الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Summary

نحن تصف طريقة لعملية وشاشة الميدانية التي تم جمعها. البعوض لمجموعة متنوعة من الفيروسات من خلال فحص خلايا فيرو الثقافة من خلال استخدام هذه التقنية ، وقد اكتشفنا 9 فيروسات مختلفة من الأسر التصنيفية 4 في البعوض التي تم جمعها في ولاية كونيتيكت.

Abstract

أنواع البعوض أن تنقل عددا من الفيروسات متميزة بما في ذلك مسببات الأمراض البشرية الهامة مثل فيروس غرب النيل ، وفيروس حمى الضنك ، وفيروس chickungunya. وقد كثفت العديد من هذه الفيروسات في نطاقاتها المتوطنة وتوسيعها لمناطق جديدة ، مما يستدعي المراقبة والسيطرة الفعالة برامج للرد على هذه التهديدات. استراتيجية واحدة لمراقبة نشاط فيروس ينطوي على جمع أعداد كبيرة من البعوض من المواقع الموبوءة واختبارها للعدوى الفيروسية. في هذه المقالة ، ونحن تصف كيفية التعامل معها ، والعملية ، والشاشة التي تم جمعها ميدانيا البعوض عن الفيروسات المعدية التي فيرو الخلية مقايسة الثقافة. يتم فرز حسب الموقع البعوض وأنواع الشرك ، وتجميعها في أحواض تحتوي على ≤ 50 فردا. والمتجانس العينات المجمعة مخزنة في المياه المالحة باستخدام خلاط ، مطحنة ، وتحصين المرحلة المائية متكدسة على الثقافات الخلية فيرو (استنساخ E6). ويتم رصد مزارع الخلايا لتأثير الاعتلال الخلوي من الأيام المحددة 3-7 بعد التلقيح وأي فيروسات نمت في الثقافة الخلية المقايسات التشخيصية المناسبة. باستخدام هذا النهج ، ونحن عزل 9 فيروسات مختلفة من البعوض التي تم جمعها في ولاية كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وبين هؤلاء ، ومن المعروف أن تسبب المرض 5 الإنسان. ثلاثة من هذه الفيروسات (فيروس غرب النيل ، وفيروس بوتوسي ، ولوس انجليس لفيروس كروس) تمثل سجلات جديدة لأمريكا الشمالية أو منطقة نيو إنجلاند منذ عام 1999. القدرة على الكشف عن تنوع واسع من الفيروسات أمر بالغ الأهمية لرصد كل من أنشأ والفيروسات الناشئة حديثا في أسراب البعوض.

Protocol

1. الفرز وتحديد البعوض

1. يتم تنفيذ الإجراءات التالية على مقاعد البدلاء في مختبر مفتوح مخصص للسلامة الأحيائية من المستوى 2 المختبرات (BSL - 2) من قبل الموظفين الذين تم تدريبهم للعمل مع البعوض تعيش. ويحتفظ "سلسلة التبريد" في جميع أنحاء الداخلي.
2. تخدير يعيش البعوض البالغ البعوض عن طريق وضع كيس جمع في الثلاجة ° -20 لمدة 5 دقائق. نقل حقيبة جمع إلى حاوية تحتوي على الثلج الجاف المعزولة. إغلاق الغطاء وفضح البعوض إلى ثاني أكسيد الكربون عن 1-3 دقائق لضمان استكمال تدق إلى أسفل.
3. اضغط على البعوض تخدير مقلاة المبردة قبل وضعها على سرير من الثلج الجاف. إناث البعوض منفصلة الفردية باستخدام ملقط وغرامة مكان في أكواب جزء من البلاستيك. مع تغطية غطاء الكؤوس ومكان على الجليد الرطب.
4. شنت التعرف على أنواع البعوض باستخدام مفاتيح التصنيف الوصفي على أساس مورفولوجيا البعوض الخارجية بمساعدة مجهر تشريح ستيريو (10 - 60X تكبير) على جدول البرد الإلكترونية.
5. الجمع بين أنواع البعوض التي تم تحديدها في برك من الأفراد في 50 ≤ 2 قارورة الإضافية سقف مل تحتوي على أكواد النحاس. وصفت قنينات مع معرف فريد.
6. بعد التعرف على كل أنواع البعوض ، توضع في أكياس عبوة وصفت والذي عقد في برودة الستايروفوم تحتوي على الثلج الجاف.
7. برك تخزين البعوض في الثلاجة حتى -80 درجة مئوية اختبار الفيروس.

