عالية الدقة 3D تصوير السابقين فيفو العينات البيولوجية بواسطة CT مايكرو

Summary

لا يمكن أن يتحقق من غير المدمرة حجم التصور فقط من خلال تقنيات تصوير الشعاعي الطبقي ، الذي هو الأكثر كفاءة التصوير المقطعي بالأشعة السينية الصغرى المحوسبة (CT).

Abstract

لا يمكن أن يتحقق من غير المدمرة حجم التصور فقط من خلال تقنيات تصوير الشعاعي الطبقي ، الذي هو الأكثر كفاءة التصوير المقطعي بالأشعة السينية الصغرى محوسبة (μCT).

ارتفاع القرار μCT هو تنوعا جدا بعد دقيقة (1-2 ميكرون من القرار) تقنية لفحص 3D السابقين فيفو العينات البيولوجية ^{1 و 2.} على العكس من التصوير المقطعي الإلكترون ، وμCT يسمح للفحص لمدة تصل إلى 4 سم عينات سميكة. هذا الأسلوب يتطلب بضع ساعات فقط من قياس مقارنة أسابيع في الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، μCT لا تعتمد على نماذج stereologic 2D ، وبالتالي تكمل ويمكن في بعض الحالات يمكن أن تحل محل أساليب النسيجي حتى ^{3 ، 4} ، وكلاهما مضيعة للوقت وتدميرا. تكييف العينة وتحديد المواقع في μCT واضحة ولا تحتاج إلى فراغ ارتفاع أو انخفاض درجات الحرارة ، مما قد يؤثر سلبا على الهيكل. يتم وضع العينة واستدارة 180 درجة أو 360 درجة بين مصدر الأشعة السينية للكشف عن وmicrofocused أ ، والذي يتضمن وماض وكاميرا CCD دقيقة ، للحصول على كل زاوية أخذ صورة 2D ، ومن ثم يتم إعادة وحدة التخزين بالكامل باستخدام واحد من الخوارزميات المختلفة المتاحة ^5-7. القرار 3D يزداد مع انخفاض الخطوة التناوب. بروتوكول الفيديو ويبين الخطوات الرئيسية في الشلل ، وإعداد وتحديد المواقع للعينة تليها التصوير بدقة عالية.

Protocol

1. نموذج إعداد

1. بعد استخراج الانسجة التي سيتم النظر ، ويمكن وضعه في الأنسجة المعدنية الصك وتصويرها. وينبغي لصورة واحدة الفخذ الماوس اتبع الخطوات التالية :
   1. إزالة آخر الساق الوفاة من جنين C57/Bl6 18.5 يوما postceutus (E18.5).
   2. ختم نهاية الضيقة لطرف البوليسترين ماصة (2-20 ميكرولتر) باستخدام راتنجات الايبوكسي أو الغراء آخر ، وتعبئة رأس العمل مع العازلة (PBS أو غيرها).
   3. تناسب محكم المحطة في تلميح وختم الطرف الآخر مع ورقة parafilm.
   4. مكان غيض ماصة الى صاحب المناسبة ومتابعة البروتوكول من الفصل 3. لتصور عظمة الفخذ من الماوس الجنين الساق ، ويتم تعيين صك 40 كيلوفولت أمبير و 200. ل8μ القرار 1000 مع إسقاط الصور التكبير 4X يجب أن تكون مكتسبة.
2. غير المعدنية أنسجة يجب أن تكون ثابتة في البداية والملون من أجل زيادة توهين الأشعة السينية من النسيج ذات الاهتمام باستخدام واحدة من العديد من البروتوكولات المتاحة ^8،9. لالرئتين الفئران وعينات مماثلة ، وإعداد بروتوكول هو :
   1. Orthotopical غرس غير سرطان الرئة صغير الخلية (NSCLC) NCI - H460 على الرئتين الفئران عارية
   2. العقيدات سرطان الرئة تبدأ يجري كشفها 4 أسابيع من الزرع
   3. التضحية الفئران ويبث مباشرة مع محلول ملحي مختلطة مع الهيبارين
   4. مع حقن من محلول مخفف من Microfil (Flowtech) ، (2 مل من محلول مركب ، 3 مل من مخفف و 0.3 مل من علاج وكيل) في البطين الأيسر إلى وصمة عار على تداول القصبي
   5. استخراج الرئتين والقلب من الفئران
   6. شل العينة (انظر الفصل 2 من البروتوكول) أنه من المناسب بإحكام في أنبوب اختبار البلاستيك 50 مل
   7. خلق جو مشبع الايثانول من خلال وضع على الجزء السفلي من الأنبوب قطعة قماش ثبط في الإيثانول
   8. الغراء أو المسمار الأنبوب في حامل الصك
   9. المضي قدما في إعداد المعلمات التصوير (الفصل 3). التصوير الكامل للرئتين الفئران تم تعيين مصدر في و40KV أمبير 100. من أجل التوصل إلى قرار 16μ على المرء أن الحصول على صور الإسقاط 2500 في التكبير من 0.5x.

