Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Resumen

Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.

Resumen

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad mediada por células T autoinmunes. Durante la patogénesis, los pacientes se vuelven cada vez más insulinopenia como la producción de insulina se pierde, probablemente esto se debe a la destrucción de las células beta del páncreas por las células T. Comprensión de los mecanismos de la muerte de las células beta en el desarrollo de DT1 proporcionará información para generar una cura efectiva para esta enfermedad. Mediada por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se han utilizado históricamente el radionúclido cromo 51 ⁽⁵¹ Cr) para etiquetar las células diana. Estos objetivos se exponen a las células efectoras y la liberación de ⁵¹ Cr de las células diana se lee como una indicación de la muerte celular mediada por linfocitos. Los inhibidores de la consecuencia de muerte celular en menor liberación de ⁵¹ Cr.

Como células efectoras, se utilizó una población activa autorreactivos clonal de las células CD8 ⁺ linfocitos T citotóxicos (CTL) aislado de un ratón transgénico de valores, tanto para las cadenas alfa y beta del receptor de la célula AI4 T (TCR). Activa las células T AI4 fueron co-cultivadas con ⁵¹ Cr células diana marcadas NIT durante 16 horas, la liberación de ⁵¹ Cr se registró para el cálculo de lisis específica

Las mitocondrias participar en importantes eventos fisiológicos, tales como la producción de energía, la regulación de la transducción de señales, y la apoptosis. El estudio de las células beta mitocondrial cambios funcionales durante el desarrollo de DT1 es una nueva área de investigación. Utilizando el potencial de membrana mitocondrial colorante tetrametil rodamina éster metílico (TMRM) y confocal de imágenes microscópicas de células vivas, que supervisó el potencial de membrana mitocondrial en el tiempo en la línea de células beta NIT-1. Para los estudios de imagen, las células T efectoras AI4 fueron marcadas con el colorante fluorescente tinción nuclear Picogreen. NIT-1 en las células y las células T fueron co-cultivadas en cubreobjetos y cámaras montadas en la platina del microscopio equipado con una cámara de células vivas, controlada a 37 ° C, con 5% de CO _2, y húmedo. Durante estos experimentos se tomaron imágenes de cada grupo cada 3 minutos durante 400 minutos.

Más de un curso de 400 minutos, se observó la disipación del potencial de membrana mitocondrial en NIT-1, donde grupos de células AI4 las células T se adjunta. En el experimento de control simultáneo donde NIT-1 células fueron co-cultivadas con MHC mal emparejado las células Jurkat de linfocitos, el potencial de membrana mitocondrial se mantuvo intacta. Esta técnica se puede utilizar para observar en tiempo real los cambios en el potencial de membrana mitocondrial en las células bajo el ataque de los linfocitos citotóxicos, citocinas u otros reactivos citotóxicos.

Protocolo

1. Preparación de las células

1. Objetivo el cultivo de células: la cultura de las líneas celulares de ratón beta, NIT-1 y NIT-4, fue de ^1,2 se ha descrito anteriormente en DMEM suplementado con FBS al 10%, 0,02% de BSA, no de aminoácidos esenciales, 15 mM HEPES, 16,5 mm Glocose y penicilina / estreptomicina. El ⁵¹ Cr etiquetado, las células de las semillas en un fondo plano de 96 pocillos placa de cultivo de 5x10 ⁴ células / pocillo en 200 l medio de cultivo. Para los experimentos de microscopía, las células de las semillas en un 8 y Lab-Tak cubreobjetos II de cámara en cámara de 5x10 ⁴ por 500 en el medio de cultivo l, y dejar crecer durante 48 horas antes de usar en los experimentos de citotoxicidad.
2. El control de las células T cultura línea: Utilice la línea celular Jurkat (ATCC, CD3 ⁺ línea celular humana de linfocitos) como control negativo. Cultivo de células Jurkat en RPMI1640 complementado con 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 10 mM HEPES y 1,0 mM piruvato de sodio.