2. اعتبارات السلامة الأحيائية لعزل الفيروس من البعوض

1. يتم تنفيذ الإجراءات التالية في مستوى السلامة الحيوية في المختبرات - 3 (BSL - 3) من قبل الموظفين الذين تم تدريبهم للعمل في هذا المستوى من الاحتواء ^1. مرافق المختبرات والمعدات والإجراءات والممارسات وتخضع لرقابة المؤسسات ، والدولة ، والحكومة الفدرالية والتفتيش. يسعى التدريب المناسب والموافقة عليها قبل محاولة البروتوكولات التالية.
2. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) لكل إجراء مثل العباءات القابل للتصرف ، والقفازات ، ودروع لحماية الوجه ، وأجهزة التنفس.
3. تطهير أسطح العمل مع الكحول 70 ٪ قبل وبعد استكمال الإجراءات.
4. يتم التعامل مع الثقافات الخلية والمواد التي قد تكون معدية في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية (BSC).
5. والمتجانس تجمعات البعوض في طاحونة خلاط التي يتم وضعها داخل ش.
6. وطرد البعوض الخليط في الهباء microcentrifuge محكم. إذا لا يمكن أن يتم تنفيذ هذا الإجراء ضمن BSC ، يجب على المشغل ارتداء جهاز تنفس صناعي عند التشغيل واسترداد عينات من أجهزة الطرد المركزي.
7. هي غارقة Pipets ومناولة المواد الماصة نصائح في BSC (السلامة مجلس الوزراء) في المبيض بنسبة 10 ٪ قبل التعقيم. هو تطهير جميع النفايات بواسطة التعقيم المختبر قبل التخلص منها.

3. إعداد خلايا فيرو

1. صب سائل الإعلام من ثقافة واحدة كبيرة الأنسجة قارورة ثقافة (175 سم ²⁾ من خلايا فيرو متموجة (استنساخ E6) في دورق النفايات المحتوية على مواد التبييض.
2. غسل خلايا فيرو بإضافة قسامة 5 مل من خلال برنامج تلفزيوني ودوامة طبقة من الخلايا وعلى طول جانبي قارورة التأكد من تغطية شاملة أحادي الطبقة بأكملها.
3. صب برنامج تلفزيوني في دورق النفايات.
4. إضافة 2.5 مل من التربسين - EDTA ودوامة أكثر من طبقة من الخلايا مع التأكد من تغطية شاملة أحادي الطبقة بأكملها.
5. احتضان القارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2.
6. يهز بلطف وقارورة دوامة لإزالة الخلايا السطحية من القاع. وينبغي أن الخلايا الشريحة قبالة بسهولة ؛ احتضان إضافي 1-5 دقائق إذا الخلايا لا تنزلق بسهولة.
7. إضافة 5 مل من وسائل الإعلام الأساسية الدنيا (MEM) ، و 5 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، وذلك باستخدام الماصة المصلية والماصة حتى ونزولا 1-20 مرات لتفريق كتل من الخلايا.
8. إضافة 15 مل MEM إضافية ، و 5 ٪ عن حجم FBS الاجمالية 22.5 مل وتخلط جيدا.
9. 40 مكان زراعة الأنسجة الصغيرة قوارير (25 سم ²⁾ في اثنين من الرفوف تستقيم (20 قوارير / الرف).
10. وضع رفوف تحتوي على قوارير داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وإزالة قبعات القارورة ، ووضع القبعات مباشرة أمام القوارير.
11. الاستغناء عن 4 مل من MEM ، FBS 5 ٪ في كل قارورة باستخدام الماصة المصلية.
12. الاستغناء عن 0.5 مل الخلايا علقت في كل قارورة (~ تقسيم نسبة 1:6) استبدال قبعات القارورة.
13. إضافة 50 مل من MEM ، 5 ٪ FBS العودة إلى الأصل قارورة كبيرة نسيج الثقافة التي تحتوي على خلية تعليق المتبقية (~ 2،5 ملل) والعودة إلى الحاضنة القارورة. قد تكون هي نفسها زراعة الأنسجة دورق كبير إعادة استخدام ما يصل الى 5 الممرات ثم قارورة الجديدة يجب ان تكون انشاء ليحل محله.
14. ثقافة مكان في قوارير صغيرة الأنسجة كدسات على الدرج. دوامة الدرج للتأكد من أن وسائل الإعلام بشكل موحد يغطي الجزء السفلي من flaks.
15. مكان قوارير صغيرة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ ₍₂₎ وتنمو بين عشية وضحاها حتى متموجة 80-90 ٪.

4. إعداد تجمعات البعوض

1. إبقاء تجمعات البعوض الباردة خلال إجراءات الاختبار. قبل استخدام المبردرفوف الثلاجة والمسجلات وخالط طاحونة والكواشف الجليد الباردة ، وأجهزة الطرد المركزي المبردة عند معالجة تجمعات البعوض.
2. مكان الأنابيب التي تحتوي على البعوض الحامل في الثلاجة قبل المبردة وإضافة 1 -- على كل من البعوض أنبوب 1.5 مل PBS - G.
3. استرداد خلاط طاحونة شرائط من الفريزر. 24 مكان الأنابيب في كل كاسيت ثم أمنا في طاحونة خلاط.
4. التجانس العينات لمدة 4 دقائق في 25 دورة / ثانية. الطاحونة خلاط يهز أنابيب في سرعة عالية وBB المعدنية داخل أنبوب يعطل كل الأنسجة البعوض.
5. أنابيب الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 7000 دورة في الدقيقة.
6. أنابيب المكان مرة أخرى إلى رفوف الثلاجة حتى تلقيح في خلايا فيرو.

5. تلقيح خلايا فيرو مع الخليط تجمع البعوض

1. الاختيار واحد على الأقل قارورة زراعة الأنسجة من كل مجموعة تحت المجهر المقلوب أن أؤكد الصحية الملائمة confluency والخلية ، ونتوقع تغطية حوالي 80-90 ٪.
2. يصطف 20 قوارير صغيرة زراعة الأنسجة في رفوف وقوارير التسمية مع انضمام أعداد مماثلة من كل تجمع البعوض.
3. القبعات وتخفيف صب معظم وسائل الإعلام من قوارير زراعة الأنسجة في دورق النفايات. ترك ما يكفي من وسائل الاعلام في القارورة إلى معطف تماما المونولاير الخلية.
4. 100μL قسامة من طاف من كل تجمع البعوض المصنعة في نسيج الثقافة قارورة المقابلة.
5. استبدال ثقافة وتشديد غطاء القارورة.
6. إرساء ثقافة مسطحة على قوارير شاكر لمدة 5 دقائق (درجة حرارة الغرفة) في 35-40 دورة في الدقيقة.
7. عودة 20 قوارير زراعة الأنسجة لموقف تستقيم في رفوف ومكانته في ش.
8. Uncapping 3 قوارير زراعة الأنسجة في وقت واحد ، 4 وسائط النمو الاستغناء مل في كل قارورة باستخدام ماصة المصلية ؛ استبدال القبعات.
9. تأكد من أن الطرف ماصة لا اتصال الرقبة قارورة الثقافة أو الشفة. تغيير نصائح ماصة عند الضرورة إذا تم الاتصال مع القارورة.
10. احتضان قوارير زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2.

6. فحص خلايا فيرو للنمو الفيروس

1. الشاشة تلقيح قوارير زراعة الأنسجة لعلامات العدوى الفيروسية ، وتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) ، 3-7 أيام بعد التلقيح.
2. تفقد البصر الثقافات الخلية و / أو التلوث بواسطة CPE إمالة القوارير وفحص وسائل الاعلام ان تجمعات في الجزء السفلي من القارورة. وسوف تظهر وسائل الإعلام وغائما الخلايا التدهور خلال CPE أو نتيجة لنمو الخميرة والفطريات ، أو التلوث الجرثومي.
3. إعادة النظر في الثقافات الخلية الذي يحمل وسائل الإعلام غائم تحت مجهر مقلوب. والفيروسات التي تسبب الخلايا لتصبح مشوهة ، وسوف كسر فضفاضة من قوارير الثقافة. والثقافات الخلية مع الملوثات مرئية ، مثل الخميرة ، والبكتيريا الأخرى ، والفطريات أو الثقيلة الحطام البعوض ، وإعادة اختباره من قبل تمرير تجمع البعوض الأصلي من خلال مرشح 0.22μM المحاقن.
4. الاستغناء عن جو معقم و مطهر 1-2 تراخيص وسائل الإعلام من الفيروسات الإيجابية في الثقافات الخلية المسمى cryotubes باستخدام ماصة المصلية.
5. يتم تخزين الثقافات الفيروس في -80 درجة مئوية حتى تحديدها باستخدام فحوصات التشخيص المناسب.

