طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Summary

ويمكن استخدام الخلايا بوساطة lymphocytotoxicity (CML) المقايسات لاختبار ردود الفعل وآليات autoreactive دراسة موت الخلايا في المختبر. ومع ذلك ، يمكن استخدام الخلايا الحية المجهرية مبائر تقنيات التصوير مع الأصباغ الفلورية ، اكتب وحركية من موت الخلايا وكذلك الممرات المستخدمة في دراستها بمزيد من التفصيل.

Abstract

داء السكري نوع 1 (T1D) هي الخلية بوساطة أمراض المناعة الذاتية تي. خلال المرضية ، والمرضى تصبح تدريجيا أكثر ناقص الأنسولين كما هو فقدان إنتاج الأنسولين ، ويفترض أن هذه النتائج من تدمير خلايا بيتا في البنكرياس من قبل خلايا تي. وفهم آليات موت الخلايا بيتا خلال تطوير T1D تقديم رؤى لإنشاء علاج فعال لهذا المرض. وقد استخدمت الخلية بوساطة lymphocytotoxicity (CML) المقايسات تاريخيا النويدات المشعة الكروم 51 ⁽⁵¹ ريال برازيلي) إلى تسمية الخلايا المستهدفة. ثم تتعرض هذه الأهداف إلى الخلايا المستجيب وقراءة الافراج عن ⁵¹ ساعة معتمدة من الخلايا المستهدفة كدليل على موت الخلايا اللمفاوية التي تتوسط فيها. مثبطات نتيجة موت الخلايا في الافراج انخفضت من ⁵¹ ساعة معتمدة.

كما الخلايا المستجيب ، استخدمنا تنشيط السكان نسيلي autoreactive من CD8 ⁺ T السامة للخلايا الليمفاوية (CTL) معزولة عن ماوس وراثيا الأسهم للألفا على حد سواء وسلاسل بيتا من مستقبلات الخلايا التائية AI4 (TCR). وتم تنشيط خلايا تي AI4 التعاون مع مثقف ⁵¹ ساعة معتمدة المسمى الخلايا المستهدفة NIT لمدة 16 ساعة ، والإفراج عن ⁵¹ ساعة معتمدة تم تسجيلها لحساب تحلل محددة

الميتوكوندريا المشاركة في العديد من الأحداث الفيزيولوجية الهامة ، مثل إنتاج الطاقة ، وتنظيم الإشارات تنبيغ ، وموت الخلايا المبرمج. دراسة التغييرات الوظيفية الميتوكوندريا خلية بيتا خلال تطوير T1D هي منطقة جديدة من الأبحاث. باستخدام غشاء الميتوكوندريا المحتملة صبغة رباعي ميثيل استر الميثيل رودامين (TMRM) ، والتصوير المجهري مبائر الخلية الحية ، رصدنا غشاء الميتوكوندريا المحتملة على مر الزمن في خط خلايا بيتا NIT - 1. للدراسات والتصوير ، وكانت تسمى الخلايا التائية المستجيب AI4 مع صبغة الفلورسنت النووية تلطيخ Picogreen. NIT - 1 الخلايا والخلايا التائية وشارك في تربيتها في غرف ساترة والتي شنت على المسرح المجهر مجهزة غرفة الخلية الحية ، التي تسيطر على 37 درجة مئوية ، مع 5 ٪ CO ₂ ، ومرطب. خلال هذه التجارب تم التقاط صور من كل مجموعة كل 3 دقائق لمدة 400 دقيقة.

أكثر من 400 دورة دقائق ، لاحظنا تبديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا في NIT - 1 كتل الخلية حيث كانت تعلق AI4 خلايا تي. في التجربة التحكم في وقت واحد حيث تم NIT - 1 الخلايا المستزرعة التعاون مع MHC سوء المتطابقة ظلت الميتوكوندريا المحتملة غشاء خلايا لمفاوية Jurkat ، سليمة. ويمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة التغييرات في الوقت الحقيقي في غشاء الميتوكوندريا المحتملة في الخلايا الليمفاوية تحت هجوم السامة للخلايا ، السيتوكينات ، أو الكواشف السامة للخلايا أخرى.