2. Recolección y la activación de efectores autorreactivos células T CD8 ⁺

NOD.Cg-Rag1 ^tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] y NOD.Cg-Rag1 ^tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] fueron adquiridos de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y criados en nuestras instalaciones de ratón. Progenie híbrida F1 de cruces de NOD-AI4a con NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] desarrollar diabetes en 3-5 semanas de edad. Todos los ratones fueron alojados en libres de patógenos específicos y aprobados por las instalaciones de Cuidado de Animales de la institución en cuestión y el empleo.

1. 3-4 semanas de edad, la eutanasia AI4a NOD-/ b ratones utilizando CO _2.
2. Recoger el bazo de los ratones. Los ratones sacrificados se preparan con spray de etanol y se abrió bajo el capó quirúrgica. Bazos se quitan y se ponen en helado buffer HBSS inmediatamente.
3. Recoger las células del bazo con un homogeneizador de vidrio de 7 ml. De dos a tres bazos cada uno se puso en 5 ml de HBSS frío y homogeneizados con un homogeneizador de 7 ml de vidrio. Homogeneizado se recoge y se centrifuga a 1200rpm durante 5 minutos a 4 ° C utilizando una centrifugadora Sorvall RT7 ^+. Gránulos de las células se recogen.
4. Eliminar las células rojas de la sangre mediante un tratamiento con una solución hipotónica. Los pellets son tratados con 5 ml de solución hipotónica / bazo en hielo durante 5 minutos, luego se neutraliza mediante la adición de un volumen igual de HBSS. Recoger las células por centrifugación, como el anterior, y resuspender en 50 ml de HBSS. Pase la suspensión de células a través de células colador y contar con un hemocitómetro con tinción TrypanBlue.
5. Activar las células. Resuspender las células en 5x10 ⁶ / ml y activar mediante un cultivo de 3 días con 0,1 M AI4 mimotopo (YFIENYLEL secuencia de aminoácidos) y 25 U / mL de IL-2 en RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 10 mM HEPES y 1,0 mM piruvato de sodio.

3. Ensayo de liberación de ⁵¹ Cr para examinar CML

1. Células etiqueta de destino: Agregar ⁵¹ Cr a las células diana en un Ci / pocillo y la cultura durante 3 horas, y lavar 3 veces con medio de cultivo.
2. Suspender las células efectoras en medio RPMI 1640 como se mencionó en el paso 2.5 para que el volumen final a cada pocillo es de 200 l.
3. Después del último lavado de las células diana marcada, añada activar las células efectoras de las culturas de las células diana a efector deseado al objetivo (E: T) ratios. Por lo general, el uso E: T ratios de 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 y 50:1.
4. Añadir nuevo modificado RPMI 1640 (véase el paso 2.5) a 6 pozos de las células diana para actuar como un control de lisis espontánea.
5. Co-cultivo las células efectoras y diana durante 16 horas.
6. Recoger el líquido sobrenadante en tubos de 6x50 mm de vidrio de cal
7. Lisis de las células mediante la adición de 100μl 2% de SDS y pipetear varias veces con suavidad.
8. Recoger lisado celular en otro juego de tubos de vidrio 6x50 mm de cal.
9. Lavar una vez con la limpieza de pozos H ₂ O y añadir el lavado de las trompas de lisado celular.
10. Contar con los sobrenadantes y lisados ​​de células utilizando un contador gamma.
11. Calcular lisis específica de la siguiente manera:
    

4. Tinción de las células de imágenes de células vivas

Entre los más utilizados potencial de membrana mitocondrial colorantes, TMRM exhibe la menor toxicidad mitocondrial. ³ Por lo tanto, elegimos TMRM para estos estudios de imágenes de células vivas.

