Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Özet

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Özet

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü μCT ex-vivo biyolojik örnekler ^{1, 2} 3D inceleme için çok yönlü ama doğru bir tekniktir (1-2 mikron çözünürlük) . Elektron tomografisi aksine, μCT 4 cm kalınlığında numunelerin incelenmesi sağlar. Bu teknik, histoloji hafta ile karşılaştırıldığında, sadece birkaç saat ölçüm gerektirir. Buna ek olarak, μCT, 2D stereolojik modelleri güvenmeyin böylece tamamlayıcı olabilir ve hatta bazı durumlarda, hem de zaman alıcı ve yıkıcı histolojik ^{yöntemler 3, 4,} değiştirebilirsiniz . ΜCT örnek klima ve konumlandırma basittir ve yapısını olumsuz etkileyebilecek yüksek vakum veya düşük sıcaklıklarda gerektirmez. Örnek yerleştirilmiş ve 2B görüntü alınan her açı için sintilatör ve doğru bir CCD kamera içeren bir microfocused x-ray kaynağı ve dedektör arasında 180 ° veya 360 ° döndürülmüş ve daha sonra tüm hacim birini kullanarak yeniden ^5-7 farklı algoritmalar. 3D çözünürlük dönme adım azalma ile birlikte artar. Mevcut video protokol hazırlanması, immobilizasyon ve yüksek çözünürlükte görüntüleme ile takip örnek konumlandırma ana adımları göstermektedir.

Protokol

1. Örnek hazırlama

1. Incelenmek üzere doku ayıkladıktan sonra, mineralize dokuların cihaz yerleştirilmiş ve görüntülü olabilir. Fare femur bir görüntü için aşağıdaki adımları izleyin:
   1. C57/Bl6 embriyo 18.5 gün postceutus (E18.5) mortem bacak sonrası çıkarın.
   2. Epoksi reçine veya başka bir yapıştırıcı kullanarak polistiren pipet ucu (20-200 ul) dar ucuna Seal, ve çalışma tamponu (PBS veya diğer) ucu doldurmak.
   3. Bacak içine ucu sıkıca oturtun ve parafilm levha ile diğer ucunu mühür.
   4. Pipet ucu uygun bir tutucu içine yerleştirin ve bölüm 3 protokolü uygulayın. Fare bacak embriyo femur görselleştirmek için, cihaz 40 KV ve 200 uA ayarlanır. 8μ çözünürlük için 4x büyütme ile 1000 projeksiyon görüntüleri elde edilecek.
2. Sigara mineralize dokuların başlangıçta mevcut olan birçok protokolleri ^8,9 birini kullanarak ilgi dokusunun X-ray zayıflama artırmak için sabit ve lekeli olmak için var. Sıçan akciğer ve benzer örnekler için hazırlık protokolü:
   1. Çıplak sıçan akciğer küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) NCI-H460 Orthotopical implantasyon
   2. Akciğer kanseri nodüller 4 hafta implantasyon saptanabilir
   3. Sıçan Kurban ve hemen heparin ile karıştırılarak tuzlu su çözeltisi ile demlenmeye
   4. Bronş dolaşımı leke Microfil (Flowtech), (bileşik çözümü, seyreltici 3 ml ve 0,3 ml sertleştirici 2 ml), seyreltilmiş bir çözüm ile sol ventrikül içine enjekte
   5. Sıçan akciğer ve kalp Özü
   6. 50 ml plastik test tüpü içine sıkıca sığdırarak örnek hareketsiz (protokol bölüm 2)
   7. Tüpün alt etanol batırılmış bir bez koyarak doymuş etanol ortam yaratın
   8. Tutkal ya da vida tutucu bir enstrüman tüp
   9. Görüntüleme parametreleri (bölüm 3) ayarı ile devam edin. Rat akciğerlerin tam görüntüleme için kaynak 40KV ve 100 uA olarak belirlenmiştir. 16μ çözüme ulaşmak için bir 0.5x büyütme 2500 projeksiyon görüntüleri elde etmek için vardır.

2. Örnek immobilizasyon

Yüksek çözünürlükte, ölçüm sırasında numune pozisyonunda herhangi bir değişiklik önlemek için önemlidir. Bunun için, numune boyutuna uygun bir plastik alıcı içine sıkıca sabitlenir. Polistiren pipet uçları, plastik Pasteur pipetler veya bu konuda özel olarak inşa edilmiş plastik tutucular kullanılır. Deneysel gereksinimlerine göre, hava örnek incelenir veya etanol veya tampon çözeltiler dalmış. Tipik immobilizasyon ve enstrüman fare embriyo bacak son konumlandırma Şekil 1 de gösterilmiştir.

Şekil 1. Mikro CT enstrüman embriyonik fare bacak Final konumlandırma.

