النهائي من 60 ميكرولتر. مقتطفات المحل في -70 درجة مئوية أو أقل لاستخدامها لاحقا.
في منطقة خالية من القالب ، وإعداد مزيج الرئيسي RT - PCR على الجليد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لدمج البيوتين خلال RT - PCR ، واستخدام خليط dNTP biotinylated بدلا من الصانع الموردة dNTP المزيج. تكلفة استخدام خليط dNTP biotinylated أقل من 1 دولار أمريكي / مقايسة. ويمكن أيضا طرق بديلة لإدماج البيوتين ، مثل استخدام التمهيدي biotinylated استخدامها. إضافة التمهيدي يمزج بتركيزات النهائي من 1.0 ميكرومتر لأنفلونزا A ، B 1.0 ميكرومتر لأنفلونزا ، و 0.14 ميكرومتر للرقابة الداخلية. الانفلونزا مجموعة التمهيدي تضخيم الجزء الجينات مصفوفة (1032 NT المنتج) وباء انفلونزا التمهيدي تعيين تضخيم شريحة الجين غير الهيكلية (811 NT المنتج). كل مجموعة التمهيدي FluChip التمهيدي يحتوي على واحد مع مجموعة 5 'فسفوريل لتسهيل توليد واحدة من الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل عن طريق الهضم الأنزيمي مع نوكلياز خارجية امدا التالية PCR. ينجم عن ذلك المنتج الذين تقطعت بهم السبل واحد يتطلب مرات التهجين أقصر بكثير من ما يعادل ضعف الذين تقطعت بهم السبل ، ويقصر كثيرا من الوقت الفحص الشامل. مزيج معدة سلفا لهذه المشارع وكذلك التحكم في قالب الحمض النووي الريبي الداخلية المتوفرة من InDevR إلى الباحثين المهتمين على أساس محدود.
دوامة لفترة وجيزة وتوزيع 18 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في أنابيب PCR رقيقة الجدران.
أنابيب نقل على الجليد إلى منطقة مناسبة للعمل بالإضافة إلى ذلك القالب ، قالب وإضافة 2 ميكرولتر لكل أنبوب التفاعل.
أنابيب نقل PCR لcycler الحرارية ، وتشغيل ملف الحرارية التالية : النسخ العكسي عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وتعطيل انزيم / التنشيط عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، و 40 دورات PCR من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 55 درجة C ل30S ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.