Protocol

1. إعداد الخلايا

1. هدف الخلية الثقافة : الثقافة وكان من خطوط الماوس خلايا بيتا ، وNIT 1 - 4 - NIT ، وهو ^1،2 الموصوفة سابقا في DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ ، 0.02 ٪ BSA ، غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 15mM HEPES ، 16.5mM Glocose والبنسلين / الستبرتوميسين. لمدة ⁵¹ ساعة معتمدة العلامات ، وخلايا البذور في شقة القاع 96 - جيدا لوحة الثقافة في الخلايا 5X10 ⁴ / 200 جيدا في مستنبت ميكرولتر. المجهري للتجارب ، وخلايا البذور في 8 كذلك مختبر تاك ساترة الثاني في غرف 5x10 ⁴ في غرفة في 500 مستنبت ميكرولتر ، والسماح لتنمو لمدة 48 ساعة قبل أن تستخدم في التجارب السمسة.
2. خط السيطرة الخلايا التائية ثقافة : استخدام خط الخلية Jurkat (آي تي سي سي ، CD3 ⁺ خط الخلية البشرية لمفاوية) كعنصر تحكم سلبية. خلايا Jurkat الثقافة في RPMI1640 تستكمل مع FBS 10 ٪ ، 2 مم L - الجلوتامين ، 1.5 بيكربونات الصوديوم ز / لتر ، HEPES 10 مم و 1.0 ملي البيروفات الصوديوم.

2. جمع وتنشيط الخلايا المستجيب autoreactive CD8 ⁺ T

NOD.Cg - Rag1 ^tm1Mom تيراغرام (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4a] واشتريت NOD.Cg - Rag1 ^tm1Mom تيراغرام (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b] من مختبر جاكسون (بار هاربور ، ME) و ولدت في مرفق ماوس لدينا. ذرية هجينة F1 من التزاوج من AI4a - NOD مع NOD - AI4b [NOD - AI4a / ب] تطوير مرض السكري في 3-5 أسابيع من العمر. وتم إيواء جميع الفئران في مرافق خالية من مسببات الأمراض المحددة والتي وافقت عليها رعاية الحيوان المؤسسة ذات الصلة واللجنة الاستخدام.

1. الموت ببطء الاسبوع القديمة 3-4 NOD - AI4a / ب الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون _2.
2. جمع الطحال من الفئران. وتعد الفئران الموت الرحيم برذاذ الإيثانول وافتتح تحت غطاء الجراحية. تتم إزالة الطحال ووضعها في الجليد الباردة HBSS عازلة على الفور.
3. جمع خلايا الطحال باستخدام 7 مل زجاج الخالط. يتم وضع اثنين الى ثلاثة في الطحال كل 5 مل من HBSS الباردة والمتجانس مع الخالط 7 مل الزجاج. ويتم جمع وطرد جناسة في 1200rpm لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية باستخدام جهاز للطرد المركزي ⁺ Sorvall RT7. وتجمع كريات الخلية.
4. إزالة خلايا الدم الحمراء باستخدام علاج ناقص التوتر الحل. تعامل مع الكريات 5 مل محلول ناقص التوتر / الطحال على الجليد لمدة 5 دقائق ، ثم تحييدها عن طريق إضافة حجم مساو من HBSS. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي ، على النحو الوارد أعلاه ، وresuspend في 50 مل HBSS. تمر الخلايا من خلال مصفاة علقت الخلية والعد باستخدام عدادة الكريات مع تلوين TrypanBlue.
5. تنشيط الخلايا. في الخلايا Resuspend 5x10 ⁶ / مل ، وتفعيل استخدام الثقافة لمدة 3 أيام مع 0.1 ميكرومتر mimotope AI4 (تسلسل الأحماض الأمينية YFIENYLEL) و 25 يو / مل IL - 2 في RPMI1640 تستكمل مع FBS 10 ٪ ، 2 مم L - الجلوتامين ، 1.5 غرام / L بيكربونات الصوديوم ، و 10 ملم و 1.0 HEPES البيروفات الصوديوم ملم.

