Высокое разрешение изображения в 3D Экс-Vivo Биологические образцы от Micro КТ

Резюме

Неразрушающий объем визуализации может быть достигнуто только с помощью методов томографического, из которых наиболее эффективной является рентгеновского микро-компьютерная томография (КТ).

Аннотация

Неразрушающий объем визуализации может быть достигнуто только с помощью методов томографического, из которых наиболее эффективной является рентгеновского микро-компьютерная томография (μCT).

Высокое разрешение μCT является очень гибким но точно (1-2 микрон резолюции) техники для 3D обследование бывших естественных биологических образцов ^{1, 2.} В отличие от электронной томографии, μCT позволяет изучить до 4 см толщиной образцов. Этот метод требует лишь нескольких часов измерений по сравнению с недели в гистологии. Кроме того, μCT не опирается на 2D stereologic моделей, при этом он может дополнять, а в некоторых случаях может даже заменить гистологических методов ^{3, 4,} которые оба много времени и разрушительной. Кондиционирования проб и позиционирования в μCT проста и не требует высокого вакуума и низких температур, которые могут негативно отразиться на структуре. Образец позиционируется и вращается на 180 ° или 360 ° между microfocused рентгеновского источника и детектора, который включает в себя сцинтиллятора и точные ПЗС-камеры, для каждого угла 2D-изображения берется, а затем весь объем восстанавливается с помощью одного из различных доступных алгоритмах ^5-7. 3D разрешение увеличивается с уменьшением вращения шаг. Настоящий протокол видео показывает основные этапы подготовки, иммобилизации и позиционирование образца следует изображений с высоким разрешением.

протокол

1. Пробоподготовка

1. После извлечения ткани, который должен быть рассмотрен, минерализованные ткани могут быть размещены в прибор и образ. Для изображения одним щелчком бедра должны следовать следующие шаги:
   1. Удалить после смерти ноги от C57/Bl6 эмбриона 18,5 дней postceutus (E18.5).
   2. Печать узкий конец наконечника пипетки полистирола (20-200 мкл) с помощью эпоксидной смолы или другой клей, и заполнить наконечник с рабочим буфером (PBS или другие).
   3. Fit плотно ногой в нос и печать с другого конца листа парафильмом.
   4. Место пипетки в подходящий держатель и следовать протоколу из главы 3. Для визуализации бедренной кости из ног эмбриона мыши, прибор установлен 40 кВ и 200 мкА. Для 8μ резолюции 1000 проекции изображения с 4-кратным увеличением должны быть приобретены.
2. Номера для минерализованных тканей должны быть первоначально фиксировали и окрашивали в целях увеличения рентгеновского ослабления ткани интереса с помощью одного из многих доступных протоколов ^8,9. Для легких крысы и аналогичных образцов, подготовка протокола:
   1. Orthotopical имплантации немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) NCI-H460 на обнаженном легких крысы
   2. Узелки рака легких начать быть обнаружены 4 недели с имплантацией
   3. Жертва крысы и сразу же влить его с солевой раствор смешивается с гепарином
   4. Вводите его в разбавленный раствор Microfil (Флоутек), (2 мл сложный раствор, 3 мл растворителя и 0,3 мл отвердителя) в левый желудочек, чтобы окрасить бронхиальной обращении
   5. Извлечение легких и сердца крысы
   6. Остановите образца (см. главу 2 протокола) путем установки его плотно в 50 мл пробирки пластиковые
   7. Создать насыщенной атмосфере этанола путем размещения на дне пробирки тканью, смоченной в этаноле
   8. Клей или винт трубку в держатель инструмента
   9. Приступить к настройке параметров изображения (глава 3). Для полной визуализации легких крысы источник установлен на уровне 40 кВ и 100 мкА. Для того чтобы достичь 16μ разрешение нужно получать 2500 изображений проекции с увеличением 0.5x.

2. Пример иммобилизации

При высоком разрешении, важно, чтобы избежать любых изменений в положения образца в процессе измерения. Для этого образец плотно фиксируется в пластиковых получателя, который соответствует его размер. Полистирол наконечники пипеток, пластиковых пипеток Пастера или специально построенных пластиковые держатели используются в этом отношении. Согласно экспериментальным требованиям, образец может быть рассмотрено в воздухе или погруженного в этаноле или буферных растворов. Типичные иммобилизации и окончательное позиционирование нога эмбриона мыши в документе приведен на рис 1.