2. تهجين RT - PCR المنتجات لميكروأرس منخفض الكثافة

من أجل توليد الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد لتهجين FluChip ، تحضير الخليط الهضم الأنزيمي من خلال الجمع بين 1.0 نوكلياز خارجية انزيم امدا ميكرولتر ، 2.2 ميكرولتر من رد فعل العازلة المصاحبة لها ، و 0.8 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه. هذه المبالغ هي لعينة واحدة ، ولكن يمكن تحجيمها لمجرد العدد الكلي للعينات ليتم هضمها. إزالة عينات من cycler الحرارية وإضافة 4 ميكرولتر من الخليط على استعداد لفعل كل لهضم حبلا فسفرته للمنتج PCR. عودة إلى عينات cycler الحرارية وبرنامج cycler الحرارية إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإتمام عملية الهضم الأنزيمي والخطوات تجزئة الحرارة.
تطبع ميكروأرس الأنفلونزا المخصصة المستخدمة على الشرائح الزجاجية ألدهيد functionalized من قبل شركة ميكروأرس] التطبيقية (تيمبي ، من الألف إلى الياء). يتم الجمع بين 5' - الأمينية التقاط تسلسل إنهاء وجود مخزن مؤقت الأمثل اكتشاف وطباعتها في التركيز النهائي من 20 ميكرومتر (باستثناء تسلسل السيطرة الإيجابية التي قد بالإضافة إلى تعديل 3' البيوتين ، ورصدت عند تركيز النهائي من 500 نانومتر) . ويستخدم الاتصال غير اكتشاف الأسلوب ، مع بقعة قطرها 300 ميكرون الأمثل للمركز والى ارض الملعب وسط 700 ميكرون.
إزالة ميكروأرس من مربع التخزين والتهجين تطبيق الآبار تستخدم مرة واحدة في جميع أنحاء ميكروأرس عن طريق إزالة الطبقة الواقية وضغط بشدة حول محيط جيدا.
الشرائح في مكان بن لغسل تحتوي على 110 مل من المياه النقية لغسل ما قبل 5 دقائق التهجين باستخدام شاكر المداري في 60-90 دورة في الدقيقة. تجفيف مجموعة عن طريق لمس الأنسجة ممسحة بلطف إلى حافة البئر ، والسماح للمياه لتكون الأشرار بعيدا.
22 الجمع بين ميكرولتر من الاحتياطي تهجين 2X مع كل من المنتجات ssDNA مجزأة ، والماصة 40 ميكرولتر الحلول التهجين في آبار ميكروأري.
السماح لهجن الشرائح في غرفة مغلقة الرطوبة لمدة 60 دقيقة.
إزالة الشرائح من الغرفة الرطوبة ، وشطف لفترة وجيزة مع المصفوفات اغسل الاحتياطي D في زجاجة شطف قبل ان يضع في رف الشريحة. عادة ما يكون حجم الاحتياطي شطف الغسيل D هو 2 مل لكل صفيف. مكان الرف الشريحة التي تحتوي على الشرائح في غسل بن العازلة التي تحتوي على 110 ألف لتر اغسل بن شاكر مكان على مدار الساعة 60-90 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
إزالة شريحة من رفوف مخزن غسل ، وشطف لفترة وجيزة مع اغسل الاحتياطي D ، نقل الشريحة إلى رف بن تحتوي اغسل B الاحتياطي ، ويهز في 60-90 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
جافة بلطف الصفيف على كل شريحة ، ومكان الشرائح المجففة في الغرفة الرطوبة في التحضير للخطوات ampliPHOX الكشف اللونية.

3. ampliPHOX : وسم المنتجات المهجنة ورقائق المعايرة مع ampliTAG

ضم ميكرولتر من 10 ampliTAG و 20 ميكرولتر من العازلة ampliTAG 2X ، و 10 ميكرو لتر من المياه النقية لكل مجموعة بحيث تتم معالجتها. يمكن تحجيم حجم كاشف ببساطة عن مجموع عدد من العينات. تأكد من أن يعد ما يكفي من خليط وضع العلامات على حساب لجميع المصفوفات والمصفوفات عينة المعايرة اللازمة. عدد رقائق المعايرة اللازمة يعتمد على ما إذا كنت إجراء المعايرة الكامل (عن أداة جديدة أو كثيرا جديدة من الكواشف) ، أو مجرد أداة الاختيار. لمعايرة كامل ، ينبغي أن يكون المسمى رقائق المعايرة 3 ، وكاشف للفحص ، ينبغي أن يكون المسمى مجرد رقاقة المعايرة واحد. يرجى ملاحظة أن قبل أن يتم تسمية صفائف المعايرة ، فإنها ينبغي أن تمر عبر هذه الخطوة ما قبل الغسيل التهجين التي تم وصفها سابقا للمصفوفات الأنفلونزا.
نقل 40 ميكرولتر مزيج التسمية على كل مجموعة وتسمح العلامات رد فعل على المضي قدما في غرفة مغلقة الرطوبة لمدة 5 دقائق.
شطف على الفور مع غسل صفائف الاحتياطي D في زجاجة شطف قبل وضع الشرائح في حامل الشرائح. نقل إلى رف بن تحتوي على 110 مل من اغسل الاحتياطي C ، ويهز في 60-90 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
تستخدم بن لغسل الثانية المملوءة الماء النقي ، نفذ ثلاث مرات متتالية الانخفاضات المياه قصيرة لإزالة بقايا الملح. تجفيف صفائف عن طريق لمس الأنسجة ممسحة بلطف إلى حافة الآبار.
هي الآن بشكل صحيح مع ميكروأرس المسمى ampliTAG ، ويمكن تنفيذ ما تبقى من إجراءات الكشف ampliPHOX. وينبغي الانتهاء من التصوير وتنشيط ضوئي صفائف المسمى في غضون 24 ساعة ، ويمكن تخزين صفائف إضافية في خانة الشريحة الظلام حتى الاستخدام.