3 ^(51). مقايسة الافراج برازيلي لدراسة CML

1. تسمية الخلايا المستهدفة : إضافة ⁵¹ ساعة معتمدة على استهداف الخلايا في 1 μCi / جيدا والثقافة لمدة 3 ساعات ، وتغسل 3 مرات مع الثقافة المتوسطة.
2. تعليق الخلايا المستجيب في المتوسط ​​1640 RPMI على النحو المذكور في الخطوة 2.5 بحيث الحجم النهائي إضافة إلى كل بئر على بعد 200 ميكرولتر.
3. بعد غسل النهائي لتسمية الخلايا المستهدفة ، إضافة إلى تنشيط الخلايا المستجيب الثقافات الخلية الهدف المنشود في المستجيب لاستهداف (E : T) النسب. نستخدم عادة E : نسب تي في 0.4:1 ، 1:1 ، 2:1 ، 5:1 ، 20:01 ، 10:01 و 50:1.
4. إضافة جديدة معدلة RPMI المتوسطة 1640 (انظر الخطوة 2.5) إلى 6 آبار من الخلايا المستهدفة لتكون بمثابة تحلل التحكم التلقائي.
5. شارك في الثقافة واستهداف الخلايا المستجيب لمدة 16 ساعة.
6. جمع طاف في أنابيب زجاجية لايم 6x50 ملم
7. ليز الخلايا بإضافة 100μl SDS 2 ٪ و pipetting بلطف عدة مرات.
8. جمع lysate خلية في مجموعة أخرى من الأنابيب الزجاجية الجير 6x50 ملم.
9. يغسل مرة واحدة مع الآبار النظيفة ₂ O H وإضافة إلى غسل الأنابيب lysate الخلية.
10. عد supernatants وlysates الخلية باستخدام عداد غاما.
11. حساب تحلل محددة على النحو التالي :
    

4. تلون الخلايا للخلية الحية التصوير

من بين الأكثر شيوعا الأصباغ غشاء الميتوكوندريا المحتملة ، TMRM يسلك الأقل سمية الميتوكوندريا ³ ولذلك ، اخترنا لهذه الدراسات TMRM التصوير الخلية الحية.

1. تعد الأسهم 40 ملم في حل TMRM DMSO وتخزينها في -20 درجة مئوية. جعل [25 نانومتر] جديدة تعمل في حل DMEM الحمراء الخالية من الفينول مع ملاحق لجميع NIT - 1 ثقافة الخلية ^1.
2. وصمة عار الهدف NIT - 1 نانومتر الخلايا مع 25 TMRM لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة تحتوي على 5 نانومتر TMRM للحفاظ على توازن توزيع ال ⁴ صباغة.
4. العد تنشيط خلايا تي المستجيب AI4 باستخدام عدادة الكريات.
5. وصمة عار تنشيط خلايا تي المستجيب AI4 مع 1 ميكروليتر / مل لPicogreen5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل مع الفينول مرات الثقافة الحمراء الخالية من 3 المتوسط.

5. اللمفاويات T تقييم موت الخلايا بوساطة بيتا باستخدام التصوير الخلية الحية

1. تحميل ساترة غرف مع الخلايا NIT الملون على مرحلة مجهر زايس 510 LSM مبائر. إزالة علامة التبويب مع dremmel والغاز تعقيم غرف زجاجية مع أكسيد etheline. تم تجهيز المسرح مع غرفة التصوير الخلية الحية التي تسيطر على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ مع الرطوبة.
2. إضافة تنشيط خلايا تي وملون لغرف معينة في البريد مختلفة : نسب T
3. وأضاف نفس العدد من الخلايا Jurkat الملون إلى غرف التحكم.

6. الحصول على الصور الخلية الحية

وقد تم تجهيز المجهر مع مرحلة الآلية التي سمحت لنا مرارا وتكرارا الحصول على الصور في مواقع مختلفة من الغرف المتشابهة أو المختلفة تلقائيا على مدار الساعة من التجربة.