3. Satın alma parametrelerinin ayarlanması: x-ray gerilim ve akım, CCD maruz kalma süresi

1. Bir tutucu yerleştirilir, örnek cihazın dönme aşamasında koymak
2. Voltaj ve akım keyfi olarak ayarlanmış bir ilk x-ray görüntü alınır.
3. Görüntü çok karanlık ise, bir ilk fotonların sayısını artırmak, böylece akımı biraz artar. Bu yeterli değilse, bir x-ray fotonların enerji biraz artırmanız gerekir, yani x-ışını tüpü gerilim.
4. Görüntü çok parlak ise, bir ilk sonra akım, voltaj düşmesi gerekiyor.
5. Görüntünün parlaklığı binning artabilir. 2 binning 2x2 piksel her matrisin toplamını alır ise 1 binning, görüntüde her pikselin yoğunluğu dikkate alır. Görüntü binning 1 durumda yaklaşık 4 kat daha parlak olacak, ama yarım çözünürlüğe sahip olacak.
6. Optimum parlaklık ayarladıktan sonra, bir iyi kontrast arasında bir yan ve başka bir tarafında deneme süresi makul bir uzlaşma için kamera poz süresi optimize etmek için vardır.
7. Özellikle düşük emici örnekleri kontrast görüntüler, ağırlıklı olarak düşük enerjili fotonların, foton akısı azaltmak filtreleri kullanarak geliştirilebilir.

4. Örnek konumlandırma

1. Çalışan büyütme seçin. Olası seçenekleri, 0.5x, 4x, 10x, 20x ve 40x. Artan büyütme görüş alanı azalır.
2. Optimal çözünürlük ve alan, x-ışını kaynağı ve örnek arasında ve örnek ve dedektör arasındaki mesafeleri ayarlayarak alın. Örnek mesafe kaynak artırılması görüş alanı azalır ve çözünürlüğü artar. Dedektörü mesafe için örnek tam tersi bir etkiye sahiptir.

3D görülebilir alan mevcut olmalıdırtüm açılardan projeksiyon görüntü. Bir farklı açılardan örnek dönen ve dönme ekseni mümkün olduğunca yakın örnek getirerek bunu kontrol etmelisiniz. Bunun için, bir aşağıdaki adımları izlemeniz gerekir:

3. 0 derece bir görüntü çekmek ve daha sonra örnek -20 derece döndürün. İstenen hacme laterale kaymıştır, bir dönme ekseni yeniden konumunu düzeltmek gerekir.
4. Düzeltme yapıldıktan sonra, örnek, başka bir açıda döndürülebilir ve ilgi alanına görüntünün içinde tüm açılardan -90 ila 90 derece kadar pozisyonu, tekrar düzeltildi.

5. Yüksek çözünürlüklü tomogram

1. Ölçüm sırasında, örnek bir seferde küçük bir açı ve her açılı bir projeksiyon görüntüsü döndürülür alınır. Görüntülerin toplam sayısı, her zaman bir tarafta istenen çözünürlük ve başka bir tarafında ölçüm ve dosya boyutu arasında bir uzlaşma. Şekil 2'de görüldüğü gibi, her bir projeksiyon başka bir yere bir örnek tüm dilimleri üst üste ve bu nedenle örnek 3D yapı veremiyoruz içerir.

Şekil 2. (A), 45 °, (B) ve 90 ° (C) dönme açısı 0 ° sıçan akciğer projeksiyon görüntüleri .

2. Sadece en az -90 ve 90 derece arasında projeksiyon görüntüleri aldıktan sonra, bir örnek hacmi yeniden devam edebilirsiniz. İmar, kullanılan yazılım ve projeksiyonlar sayısına bağlı olarak 10 dakika ile 2 saat arasında sürer. Yine, son 3D görüntü kalitesi istenen çözünürlük ve harcamak istiyor ve sonuçta elde edilen dosya boyutu arasında bir uzlaşmadır.

6. Görüntü ölçekli kalibrasyon

Yeniden inşa edilen bir görüntü piksel seviyesi (değer) bu görüntü için eşsizdir. Iki farklı görüntü karşılaştırmak için eşsiz bir skalası her görüntünün cezası verilebilir. Bunun için

1. Örnek için aynı deneysel koşullar kullanarak standart bir hayalet ile bir tomografi çalıştırın
2. Fantom için elde edilen değerler kullanılarak örnek görüntü ayarlamasını yapınız. En yaygın Hounsfield (veya CT) ölçeği. 4x büyütme (su veya PBS) 15.000 arka plan değeri 0 ile değiştirildi ve kemik için maksimum değeri 35.000, 3000 standart Hounsfield değeri ile değiştirildi. Diğer piksel değerleri, bu sınırları dayalı doğrusal enterpolasyon veya ekstrapolasyon sonuçlandı.

7. Görüntü işleme ve analiz

Yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde ettikten sonra, bir görüntü analiz yazılımı ile ilgili bilgileri ayıklamak. Kullanılacak yazılım paketi, çok büyük dosyaları (en fazla 20Gb) ile çalışmak üzere tasarlanmış olması gerekir.