4. ampliPHOX : المعايرة ، تضخيم الإشارات ، والتصوير

بدوره ampliPHOX على القارئ وضمان ampliVIEW البرنامج هو على استعداد لتنشيط ضوئي.
تحديد الوقت الأمثل تنشيط ضوئي باستخدام رقائق المعايرة. بالإضافة إلى مقدمة موجزة الذي يلي ، كما هو مبين في هذا الإجراء بالتفصيل في دليل التشغيل ampliPHOX. رقائق معايرة تحتوي على سلسلة من التخفيفات لمراقبة تسلسل biotinylated التي تستخدم لتحسين حساسية الفحص ، وذلك بهدف تحقيق أقصى قدر من عدد من الصفوف من الشريحة المعايرة التي تنتج إشارة إيجابية على النحو الذي يحدده البرنامج.
إزالة ampliPHY من 4 درجات مئوية ، والسماح لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة ، ودوامة لفترة وجيزة إلى المزيج. 3 الماصة ميكرولتر من محسن ampliPHY في قارورة ampliPHY ، ودوامة جيدا لمدة 10 ثانية.
نقل 40 بالتساوي ميكرولتر من محلول ampliPHY في ميكروأري تحتوي جيدا ampliTAG المسمى مجموعة ، وضمان عدم وجود فقاعات. إغلاق فيال ampliPHY بين كل طلب. إدراج الشريحة ميكروأري في خليج تنشيط ضوئي للقارئ ampliPHOX.
لمعايرة مجموعة الأولى ، استخدام الوقت تنشيط ضوئي الافتراضية في مربع "تايم" على لوحة lefthand من البرنامج ، وانقر على الأخضر "ابدأ" الزر لبدء تنشيط ضوئي. عند الانتهاء ، إزالة مجموعة وشطف مع الماء النقي لإزالة ampliPHY الزائدة. وينبغي تشكيل البوليمر واضحة على بعض البقع تكون الآن مرئية.
السماح للبقع البوليمر لتجف لمدة 2 دقيقة ، ثم توزيع قطرتين من ampliRED على الصفيف والسماح للتلوين والمضي قدما لمدة 2 دقيقة.
المقبل ، وشطف ميكروأري بسرعة مع المياه النقية والجافة يمسح بمنديل.
إدراج ميكروأري في خليج التصوير من القارئ ampliPHOX ، وانقر على زر 'التقاط صورة جديدة" في التبويب التصوير. التقط مرة واحدة ، وضبط المحاصيل وحفظ الصورة.
في التبويب تحليل ، حدد قناع المعايرة وتشيب على زر "الموضع تلقائي" لبدء التحليل. يقوم البرنامج تلقائيا إنتاج "تسجيل ملخص" تظهر النتائج كميا. بناء على هذه النتائج ، يتم ضبط الوقت تنشيط ضوئي بنسبة 10 ثانية لمجموعة المعايرة الثانية ، ويتم تكرار هذا الإجراء.
مرة واحدة وقد تم تحديد الوقت الأمثل تنشيط ضوئي ، يمكن معالجة المصفوفات باستخدام العينة نفسها ، وتضخيم إشارة بروتوكول التصوير المستخدمة للمصفوفات المعايرة.
مرة يتم التقاط صورة للمصفوفات العينة ، يمكن للقناع للتخطيط الخاص مجموعة معينة مثل الأنفلونزا تخطيط مجموعة وصفها هنا يمكن created.The ampliVIEW البرمجيات هي قادرة على أداء الآلي تحليل الصور وتوليد النتائج الأنفلونزا التصنيف الفرعي لكل عينة.