2. عينة الشلل

في ارتفاع القرار ، فمن الأهمية بمكان تجنب أي تغيير في الموقف خلال عينة القياس. لذلك ، يتم إصلاح بإحكام العينة إلى مستلم البلاستيك الذي يناسب حجمها. نصائح ماصة تستخدم البوليسترين والبلاستيك باستور ماصات من البلاستيك أو أصحاب بنيت خصيصا في هذا الصدد. وفقا لمتطلبات تجريبية ، يمكن فحص العينة في الهواء أو مغمورة في محاليل الإيثانول أو العازلة. يظهر الشلل النموذجية والمواقع النهائية للساق الجنين الماوس في الصك في الشكل 1.

الشكل 1. الموضع النهائي للساق الفأر الجنينية في الصك CT الجزئي.

3. إعداد المعلمات اقتناء : الأشعة السينية الجهد والتيار تعرض اتفاقية مكافحة التصحر ، والوقت

1. وضع في حامل ، يتم وضع العينة في مرحلة التناوب الصك
2. تؤخذ في أول صورة الأشعة السينية مع مجموعة تعسفا الجهد والحالية.
3. إذا كانت الصورة مظلمة جدا ، وينبغي للمرء أن زيادة عدد الفوتونات الأولى ، فتزيد قليلا الحالية. إذا كان هذا لا يكفي ، ينبغي للمرء أن زيادة طفيفة في طاقة الفوتونات الأشعة السينية ، أي الجهد على أنبوب الأشعة السينية.
4. إذا كانت الصورة مشرقة جدا ، وينبغي للمرء أن أول انخفاض الجهد ، ثم الحالي.
5. ويمكن زيادة سطوع الصورة عن طريق binning. Binning من 1 تأخذ بعين الاعتبار كثافة كل بيكسل في الصورة ، في حين binning من 2 يأخذ مجموع كل مصفوفة 2X2 بكسل. وسوف تكون الصورة حوالي 4 مرات أكثر إشراقا مما كانت عليه في حالة binning 1 ، ولكن سوف يكون نصف القرار.
6. بعد تعيين السطوع الأمثل ، يتعين على المرء أن الاستفادة المثلى من وقت التعرض للكاميرا للتوسط بين أفضل المقابل على جانب واحد وفترة معقولة من التجربة على جانب آخر.
7. على النقيض من الصور ، وخاصة من انخفاض امتصاص عينات ، يمكن أن تتحسن باستخدام المرشحات ، والتي تقلل من تدفق الفوتون ، لا سيما ان من الفوتونات انخفاض الطاقة.

4. نموذج لتحديد المواقع

1. اختر التكبير العمل. الخيارات الممكنة هي 0.5x ، 4X ، 10X ، 20X 40X و. في مجال الرؤية يتناقص مع زيادة التكبير.
2. الحصول على القرار الأمثل ومجال الرؤية من خلال تحديد المسافات بين مصدر الأشعة السينية وعينة وبين العينة وكاشف لل. زيادة المسافة إلى مصدر العينة يقلل من مجال الرؤية ، ويزيد من القرار. عينة لمسافة كاشف له تأثير معاكس.