8. Temsilcisi Sonuçlar

C57/Bl6 fare embriyonik gün 18.5 (E18.5) femur gösterimi - dört gün mineralizasyon süreci başladıktan sonra, Şekil 3 de gösterilmiştir. Yumuşak dokuların bu hazırlık görünmez ise mineral katmanları, (beyaz) açıkça görülebilir. Biz, 4x doğrusal bir büyütme ile 1000 projeksiyon görüntüleri aldı. Son çözünürlüklü 8 mikron. Şekil 1'de gösterildiği gibi volume rendering dikkatli bir analizi, kemik hacim fraksiyonu (mineralize doku tarafından işgal kemik hacmi kesir) 0.18 olduğunu gösterir, ve kemik mineral yoğunluğu 723 mg / cm ^3. Bu değerler bize diğer gelişme evrelerini kemikler ile bu yapısını karşılaştırmak için izin verir.

Şekil 3 fare femur embriyonun bir 3D görüntü farklı temsilleri. Çapraz (kesit) (A) sagital (medio-lateral) bölümünde (B) ve volume rendering (C) bir anlık gösterilmiştir.

Şekil 4 küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) NCI-H460 orthotopically implante 12 hafta eski bir kadın çıplak sıçan (RNU), akciğerlerin bir 3D görüntü gösterir. 16 mikron nihai bir çözüm sağlanması, 0.5x doğrusal bir büyütme ile 2500 projeksiyon görüntüleri alınmıştır. Görüntü Microfil lekeli kan damarları (çapı 20 mikron kadar) gösterir görüntü analizi implantasyon 4 hafta sonra, birden fazla kanser nodüller oluşmuş olduğunu göstermektedir. Onlar akciğer hacmi (% 17) önemli bir kısmını kaplamaktadır. Pulmoner boyama çoğu tümörler periferik alanlarda bulundu. Da önemlisi, incir 4B gösterildiği gibi, birden fazla kan damarları, ön incelemeye göre kendi hacminin yaklaşık% 3 kapsayan, nodüllerin içinde de mevcuttur.

Şekil 4 bir sıçan büyüyen kanser nodülleri 3D görüntüakciğer. Volume rendering (A) ve hacim (B) aracılığıyla bir bölümü bir anlık gösterilmiştir. Kanser nodülleri oklarla işaretlenmiştir.

Film 1 Şekil 1'de fare femur Volume rendering film izlemek için buraya tıklayın.

Film 2 Şekil 2 sıçan akciğerlerin hacmi render film izlemek için buraya tıklayın.

Film 3 akciğerler yoluyla Seri bölümleri. Nodüller dilimleri gri alanlar olarak görünür. film izlemek için buraya tıklayın.

Tartışmalar

C57/Bl6 fare embriyonik gün 18.5 (E18.5) mineralizasyon süreci başladıktan sonra dört gün. Şekil 3 açıkça görülen bu gelişim aşamasında, gelecekteki kemik, mineralize osteoids birçok katmandan yapılır. Bu noktada, bir mineralize dokulara daha az numune alma gerektiren farklı enstrümanlar ile düşük çözünürlükte görülebilmesi vurgulamak gerekir. Daha yüksek çözünürlük sağlayan yanı sıra, mevcut protokolü (ve mikro CT aleti kullanılır), ölçüm için en iyi geometrik parametreleri seçmek için kullanıcı için en yüksek esnekliği sunmaktadır.

Şekil 4 Sonuçlar ortotopik akciğer kanseri hayvan modellerinde, insan küçük hücreli dışı akciğer kanseri, kan damarları ve neovaskülarizasyon alımı neden olduğunu göstermektedir. Akciğer dokusunda kaydıramaz olduğunu düşünün, ne de ölçüm sırasında şeklini değiştirdi. Kullanıcı bir tomografi sırasında bu tür değişiklikleri önlemek için özel önlemler almalısınız. Bazı örnekler için, özellikle yumuşak doku için, bir ölçüm sırasında mükemmel örnek hareketsiz özel tutan cihazlar oluşturmak için vardır. Ne yazık ki tümörlerin bir ortamda yüksek kontrast madde sızıntılarının varlığı, periferik kan damarlarını güvenilir kantifikasyon engelledi. Bir sonucu olarak görüntüleri filmleri 2 ve 3 de net bir şekilde mevcut olduğu, özellikle kenarlarında bazı boyama ajan tarafından kusurludur. Biz bu dökülme engel olamazdı, ama, boyut, şekil ve iç kan damarlarının varlığı da dahil olmak üzere kanser nodülleri hakkında yararlı bilgiler etkilenen değildi. Biz açıkça, en azından burada incelenmiştir bronş dolaşımı için, periferik kan dolaşımı da tümör içindeki bazı perfüzyonu ile tümör perfüzyon mevcut katılır sonucuna olabilir.

Malzemeler