5. ممثل النتائج :

figure-protocol-10037
الشكل 1. توضيح تخطيطي لطريقة الكشف ampliPHOX اللونية. (A) هو تهجين الحمض النووي المستهدف Biotinylated إلى كل بقعة في الصفيف ، و (ب) المسمى مع ampliTAG. (C) ثم يضاف ampliPHY الحل ، و (D) تعرضها للضوء لتشكيل البوليمر البقع مرئية. (E) والملون لاحقا البقع البوليمر شكلت مع صبغة غير سامة لتحسين التباين.

ontent ">

الشكل 2 : (أ) منخفض الكثافة ميكروأري الأنفلونزا التخطيط. متواليات 1-7 و 10-13 أنفلونزا الهدف ألف ، ومتواليات 8 و 9 باء الانفلونزا هدف (B) ampliPHOX و (ج) من الصور مضان H1N1 رواية 2009 ('انفلونزا الخنازير') عينة تبين نمط الكشف عن نفسه من قبل كل من الأساليب.

figure-protocol-10855
الشكل 3. من اليسار إلى اليمين ، وصور للممثلة ampliPHOX H3N2 A ، الأنفلونزا البشرية المنشأ H1N1 ، H1N1 2009 رواية (الخنازير المنشأ) ، وعينة سلبية. جميع أنواع فرعية 3 تظهر أنماط متميزة بصريا على صفيف. إشعار في السلبية التي ينظر اليها فقط MS2 السيطرة الداخلية ، مما يدل على التضخيم RT - PCR لم الكبت.

Discussion

كشف اللونية ampliPHOX التكنولوجيا المقدمة هنا هي سريعة ، رخيصة بديلة للكشف لون واحد مضان لانخفاض الكثافة ميكروأري التطبيقات. أظهرت تخطيطي في الشكل 1 ، ويستند على مبدأ الكشف عن استخدام تسمية photoinitiator (1B). في وجود حل مونومر المحتوية على (1C) ، والتعرض للضوء يسبب photoinitia...

Disclosures

كل من المؤلفين هم من موظفي InDevR ، وشركة كيان للربح. InDevR هو تسويق هذه التكنولوجيا ampliPHOX الموصوفة هنا.

Acknowledgements

InDevR يقر المعاهد الوطنية للصحة / NIAID U01AI070276 وR43AI077112 لتمويل هذا العمل.

Materials

كاشف / المعدات	الصانع	كتالوج #	تعليقات
Name	Company	Catalog Number	Comments
Qiagen سبين الفيروسات MinElute كيت	Qiagen	57704	شطف واحد 60 ميكرولتر
QIAcube	Qiagen	9001292	اختياري
ABI 9800 Cycler السريع الحرارية	تطبيق النظم البيولوجية	4441166
Qiagen OneStep RT - PCR طقم	Qiagen	210210	لا تستخدم عدة dNTPs
2X الاحتياطي الإكتشاف	شركة InDevR	MI - 5007
Biotinylated dNTP ميكس	شركة InDevR	MI - 5009
امدا نوكلياز خارجية	التكنولوجيات الحيوية Epicentre	LE032K	2500 U ، 10U/μl
FluChip التمهيدي مزيج	InDevR	N / A	لم يتوفر حتى الآن للبيع
شاكر المداري	Madell التكنولوجيا	ZD - 9556 - A
سلال غسيل	شركة InDevR	MI - 4002
غسل الرفوف	شركة InDevR	MI - 4003
2X تهجين العازلة	شركة InDevR	MI - 5004
المعايرة شيبس	شركة InDevR	AP - 5006
غسل المخازن ميلادي	شركة InDevR	MI - 5005
ampliRED	شركة InDevR	AP - 5004
ampliTAG	شركة InDevR	AP - 5001
2X ampliTAG العازلة	شركة InDevR	AP - 5002
ampliPHY ، ampliPHY محسن	شركة InDevR	AP - 5003

References

Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. , (2010).
Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

52 ampliPHOX

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: