Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

Özet

ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Özet

DNA mikrodizilerinin patojen tespiti için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin ^1-5, tip ve alt tip grip virüsü yeteneğini pek çok örnek gösterilmiştir DNA mikrodizilerinin grip ^6-11 tanımlama ve alt tipleme hem kamu uygulamalar vardır sağlık ve klinikte erken teşhis, hızlı müdahale ve bir influenza pandemisi etkisini en aza indirmek için. Geleneksel floresan şu anda en yaygın olarak kullanılan mikroarray tespit yöntemi. Ancak, klinik kullanımına yönelik mikroarray teknolojisi ilerledikçe, ¹ düşük maliyetli algılama teknolojisi, floresan, benzer bir performans özellikleri sergileyerek, pahalı aletlerle yerine mikroarray deneyleri daha cazip ve uygun maliyetli hale getirecek.

AmpliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi araştırma uygulamaları için tasarlanmıştır ve floresan mikroarray için gerekli konfokal mikroarray tarayıcılar ile karşılaştırıldığında yaklaşık on kat daha düşük cihaz maliyeti olan bir ana avantajı ile, geleneksel ^floresan 11 büyüklükte bir düzen içinde algılama sınırı vardır . algılama. Diğer bir avantajı, geleneksel floresan araçların aksine, taşınabilirlik ve esneklik sağlayan cihaz, kompakt boyutu. Polimerizasyon teknolojisi floresan algılama gibi doğal doğrusal olmadığından, ancak, bu gibi patojen tespiti diziler için belirli bir sırayla varlığı için bir evet / hayır cevabı istenilen düşük yoğunluklu mikroarray uygulamaları, en uygundur. Şu anda ampliPHOX algılama ile uyumlu en yüksek nokta yoğunluğu ~ 1800 lekeler / dizi. Çünkü nokta yoğunluğu sınırlamaları, yüksek yoğunluklu mikroarray'ler ampliPHOX tespiti için uygun değildir.

Burada, grip virüsleri tespit ve karakterizasyonu (FluChip) için geliştirilen bir düşük yoğunluklu mikroarray sinyal amplifikasyon yöntemi olarak ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mevcut. Bu protokol, benzer bir şekilde etiketlenir ve tespit edilebilir biotinlenmiş hedef içeren herhangi bir mikroarray ampliPHOX algılama, belirli bir uygulama olarak FluChip (DNA mikroarray) kullanmasına rağmen. Çekilecek hedef mikroarray tasarım ve biyotinilasyon kullanıcının sorumluluğundadır. Biotinlenmiş hedef dizi esir edildikten sonra, ilk etiketleme ampliPHOX algılama streptavidin-etiket konjuge (ampliTAG) ile dizi yapılabilir. (AmpliPHY) monomer çözüm ampliPHOX Reader enstrüman, polimerizasyon kullanarak ışık maruz kalma sonucunda ampliTAG etiketli hedefler içeren bölgeler yalnızca oluşur. Oluşan polimer sonradan basit bir yazılım paketi (ampliVIEW) kullanarak görüntüleme ve analiz takip görsel kontrastı artırmak için non-toksik bir çözüm lekeli olabilir. Yaklaşık 6 saat içinde sonuç un çıkarılan örnek tüm FluChip tahlil yapılabilir ve yukarıda açıklanan ampliPHOX algılama adımları yaklaşık 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Protokol