1. باستخدام عدسة النفط الهدف 63x ، التقاط صور في الفترة الفاصلة بين كل 3 دقائق ليصبح المجموع 300 لقطة في الموقع.
2. الكشف عن تلطيخ TMRM باستخدام طول موجة من 543 نانومتر الإثارة وتعيين مرشح ل565-619 نانومتر الانبعاثات
3. كشف Picogreen تلطيخ باستخدام الإثارة 488 نانومتر ، ومجموعة لتصفية 500-630 نانومتر الانبعاثات. تم إنشاء الفيديو باستخدام برمجيات LSM زايس.

7. تحويل الفيديو للنشر

1. باستخدام برنامج LSM زايس ، إنشاء ملف الفيلم غير مضغوط في شكل AVI.
2. لتحويل الفيديو الى صيغة المنشورة ، واستيراد الفيديو في البرنامج فيجي الحزمة ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ) ، وهو ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ط / ) التوزيع ، وذلك باستخدام البرنامج المساعد Bioformats من الامكنه ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
3. ضبط إعدادات السطوع والتباين لتحقيق التوازن بين الاشارات الحمراء والخضراء ، وتم تحديد معدل الإطار إلى 2 إطارات / ثانية باستخدام القائمة خيارات الرسوم المتحركة.
4. المحاصيل الفيديو إلى 512 بكسل 512 x و تصدير كملف AVI غير مضغوط.
5. فتح هذا الملف AVI في برنامج كويك تايم 7 (آبل كمبيوتر ، كوبرتينو ، كاليفورنيا) ، وضغط والتصدير في شكل شريط فيديو في ملف مفتوح H264/MPEG-4 1200 KBS / ثانية.

8. ممثل النتائج :

1. ونتيجة الفحص ممثل من ₅₁ CML الكروم. الشكل 1 يبين نتيجة الفحص ممثل CML حيث تحلل في المئة محددة (Y المحور) كما يزيد المستجيب : النسبة المستهدفة (X المحور) الزيادات. الخلايا المستهدفة هي الجزر المعزولة من الابتدائي NOD العوز المناعي Rag1 - / -- الفئران وصفت ب ⁵¹ ساعة معتمدة. معزولون Splenocytes من الفئران المعدلة وراثيا NOD.AI4α / β وتنشيط كما هو موضح في الخطوة 2 أعلاه. وكانت أهداف وشارك في المستجيبات مثقف لمدة 16 ساعة. ويتم احتساب تحلل في المئة محددة كما هو موضح في الخطوة 3.11 أعلاه.
2. وتعرض اثنين من ممثل (الإيجابية والسلبية) نتائج تي خلية بوساطة خلايا بيتا تبديد غشاء الميتوكوندريا المحتملة. الخلايا الملون وتسجل ردود فعل كما هو موضح في الخطوتين 4 و 5 و 6 أعلاه ، يتم إنشاء ملفات الفيديو كما في الخطوة 7. الفيديو 1 : كانت ملطخة الخلية بيتا خط الماوس NIT - 1 إمكانات غشاء الميتوكوندريا صبغ TMRM (الأحمر). المنشط ، وautoreactive CD8 ⁺ T AI4 الخلية (الخضراء ملطخة Picogreen) المشارك مع هذه الخلايا المستزرعة NIT 1 في بريدا : نسبة T من 50:1. NIT - 1 المحتملة غشاء الميتوكوندريا تتبدد تدريجيا خلال مدة 400 دقيقة ، ولكن فقط في المجموعات التي كانت تتفاعل مع الخلايا التائية AI4 الفيديو 2 : التحكم وتجربة ، NIT - 1 تم صبغ الخلايا مع TMRM وشارك في تربيتها مع الخلايا Picogreen Jurkat الملون في بريدا : نسبة T من 50:1. Jurkat الخلايا هي الخلايا التائية الإنسان هو الخط الذي MHC متطابقة. حافظت NIT - 1 خلايا غشاء الميتوكوندريا المحتملة في جميع أنحاء كامل مدة 400 دقائق شارك في فترة الحضانة. لم الخلايا Jurkat لا تتفاعل مع كتل NIT - 1 ، وبالتالي ، لا تحفز القتل.

الشكل 1 نتيجة ممثل CML باستخدام الخلايا المستهدفة والجزر المعزولة من الابتدائي العوز المناعي NOD.Rag1 - / -- الفئران وsplenocytes من الفئران المعدلة وراثيا NOD.AI4α / β. وكانت أهداف وشارك في المستجيبات مثقف لمدة 16 ساعة. تحلل في المئة زيادات محددة مثل المستجيب : زيادة نسبة الهدف.

وكان الفيديو الملون بيتا الماوس 1. خط الخلية NIT - 1 غشاء الميتوكوندريا المحتملة صبغة TMRM (الأحمر). تنشيط autoreactive CD8 ⁺ T وكانت الخلية AI4 (أخضر ملطخة Picogreen) شارك في تربيتها مع هذه الخلايا NIT - 1 في E : T من نسبة 50:1. NIT - 1 المحتملة غشاء الميتوكوندريا dissipaتيد تدريجيا خلال مدة 400 دقيقة ، ولكن فقط في المجموعات التي كانت تتفاعل مع الخلايا T AI4 الخضراء. انقر هنا لمشاهدة الفيديو .

الفيديو 2. كانت ملطخة NIT - 1 الخلايا نفسها كما هو موضح في الفيديو (1) وشارك في تربيتها مع الملون Picogreen Jurkat T خط الخلية البشرية. وNIT - 1 الخلايا قادرة على الحفاظ على غشاء الميتوكوندريا المحتملة مدروسة لمدة 400 دقيقة. لم الخلايا Jurkat لا تتفاعل مع كتل NIT - 1 ، وبالتالي لا لحث على القتل. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .

Discussion

السامة للخلايا T في خلايا بيتا بوساطة الموت هو الفيزيولوجيا المرضية الرئيسية للT1D ^5. المقايسات CML باستخدام الكروم اطلاق سراح ⁵¹ تسمح لنا دراسة درجة المستجيب المستهدفة استجابة ^6. ومع ذلك ، لا تزال عملية مفصلة والممرات من الخلايا T التي تتوسط بيتا موت الخ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات (اختياري)
CR - 51	بيركن إلمر	NEZ030500IMC
PBS	Cellgro	21-040-60
ميثيل استر الميثيل رودامين (TMRM)	Invitrogen	T668
Picogreen	Invitrogen	P7581
AI4 mimotope	mimotopes.com	تسلسل الأحماض الأمينية : YFIENYLEL
IL - 2	R & D	485 - MI
DMEM	Invitrogen	11885
FBS	HyClone	SH30071.03
الأبقار مصل الزلال	سيغما	A8412
HEPES	Cellgro	25-060 - CL
MEM غير الأحماض الأمينية الأساسية	GIBCO	11140
البنسلين / الستربتوميسين	الجوزاء	400-109
الفينول الحمراء الخالية DMEM	سيغما	D5303
CO2 حاضنة	الحرارية فيشر	HeraCell 150i	أبقى العقيمة للثقافة الخلية
السلامة البيولوجية لمجلس الوزراء	الحرارية فيشر	تقديرية 1440
ثقافة أنابيب القابل للتصرف ، 6x50 زجاج الجير ملم	الصياد	14-958 - A
مكافحة غاما	بيركن إلمر	المعالج 1470 عداد غاما التلقائية
مبائر المجهر	زايس	LSM 510 ميتا متحد البؤر	مع مرحلة بمحركات والعيش غرفة الخلية
ماصة (1ml ، 200μl ، 20μl ، 10μl ، 2μl)	إيبندورف
أنابيب (العنبر)	الصياد	50819772
الطرد المركزي	Sorvall الأيقونات RT +	75004377
عدادة الكريات	فيشر العلمية	267110
تستقيم مجهر	زايس	Axioskop40
NOD.Cg - Rag1 tm1Mom تيراغرام (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ الفئران	مختبر جاكسون	004347
NOD.Cg - Rag1 tm1Mom تيراغرام (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ الفئران	مختبر جاكسون	004348
NOD - AI4α / الفئران F1 β	N / A	N / A	الحيوانات المرباة في منشأة UF