1. Prepare una solución de 40 mM de TMRM en DMSO y almacenar a -20 ° C. Haga un [25 nM] solución de trabajo fresca en rojo fenol libre de DMEM con todos los suplementos de NIT-1 cultivo celular ^1.
2. Mancha objetivo NIT-1 con células TMRM 25 nM durante 30 minutos a 37 ° C.
3. Vuelva a colocar los medios de comunicación con los medios de comunicación fresco que contiene 5 nM TMRM para mantener el equilibrio de distribución del colorante ^4.
4. Conde activa las células T efectoras AI4 utilizando un hematocitómetro.
5. Mancha activa las células T efectoras AI4 con 1 l / mL para Picogreen5 minutos a temperatura ambiente y lavar con rojo fenol libre de medio de cultivo 3 veces.

5. La evaluación de los linfocitos T mediada por la muerte de las células beta usando imágenes de células vivas

1. Monte la cámara cubre objetos con células NIT manchado en el escenario de un Zeiss LSM 510 microscopio confocal. Retire la lengüeta con una dremmel y gas esterilizar el vidrio con óxido de cámaras Etheline. El escenario está equipado con una cámara de imágenes de células vivas, que tiene la temperatura controlada a 37 ° C y 5% de CO ₂ con la humedad.
2. Añadir activa y se tiñeron las células T a las cámaras designadas en diferentes E: T ratios.
3. Añadido el mismo número de células Jurkat manchado a las cámaras de control.

6. La obtención de imágenes de células vivas

El microscopio está equipado con una platina motorizada que nos permite adquirir imágenes en repetidas ocasiones en diferentes lugares de las cámaras de iguales o diferentes de forma automática en el transcurso del experimento.

1. El uso de un lente de 63x de aceite objetivo, capturar imágenes a intervalos de cada 3 minutos para un total de 300 cuadros por ubicación.
2. Detectar manchas TMRM con una longitud de onda de excitación de 543 nm y el conjunto de filtros para la emisión de 565-619 nm
3. Detectar manchas Picogreen con una excitación de 488 nm y un conjunto de filtros para la emisión de 500-630 nm. El video fue creado usando el software Zeiss LSM.

7. De conversión de vídeo para su publicación

1. Usando el software LSM Zeiss, crear un archivo de película sin comprimir en formato AVI.
2. Para convertir el vídeo en el formato de publicación, importar el vídeo en el paquete de software FIJI ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), un ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / ) la distribución, usando el plugin Bioformats de loci ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
3. Ajustar la configuración del brillo y el contraste para equilibrar las señales de color verde y rojo y la velocidad de fotogramas se establece en 2 fotogramas / segundo utilizando el menú de opciones de animación.
4. Recortar el vídeo a 512 x 512 píxeles y la exportación como un archivo AVI sin comprimir.
5. Abrir el archivo AVI en el software Quicktime 7 (ordenador de Apple, Cupertino, CA) y comprimir y exportar en el formato de archivo de vídeo abierto H264/MPEG-4 a 1200 kbs / segundo.

8. Los resultados representativos:

1. Un resultado representativo de ₅₁ Cr ensayo de LMC. La figura 1 muestra un resultado representativo de un ensayo de LMC en la lisis por ciento específica (eje Y) aumenta a medida que el efector: relación de destino (eje X) se incrementa. Las células diana son islotes aislados de primaria inmunodeficientes NOD Rag1-/ -. Ratones y etiquetados con ⁵¹ Cr. Esplenocitos de ratones transgénicos NOD.AI4α / β son aislados y se activa como se describe en el paso 2. Las metas y los efectores fueron co-cultivadas durante 16 horas. Lisis por ciento determinado se calcula como se describe en el paso por encima de 3,11.
2. Dos representantes (positivo y negativo) los resultados de una mediada por células T disipación de las células beta del potencial de membrana mitocondrial se presentan. Las células se tiñen y las reacciones se registran como se describe en los pasos 4, 5 y 6, los archivos de vídeo se crean como en el paso 7. Video 1: La versión beta del ratón línea celular NIT-1 se tiñó el potencial de membrana mitocondrial tinte TMRM (rojo). Activado, autorreactivos células T CD8 ⁺ AI4 (teñido de verde con Picogreen) fueron co-cultivadas con estas NIT-1 en las células en un E: T relación de 50:1. NIT-1 potencial de membrana mitocondrial se disipa poco a poco durante una duración de 400 minutos, pero sólo en los grupos que se interactúa con las células T AI4. Video 2: Como un experimento de control, NIT-1 células se tiñeron con TMRM y co-cultivadas con células Jurkat Picogreen manchada en un E: T relación de 50:1. Células Jurkat es un ser humano línea de células T que es MHC no coincidentes. NIT-1 células mantiene el potencial de membrana mitocondrial durante toda la duración de los 400 minutos de co-período de incubación. Células Jurkat no interactúan con NIT-1 clusters y por lo tanto, no provocar el asesinato.

Figura 1 resultado Representante de la LMC utilizando como células isletas objetivo principal aislado de inmunodeficiencia NOD.Rag1-/ -. Ratones y esplenocitos de ratones transgénicos NOD.AI4α / β. Las metas y los efectores fueron co-cultivadas durante 16 horas. Lisis porcentaje específico aumenta a medida que la unidad de efectos: aumenta la proporción de destino.

Video 1. Beta ratón línea celular NIT-1 se tiñó el potencial de membrana mitocondrial TMRM colorante (rojo). Activado autorreactivos células T CD8 ⁺ AI4 (teñido de verde con Picogreen) fueron co-cultivadas con estas NIT-1 células en E: T relación de 50:1. NIT-1 membrana mitocondrial potencial de disipaciónTed gradualmente durante un período de 400 minutos, pero sólo en los grupos que se interactúa con las células T AI4 verde. Haga clic aquí para ver el video .

Video 2. NIT-1 las células se tiñeron mismo que se describe en el video 1 y co-cultivadas con Picogreen manchada Jurkat línea de células T humanas. NIT-1 células fueron capaces de mantener el potencial de membrana mitocondrial pensado la duración de 400 minutos. Células Jurkat no interactúan con NIT-1 clusters y por lo tanto no inducen muerte. Haga clic aquí para ver el video .

Discusión

Células T citotóxicas mediadas por muerte de las células beta es la fisiopatología principal de DT1 ^5. Ensayos de CML con ⁵¹ Cr liberación nos permite estudiar el grado de respuesta del efector objetivo ^6. Sin embargo, el proceso detallado y las vías de las células T mediada por la muerte de las células beta aún no está totalmente entendido. Dado que las mitocondrias son esenciales para la función celular beta y la muerte de ^siete, nos hemos centrado en cambios en l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
CR-51	Perkin Elmer	NEZ030500IMC
PBS	Cellgro	21-040-60
Tetrametil rodamina éster metílico (TMRM)	Invitrogen	T668
Picogreen	Invitrogen	P7581
AI4 mimotopo	mimotopes.com	secuencia de aminoácidos: YFIENYLEL
IL-2	I + D	485-MI
DMEM	Invitrogen	11885
FBS	HyClone	SH30071.03
Albúmina de suero bovino	Sigma	A8412
HEPES	Cellgro	25-060-Cl
MEM no aminoácidos esenciales	GIBCO	11140
Penicilina / estreptomicina	Géminis	400-109
Rojo fenol libre de DMEM	Sigma	D5303
Incubadora de CO2	Thermo Fisher	HeraCell 150i	Mantenerse estéril para el cultivo celular
Cabina de seguridad biológica	Thermo Fisher	Forma 1440
Tubos desechables cultura, 6x50 mm de vidrio de cal	Pescador	14 a 958-A
Gamma Contador	Perkin Elmer	Asistente de contador automático de Gamma 1470
Microscopio confocal	Zeiss	LSM 510 Meta Confocal	Con platina motorizada y una cámara de células vivas
Pipeta (1 ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl)	Eppendorf
Tubos (ámbar)	Pescador	50819772
Centrífugo	Sorvall Legend RT +	75004377
Hemocitómetro	Fisher Scientific	267110
Microscopio vertical	Zeiss	Axioskop40
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ ratones	El Laboratorio Jackson	004347
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ ratones	El Laboratorio Jackson	004348
NOD-AI4α / ratones F1 β	N / A	N / A	Criados en instalaciones para animales UF