Рисунок 1. Заключительные позиционирование эмбриональных ногу мышь в инструмент микро-КТ.

3. Настройка параметров регистрации: рентгеновская напряжения и тока, CCD время экспозиции

1. Размещенные в держатель, образец помещается в стадии вращения инструмента
2. Первое рентгеновское изображение взято с напряжения и тока, произвольно установить.
3. Если изображение слишком темное, следует увеличить число фотонов, во-первых, тем самым увеличить немного тока. Если этого недостаточно, нужно несколько увеличится энергия рентгеновских фотонов, то есть напряжение на рентгеновской трубке.
4. Если изображение слишком яркое, надо сначала уменьшить напряжение, то ток.
5. Яркость изображения может быть увеличен путем биннинга. Биннинг из 1 учитывает интенсивность каждого пикселя на изображении, в то время биннинга из 2 принимает суммы каждой матрицы 2х2 пикселей. Изображение будет примерно в 4 раза ярче, чем в случае биннинга 1, но будет иметь половину указанной резолюции.
6. После настройки оптимальной яркости, нужно оптимизировать время экспозиции камеры на компромисс между лучшим контрастом с одной стороны и разумное время эксперимента на другой стороне.
7. Контрастность изображения, особенно с низким поглощающих образцов, может быть улучшено с помощью фильтров, которые снижают поток фотонов, в основном, что из нижней фотонов энергии.

4. Пример позиционирования

1. Выберите рабочее увеличение. Возможные варианты 0.5x, 4x, 10x, 20x и 40x. Поле зрения уменьшается с ростом увеличения.
2. Получите оптимальное разрешение и поле зрения, установив расстояния между источником рентгеновского излучения и образец и между образцом и детектором. Увеличение источника образца расстояние уменьшается поле зрения и повышает разрешение. Пример к детектору расстояние имеет противоположный эффект.

Все поле для просмотра в 3D должны присутствовать вПроекция изображения на всех углах. Надо проверить это вращением образца под разными углами и, принося образец как можно ближе к оси вращения. Для этого нужно выполнить следующие шаги:

3. Возьмите изображение при 0 градусов, а затем поверните образец до -20 град. Если нужного объема сместился в сторону, надо исправлять свои позиции путем перестановки оси вращения.
4. После коррекции, выборка должна быть повернута под другим углом и положение исправлено снова, пока область интересов внутри изображение при любых углах от -90 до 90 град.

5. Высокое разрешение томограмма

1. Во время измерений образец поворачивается на небольшой угол в то время, и на каждом углу одной проекции съемки. Общее количество изображений всегда компромисс между нужное разрешение на одной стороне и время измерения и размер файла на другой стороне. Как показано на рисунке 2, каждый прогноз включает в себя все ломтики в образце наложенных друг на друга, и поэтому не может раскрыть 3D структуры образца.

Рисунок 2. Проекция изображений легких крыс при 0 ° (А), 45 ° (В) и 90 ° (С) угол поворота.

2. Только после того, проекция изображения по крайней мере от -90 до 90 градусов, можно приступить к реконструкции объем образца. Реконструкция занимает от 10 минут до 2 часов, в зависимости от используемого программного обеспечения и числа проекций. Опять же, конечное качество 3D-изображения является компромиссом между желаемым разрешением и временем кто-то хочет потратить, и размер результирующего файла.

6. Калибровки Масштаб изображения

Уровне пикселей (значение) в восстановленном изображении является уникальным для этого образа. Для того чтобы сравнить два разных изображения, уникальные масштабы интенсивность должна быть наложены на каждого изображения. Для этого

1. Выполнить томографии с использованием стандартного фантомного же экспериментальных условиях, что и образец
2. Перекалибруйте образец изображения, используя значения, полученные для фантом. Наиболее распространенными масштаба Хаунсфилд (или КТ) масштабе. Для 4-кратным увеличением фонового значения в 15000 (воды или PBS) был заменен на 0, а максимальное значение 35000 для кости были заменены стандартные значения Хаунсфилд 3000. Другие значения пиксела в результате линейной интерполяции или экстраполяции на основе этих пределов.

7. Обработки и анализа изображений

После получения изображений с высоким разрешением, нужно извлекать соответствующую информацию с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Программный пакет, который будет использоваться должен быть предназначен для работы с очень большими файлами (до 20Gb).

8. Представитель Результаты

Представление бедра от C57/Bl6 мыши на эмбриональной день 18,5 (E18.5) - через четыре дня после начала минерализации процесс показан на рис 3. Минеральные слои хорошо видны (белый), в то время как мягкие ткани не видно в этой подготовке. Мы взяли 1000 изображений проекции с линейным увеличением 4x. Окончательное разрешение 8 мкм. Тщательный анализ объемов оказания показано на рис.1, показывает, что часть костей объем (доля объема кости, которая занята минерализованные ткани) составляет 0,18, а плотность костного минерала является 723 мг / см ^3. Эти значения позволяют сравнить эту структуру с костями и в других стадиях развития.

Рисунок 3. Различные представления 3D-изображение эмбриона бедра мыши. Поперечный (сечение) (), сагиттальной (средне-боковой) секции (В) и снимок объем рендеринга (С) показано на рисунке.

Рисунок 4 показывает 3D изображение легких женская обнаженная крысы (РНЕ), 12 недель, имплантированных orthotopically с немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) NCI-H460. 2500 изображений проекции были взяты с линейным увеличением 0.5x, обеспечивая окончательное решение от 16 микрон. Изображение показывает Microfil окрашенных кровеносных сосудов (до 20 микрон в диаметре). Изображение анализ показывает, что через 4 недели после имплантации, множественные узелки рака образуются. Они охватывают значительную часть объема легких (17%). Большинство легочных окрашивания был найден в периферийных зонах опухолей. Примечательно, что, как показано на рис 4В, несколько сосудов присутствуют и внутри узелки, которые охватывают, по предварительным анализом около 3% от их объема.

Рисунок 4. 3D изображение рака узелки растут в крысулегких. Снимок объем рендеринга () и раздел по объему (В) показано на рисунке. Рак узелки, помечены стрелками.

Фильм 1. Объем оказания мыши бедра на рисунке 1. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 2. Объем оказания крысы легких на рисунке 2. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 3. Последовательные срезы через легкие. Узелки выглядят как серые зоны в большинстве ломтиками. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.

Обсуждение

C57/Bl6 мыши на эмбриональной день 18,5 (E18.5) составляет четыре дня после начала процесса минерализации. На данном этапе развития, будущего кость состоит из множества слоев минерализованных osteoids, хорошо видно на рис 3. На данный момент, следует подчеркнуть, что минерализованные ткани могут быть визуализированы в более низком разрешении с различными инструментами, которые требуют меньше обработки проб. Настоящий протокол (и прибор микро-КТ используются в ней) помимо обеспечения более высокого разрешения, обеспечивает высокую гибкость для пользователя, чтобы выбрать лучшие геометрические параметры для измерения.

Результаты на рис 4 показывают, что в ортотопической модели рака легких животного, человека немелкоклеточного рака легкого может вызвать вербовку кровеносных сосудов и образование новых сосудов. Мы считаем, что легочная ткань не была ни двигались, и не имеет его форма изменилась во время измерения. Пользователь должен принимать специальные меры предосторожности, чтобы избежать таких изменений во время томографии. Для некоторых образцов, особенно для мягких тканей, нужно строить специальные фиксирующие устройства, которые идеально обездвижить образца в процессе измерения. К сожалению, наличие высоких утечек контрастного вещества в окрестностях опухолей помешала надежная количественная оценка периферических кровеносных сосудов. В результате изображения запятнан некоторые окрашивания агент особенно на краях, который явно присутствует в фильмах 2 и 3. Мы не могли допустить этого разлива, но полезной информации о раке узелки, включая их размер, форма и наличие внутренних сосудов не был затронут. Мы могли бы четко сделать вывод, что по крайней мере, бронхиальной циркуляции который здесь учился, периферической кровоснабжение опухоли участвует в перфузии, с некоторыми перфузии присутствует также внутри опухоли.

Материалы