1. RT-PCR kullanarak Örnek amplifikasyon

1. Klinik malzeme veya viral bir QIAcube otomatik nükleik asit ekstraksiyon platformu ile birlikte Qiagen MinElute Virüs Spin Kit kullanılarak izole eder. Viral RNA Özü Ekstraksiyonları 60 ul son bir elüsyon hacmi 200 ul numune üzerinde yapılır. Mağaza özleri -70 ° C veya daha sonra kullanmak için daha düşük.
2. Bir şablon serbest alanda buz üzerinde, üretici firmanın protokolüne göre RT-PCR master karışımı hazırlar. RT-PCR sırasında biotin birleştirmek için, üretici dNTP karışımı verilen yerine biotinlenmiş dNTP karışımı kullanın. Biotinlenmiş dNTP karışımı kullanarak maliyeti 1 ABD Doları / tahlil dolardan az. Biotin esas biotinlenmiş bir astar kullanımı gibi alternatif yöntemler de kullanılabilir. Ekle astar Gribi A 1.0 mcM son konsantrasyonlarda karışımları, gribi B 1.0 mcM ve iç kontrol için 0,14 mcM. Grip A astar set matris gen segmenti (1032 nt ürün) güçlendirir ve Flu B astarı kümesi olmayan bir yapısal gen segmenti (811 nt ürün) güçlendirir. Her bir FluChip astar seti tek iplikli DNA, PCR aşağıdaki lambda eksonükleaz ile enzimatik sindirim yoluyla üretimi kolaylaştırmak için bir 5 'fosforilasyonunu grubu ile bir astar içerir. Tek telli ürün çift telli eşdeğer daha kısa hibridizasyon kez gerektirir ve genel tahlil süresi önemli ölçüde kısaltır. Bu primerlerin önceden hazırlanmış karışım yanı sıra iç kontrol şablonu RNA InDevR sınırlı olarak ilgilenen araştırmacılara mevcuttur.
3. Kısaca vorteks ve ince duvarlı PCR tüpleri içine ana karışımı 18 ul dağıtmak.
4. Şablon eklenmesi için uygun bir çalışma alanı buz tüpler transfer ve Her reaksiyon tüpüne 2 ul şablon ekleyebilirsiniz.
5. Transfer termal cycler ve aşağıdaki termal profili çalıştırın PCR tüpleri: 50 ters transkripsiyon ° 95 az 30 dakika, enzim inaktivasyonu / aktivasyonu için 15 dakika, 30 saniye 40 - 95 ° C PCR döngüleri, 55 ° C ° C 30s için C ve 72 ° C'de 1 dakika ve 72 ° C 10 dakika için son bir uzantısı.

2. RT-PCR ürünleri düşük yoğunluklu mikroarray'ler Hibritleşme

1. FluChip hibridizasyon için tek iplikli DNA oluşturmak için, 1.0 ul lambda eksonükleaz enzim, eşlik eden reaksiyon tamponu ul 2.2 ve 0.8 ul nükleaz içermeyen su birleştirerek enzimatik sindirim karışım hazırlayın. Bu tutarlar, tek bir örnek, ama kolayca sindirilir örneklerin toplam sayısı için ölçekli olabilir. Termal cycler örnekleri çıkarın ve PCR ürün fosforile iplikçik sindirmek için her reaksiyon Hazırlanan karışım 4 ul ekleyin. Termal cycler ve program enzimatik sindirim ve ısı parçalanma adımları tamamlamak için 10 dakika boyunca 95 santigrat derece 15 dakika 37 santigrat derece termal cycler numune dönün.
2. Uygulamalı Mikroarray'ler A.Ş. (Tempe, AZ) tarafından kullanılan özel grip mikroarray'ler aldehit Fonksiyonlu cam slaytlar yazdırılır. 5'-amino sonlandırılır yakalama dizileri (pozitif kontrol dizisi için ayrıca bir 3'-biotin değişiklik ve 500 nM son bir konsantrasyon fark hariç), optimize edilmiş bir lekelenme tampon ile birleştirilmiş ve 20 mcM bir final konsantrasyon yazdırılır . Optimal bir nokta çapı 300 mm ve 700 mm merkezi pitch merkezi yöntemi lekelenme temassız kullanılır.
3. Saklama kutusu mikroarray'ler çıkarın ve koruyucu tabakayı kaldırma ve iyi çevresine sıkıca basarak mikroarray'ler etrafında tek kullanımlık hibridizasyon kuyu uygulamak.
4. Yeri 110 ml 60-90 rpm'de orbital çalkalayıcı kullanarak 5 dakika öncesi hibridizasyon yıkama için arıtılmış su içeren bir yıkama bin slaytlar. Yavaşça kuyunun kenarına bir kağıt mendille silecek dokunmadan ve su uzakta kötülerin olmak için izin dizi kurulayın.
5. Parçalanmış ssDNA ürünleri her 22 ul, 2x Hibridizasyon Tampon ve mikroarray kuyulara hibridizasyon çözümleri pipetlemeyin 40 ul birleştirin.
6. Slaytlar, 60 dakika boyunca kapalı nem odasında melezleşme izin verin.
7. Nem odasından slaytları çıkarın, slayt rafın içine yerleştirmeden önce kısaca bir durulama şişe Yıkama Tamponu D dizileri durulayın. Genellikle durulama Yıkama Tamponu D hacmi 2 ml dizi başına. Yeri orbital çalkalayıcı 1 dakika boyunca 60-90 rpm'de 110 ml Yıkama Tamponu A. Yeri bin içeren yıkama bin slaytlar içeren slayt raf.
8. Yıkama Tampon slayt rafa kaldırın, kısaca Yıkama Tamponu D, Yıkama Tamponu B içeren bir çöp transfer slayt raf ile temizleyin, durulayın ve 60-90 rpm'de 5 dakika sallayın.
9. Her bir slayt dizi yavaşça, kuru ve kurutulmuş slaytlar ampliPHOX Kolorimetrik Algılama adımlar için hazırlık nem odasında yerde.

3. ampliPHOX: ampliTAG ile melezleşmiş ürün ve kalibrasyon cips etiketleme

1. Birleştirmek AmpliTAG 10 ul, 20 ul 2x ampliTAG tampon, ve 10 ul işlenecek her dizi için arıtılmış su. Reaktif hacimleri sadece örneklerin toplam sayısı ölçeklendirilebilir. Gerekli tüm örnek diziler ve kalibrasyon dizileri için hesap için yeterli etiketleme karışımı hazırlamak için emin olun. Gerekli kalibrasyon yongalarının sayısı tam bir kalibrasyon (yeni bir enstrüman ya da yeni reaktiflerin çok) ya da sadece bir araç kontrol yapmakta olup olmadığına bağlıdır. Tam bir kalibrasyon için, 3 kalibrasyon cips etiketli olmalıdır ve reaktif kontrol için, sadece tek bir kalibrasyon çip etiketli olmalıdır. Kalibrasyon dizileri etiketli önce, onlar daha önce grip diziler için açıklanan ön hibridizasyon yıkama adım geçmesi gerektiğini lütfen unutmayınız.
2. Her bir dizi için 40 ul etiketi karışımı aktarın ve 5 dakika boyunca kapalı bir nem odasında devam tepki etiketleme izin.
3. Yıkama Tamponu D dizileri slaytlar slayt rafa yerleştirmeden önce bir şişe durulama hemen yıkayın. Yıkama Tamponu C 110 ml içeren bin içine raf aktarın ve 5 dakika boyunca 60-90 rpm'de sallamak.
4. Arıtılmış su ile dolu bir ikinci yıkama bin kullanarak, tuz artıklarını kaldırmak için üç ardışık kısa su dips gerçekleştirin. Dizilerin bir doku silecek kuyulardan kenarına hafifçe dokunarak kurulayın.
5. Mikroarray'ler ampliTAG ile artık düzgün etiketli ve ampliPHOX saptama prosedürü geri kalan yapılabilir. Etiketli dizileri fotoaktivasyon ve görüntüleme 24 saat içinde tamamlanması ve ek dizileri kullanana kadar karanlık bir slayt kutusunda saklanabilir.

4. ampliPHOX: kalibrasyon, sinyal amplifikasyonu ve görüntüleme

1. AmpliPHOX okuyucu açın ve ampliVIEW yazılım fotoaktivasyon için hazır olduğundan emin olun.
2. Kalibrasyon yongaları kullanarak optimal fotoaktivasyon zamanı belirleyin. Takip eden kısa bir giriş ek olarak, bu yordamı ampliPHOX Kullanım Kılavuzu da detaylı olarak özetlenen. Kalibrasyon cips, kalibrasyon çip yazılımı tarafından belirlenen bir olumlu sinyal üretmeye satır sayısı en üst düzeye çıkarmak amacı ile, testin hassasiyetini optimize etmek için kullanılan bir biotinlenmiş kontrol dizisi dilüsyonları bir dizi içerir.
3. 4 ila ampliPHY çıkarın ° C, oda sıcaklığına kadar ısınmasını bekleyin ve karıştırın kısaca girdap. Pipetleyin 3 ampliPHY şişenin içine ampliPHY arttırıcı ul ve 10 saniye boyunca iyice girdap.
4. Eşit kabarcıklar mevcut olmasını sağlamak, ampliTAG etiketli dizi içeren mikroarray 40 ul ampliPHY çözüm transfer. Her uygulama arasında ampliPHY flakon kapatın. Mikroarray slayt ampliPHOX Reader fotoaktivasyon yuvasına takın.
5. İlk kalibrasyon dizi için, yazılım sol panelindeki 'Zaman' kutusuna varsayılan fotoaktivasyon zaman kullanmak ve fotoaktivasyon başlatmak için yeşil 'Başlat' düğmesini tıklatın. Tamamlandığında, dizi kaldırmak ve aşırı ampliPHY kaldırmak için arıtılmış su ile durulayın. Clear polimer oluşumu bazı noktalar şimdi görünür olmalıdır.
6. Polimer noktalar 2 dakika kurumasını bekleyin, daha sonra iki damla dizinin üzerine ampliRED dağıtmak ve 2 dakika boyunca devam etmek için boyama izin.
7. Daha sonra, hızlı bir şekilde saf su ve kuru bir kağıt mendille silin mikroarray durulayın.
8. Mikroarray ampliPHOX Reader görüntüleme yuvasına yerleştirin ve Görüntüleme sekmesinde 'Capture Yeni Resim' düğmesini tıklatın. Bir kez görüntülenmiş, kırpma ayarlayabilir ve görüntü kaydetmek.
9. Analiz sekmesinde, analiz başlatmak için Kalibrasyon Chip maskesi ve 'Otomatik Yerleştirme' düğmesini seçin. Yazılım otomatik olarak sayısal sonuçlarını gösteren bir 'Özet Record' üretecek. Bu sonuçlara göre, ikinci kalibrasyon dizi için fotoaktivasyon süresi 10 saniye ayarlanabilir, ve prosedür tekrarlanır.
10. En uygun fotoaktivasyon zamanı tespit edildikten sonra, örnek dizileri kalibrasyon diziler için kullanılan aynı sinyal amplifikasyon ve görüntüleme protokolü kullanarak işlenebilir.
11. Sonra örnek diziler için yakalanır, grip dizisi düzeni burada açıklanan özellikle dizi düzeni için bir maske created.The ampliVIEW yazılım otomatik görüntü analiz yapan ve her bir örnek için influenza alt tipleme sonuçları üretme yeteneğine sahip olabilir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 ampliPHOX kolorimetrik tespit yöntemi şematik gösterimi. (A) biotinlenmiş hedef DNA dizi her yerinde melezleşmiştir ve (B) ampliTAG ile etiketlenir. (C) ampliPHY çözüm eklendikten sonra, ve (D), görünür polimer noktalar oluşturmak için ışığa maruz. (E) oluşan polimer noktalar daha sonra kontrastı geliştirmek için toksik olmayan boya ile boyandı.

ontent ">
Şekil 2 (A) İnfluenza düşük yoğunluklu mikroarray düzeni. Diziler 1-7 ve 10-13 hedef İnfluenza A ve dizileri 8, 9 hedef influenza B (B) ampliPHOX ve (C) aynı algılama modeli gösteren bir 2009 romanı H1N1 (domuz gribi ') örnek floresan görüntüleri hem de yöntemleri.

Şekil 3 Soldan sağ, influenza A H3N2, insan kaynaklı H1N1, 2009 romanı H1N1 (domuz kökenli), ve bir negatif örnek temsilcisi ampliPHOX görüntüleri. Tüm 3 alt tipi dizi görsel olarak farklı desenler gösterir. Sadece MS2 iç kontrol görülen negatif Bildirimi, RT-PCR belirten inhibe değildi.

Tartışmalar

Burada sunulan ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi, düşük yoğunluk mikroarray uygulamalar için tek renkli floresan tespiti için hızlı, ucuz bir alternatif. Şekil 1'de şematik olarak gösterilmiştir, algılama ilkesi kullanımı ile ilgili bir photoinitiator etiket (1B) dayanır. Monomer içeren bir çözüm (1C) varlığı, ışığa maruz kalma photoinitiator (ampliTAG) yalnızca etiketli bölgelerde bir polimerizasyon reaksiyonu tetiklemek için (1D) neden olur. Influenza tanı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / ekipman	Üretici	Katalog #	Yorumlar
Qiagen MinElute Virüs Spin Kiti	Qiagen	57704	tek 60 ul elüsyon
QIAcube	Qiagen	9001292	isteğe bağlı
ABI 9800 Hızlı Termal Cycler	Applied Biosystems	4441166
Qiagen OneStep RT-PCR kiti	Qiagen	210210	kiti kullanıldı. dNTP
2x Spotting Tampon	InDevR Inc.	MI-5007
Biotinlenmiş dNTP Mix	InDevR Inc.	MI-5009
Lambda eksonükleaz	Epicentre Biyoteknoloji	LE032K	2500 U, 10U/μl
FluChip astar Karışımı	InDevR	N / A	satilik henüz mevcut değil.
Orbital Çalkalayıcı	Madell Teknoloji	ZD-9556-A
Kovaları yıkayın	InDevR Inc.	MI-4002
Raflar yıkayın	InDevR Inc.	MI-4003
2x Hibridizasyon Tampon	InDevR Inc.	MI-5004
Kalibrasyon Chips	InDevR Inc.	AP-5006
Tamponlar AD yıkayın	InDevR Inc.	MI-5005
ampliRED	InDevR Inc.	AP-5004
ampliTAG	InDevR Inc.	AP-5001
2x ampliTAG Tampon	InDevR Inc.	AP-5002
ampliPHY, ampliPHY arttırıcı	InDevR Inc.	AP-5003