وينبغي أن الحقل بالكامل ليتم عرضه في 3D تكون موجودة فيصورة الإسقاط في جميع الزوايا. ينبغي للمرء أن تحقق هذا عن طريق تناوب عينة في زوايا مختلفة ، وبذلك يصبح نموذج أقرب وقت ممكن للوصول إلى محور الدوران. لهذا ، ينبغي للمرء أن تتبع الخطوات التالية :

3. التقاط صورة في 0 درجة ، ومن ثم تدوير العينة عند -20 درجة. إذا كان حجم المطلوب تحولت أفقيا ، وينبغي للمرء أن تصحيح موقفها قبل إعادة محور الدوران.
4. بعد التصحيح ، والعينة هي أن تكون استدارة في زاوية أخرى ، وتصحيح الموقف مرة أخرى ، حتى في مجال الاهتمام داخل الصورة في كل الزوايا من -90 إلى 90 درجة.

5. ارتفاع القرار صورة مقطعية

1. هي التي اتخذت خلال القياس ، ويتم تدوير العينة من زاوية صغيرة في كل مرة وعند كل زاوية الإسقاط صورة واحدة. مجموع عدد الصور هو دائما حلا وسطا بين القرار المطلوب على جانب واحد ووقت وقياس حجم الملف على جانب آخر. كما هو مبين في Fig.2 ، كل واحد يشمل جميع التوقعات في العينة شرائح متراكبة أحدها على الآخر ، وبالتالي لا يمكن الكشف عن هيكل 3D من العينة.

الشكل 2. صور الإسقاط في الرئة من الفئران في 0 درجة (A) و 45 درجة (B) ، وزاوية 90 درجة التناوب (C).

2. إلا بعد أخذ الصور الإسقاط على الأقل بين -90 و 90 درجة ، يمكن للمرء أن الشروع في إعادة الإعمار من حجم العينة. إعادة الإعمار تستغرق ما بين 10 دقيقة و 2 ساعة ، اعتمادا على البرمجيات المستخدمة وعدد من الإسقاطات. مرة أخرى ، وجودة الصورة النهائية لل3D هو حل وسط بين الدقة المطلوبة ووقت واحد يريد أن يقضي وحجم الملف الناتج.

6. صورة مقياس المعايرة

مستوى بكسل (القيمة) في صورة فريدة من نوعها لإعادة بناء تلك الصورة. من أجل مقارنة صورتين مختلفتين ، وهو مقياس كثافة فريدة من نوعها والتي تفرض على كل صورة. لهذا

1. التصوير المقطعي مع تشغيل شبحا قياسي باستخدام نفس الظروف التجريبية بالنسبة للعينة
2. إعادة تقويم صورة نموذج باستخدام القيم التي حصل عليها لالوهمية. المقياس الأكثر شيوعا هو (أو CT) هاونسفيلد النطاق. لتكبير 4X بلغت قيمة 15000 خلفية (للمياه أو PBS) استبدال 0 و استعيض عن الحد الأقصى لقيمة 35000 للعظم مع قيمة هاونسفيلد مستوى 3000. أسفرت قيم البيكسل الأخرى من الخطية أو الاستقراء على أساس تلك الحدود.

7. معالجة الصور وتحليلها

بعد الحصول على صور عالية الدقة ، على المرء أن استخراج المعلومات ذات الصلة باستخدام برمجيات تحليل الصور. حزمة البرامج لاستخدامها يجب أن تكون مصممة للعمل مع الملفات الكبيرة جدا (تصل إلى 20GB).

8. ممثل النتائج

ويرد بعد اربعة ايام من بدء عملية تمعدن في الشكل 3 -- تمثيل عظم فخذ من ماوس C57/Bl6 في اليوم الجنينية 18.5 (E18.5). الطبقات المعدنية هي واضحة للعيان (أبيض) ، في حين أن الأنسجة الرخوة ليست واضحة في هذا الإعداد. أخذنا الصور الإسقاط 1000 مع التكبير الخطي لل4X. القرار النهائي هو 8 ميكرون. تحليل دقيق لجعل حجم مبين في Fig.1 ، وتبين أن نسبة حجم العظام (الكسر من حجم العظام التي تحتلها الأنسجة المعدنية) هو 0.18 ، وكثافة المعادن في العظام هو 723 ملغم / سم ^3. تلك القيم تسمح لنا أن نقارن هذا مع هيكل العظام في المراحل الأخرى للتنمية.

الشكل 3. تمثيلات مختلفة لصورة 3D من جنين فأر عظم الفخذ. في (المقطع العرضي) مستعرضة (A) ، تظهر sagital (ميديو - الوحشي) المقطع (ب) وتقديم لقطة من حجم (C).

ويبين الشكل 4 صورة 3D للرئة الفئران عارية الإناث (RNU) ، و 12 أسابيع من العمر ، غير مزروع orthotopically مع سرطان الرئة صغير الخلية (NSCLC) NCI - H460. وقد اتخذت صورا الإسقاط 2500 مع التكبير الخطي لل0.5x ، وضمان التوصل إلى حل نهائي من 16 ميكرون. صورة يظهر Microfil الأوعية الدموية الملون (قطرها ميكرون وصولا الى 20) ، وتحليل الصور يظهر ان 4 أسابيع بعد الزرع ، وتشكل عقيدات سرطان متعددة. فهي تغطي جزءا كبيرا من حجم الرئة (17 ٪). تم العثور على أكثر من تلطيخ الرئوي في المناطق الطرفية من الأورام. إلى حد كبير ، كما هو مبين في الشكل 4B والأوعية الدموية عدة موجودة أيضا داخل العقيدات ، وتغطي ، وفقا لتحليل أولي نحو 3 ٪ من حجمها.

الشكل 4. 3D صورة من العقيدات السرطان تنمو في الفئرانالرئة. وتظهر لقطة لجعل الصوت (A) وقسم من خلال حجم (B). يتم وضع علامة على سرطان العقيدات مع السهام.

الفيلم 1. جعل حجم عظم الفخذ الماوس في الشكل 1. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

الفيلم 2. جعل حجم الرئتين الفئران في الشكل 2. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.

فيلم 3. أقسام المسلسل من خلال الرئتين. العقيدات تظهر المناطق الرمادية في معظم الشرائح. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.

Discussion

C57/Bl6 الفأر الجنينية في يوم 18.5 (E18.5) وبعد اربعة ايام من بدء عملية تمعدن. في هذه المرحلة من التنمية ، وجعل العظم مستقبل طبقات كثيرة من osteoids المعدنية ، وينظر بشكل واضح في الشكل رقم 3. عند هذه النقطة ، ينبغي للمرء أن أشدد على أن الأنسجة يمكن تصور المعدنية في دقة أقل مع الصكوك المختلفة التي تتطلب كميات أقل من التعامل مع العينة. هذا البروتوكول (وثيقة CT الدقيقة المستخدمة في ذلك) بالإضافة إلى توفير مستوى أعلى من القرار ، ويوفر أعلى من المرونة للمستخدم لاختيار أفضل المعايير الهندسية للقياس.

النتائج في الشكل رقم 4 تظهر أنه في الرئة مثلي النماذج الحيوانية السرطان ، والإنسان غير سرطان الرئة ذي الخلية الصغيرة يمكن أن تحدث تجنيد الأوعية الدموية واتساع الأوعية الدموية. نحن نعتبر أن تم نقل أيا من أنسجة الرئة ، ولم يتغير شكله خلال القياس. يجب على المستخدم اتخاذ احتياطات خاصة لتجنب مثل هذه التغييرات خلال التصوير المقطعي. بالنسبة لبعض العينات ، وخاصة بالنسبة ليونة الأنسجة ، وعلى المرء أن بناء الأجهزة الخاصة القابضة التي شل تماما خلال عينة القياس. للأسف حالت دون وجود تسرب عالية من التباين في عامل محيط الأورام تقدير موثوق في الأوعية الدموية الطرفية. نتيجة لذلك أصبح ملوثا بعض الصور عن طريق وكيل تلوين خاصة على الحواف ، والتي من الواضح أنها موجودة في الأفلام 2 و 3. لم نتمكن من منع هذا التسرب ، لكنه لم يؤثر على معلومات مفيدة عن العقيدات السرطان ، بما في ذلك حجمها وشكلها وجود الأوعية الدموية الداخلية. يمكن أن نستنتج بوضوح أن ما لا يقل عن التداول الشعبي الذي درس هنا ، وإمدادات الدم الطرفية يشارك في نضح الورم ، مع بعض الارواء الحالي ايضا داخل الورم.

Materials