7. إعداد الكواشف

1. م ، 5 ٪ FBS. حل 37،6 غراما من مسحوق MEM في الحجم النهائي من 4 لتر ​​من H ₂ 0 د. الحل في الاستغناء عن 500 مل aliquots في زجاجات وسائل الإعلام والأوتوكلاف. عندما حل قد بردت ، إضافة جو معقم و مطهر للحرارة 26 المعطل مل مصل بقري جنيني ، 5.2 مل L - الجلوتامين ، anti-biotic/mycotic 5.2 مل ، و 10.4 مل بيكربونات الصوديوم 7.5 ٪ على كل زجاجة. المحل في 4 درجات مئوية.
2. PBS - G. حل 16 ز كلوريد الصوديوم ، 0.4 غرام بوكل ، 2.3 ز نا ₂ هبو ₄ ، 0.4 غرام KH ₂ ص ₄ ، و 4 مل من الفينول الأحمر 0.5 ٪ إلى 1000 ه د مل ₂ 0. ضبط الرقم الهيدروجيني ل7،1-7،4 مع هيدروكسيد الصوديوم N 2 (إذا لزم الأمر). في دورق منفصل ، والحرارة 600 مل من H ₂ 0 ليغلي. إزالته من لوحة الساخنة ، إضافة 10 غرام الجيلاتين ، وتذوب. إضافة محلول الجيلاتين المذاب في حل برنامج تلفزيوني وضبط الحجم النهائي إلى 2 لتر مع ₂ د O. H الاستغناء عن 100 مليلتر من المحلول في زجاجات والأوتوكلاف. عندما حل قد بردت ، إضافة جو معقم و مطهر 42.8 مل مصل الأرنب الحرارة المعطل و 1.4 مل anti-biotic/mycotic. المحل في 4 درجات مئوية.
3. PBS الخلية يغسل. إضافة 50 مل 10X Dulbecco في برنامج تلفزيوني و 400 مل د O. ₂ H ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 مع هيدروكسيد الصوديوم N 2. ضبط الحجم النهائي الى 500 مل مع ₂ د O. H تصفية حل مع 0.2uM فراغ وحدة التصفية. في الاستغناء عن 5 مل aliquots في 8 الأنابيب الحلزونية سقف مل. المحل في 4 درجات مئوية.

8. ممثل النتائج

تم انتشال تسع مختلفة من الفيروسات من الأسر التصنيفية 4 من البعوض التي تم جمعها خلال المراقبة المستمرة على مستوى الولاية في ولاية كونيتيكت 1997-2010 (الجدول 1). عرف عن خمس من هذه الفيروسات تسبب الأمراض التي تصيب البشر ، ومسببات الأمراض أهمها فيروس غرب النيل وفيروس التهاب الدماغ الخيلي الشرقي. الاكتشافات الجديدة ما يلي : الأول من العزلة WNV من البعوض التي تم جمعها فيأمريكا الشمالية في عام 1999 ² ، وأول عزل فيروس بوتوسي في شمال شرق الولايات المتحدة في 2000 ⁽³⁾ ، وعزل الأول من الفيروس لا كروس في نيو انغلاند في 2005 ^4.

فيروس	عائلة	رقم يعزل	رقم المواقع	الكشف عن رقم سنة	مرض الإنسان	الحكام.
فيروس غرب النيل	الفيروسات المصفرة	1002	94	12	معتدلة إلى حادة والتهاب الدماغ والحمى	2،5
فيروس التهاب الدماغ الخيلي الشرقي	الفيروسات الطخائية	292	41	10	حادة والتهاب الدماغ	6،7
المرتفعات J الفيروس	الفيروسات الطخائية	178	39	11	لا يعرف	6
جيمستاون كانيون الفيروس	الفيروسات البنياوية	305	74	14	خفيفة الى معتدلة ، والحمى ، والتهاب السحايا	8
بوتوسي الفيروس	الفيروسات البنياوية	259	76	4	لا يعرف	3
ذاكرة التخزين المؤقت وادي الفيروس	الفيروسات البنياوية	114	51	8	معتدلة وحادة ، والمرض ، حمى العصبية في اثنين من الحالات الموثقة
Trivittatus الفيروس	الفيروسات البنياوية	83	21	11	لا يعرف
لا كروس الفيروس	الفيروسات البنياوية	1	1	1	معتدلة الى الدماغ ، وشدة	4
فلاندرز الفيروس	Rhabdoviridae	4	4	2	لا يعرف

الجدول 1. الكشف عن الفيروسات في الميدان البعوض التي جمعتها الخلية فيرو مقايسة الثقافة. وقد تم جمع البعوض خلال المراقبة على مستوى الولاية في ولاية كونيتيكت 1997-2010.

Discussion

فيرو مقايسة خلية ثقافة بمثابة وسيلة فعالة للبعوض الشاشة الميدانية التي تم جمعها لمجموعة متنوعة من الفيروسات. هذا يتناقض مع الأساليب الجزيئية التي تستهدف على وجه التحديد واحد أو عدد قليل من الفيروسات الفائدة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن فيرو مقايسة ثقافة الخلية بنفس الق...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف / المعدات	شركة	رقم كتالوج
مصل بقري جنيني	Gibco -- Invitrogen	16140
Anti-biotic/mycotic	Gibco -- Invitrogen	15240
بيكربونات الصوديوم NaHCO 3 ، Soln 7.5 ٪.	Gibco -- Invitrogen	25080
الجلوتامين L - 200MM 100X	Gibco - Invitrogen	25030
مسحوق الوسيلة الأساسية الدنيا (MEM)	Gibco -- Invitrogen	11700
10X Dulbecco في برنامج تلفزيوني	Gibco -- Invitrogen	14080
التربسين - EDTA	Gibco -- Invitrogen	15400
مصل الأرنب	Gibco -- Invitrogen	16120
خلايا فيرو (استنساخ E6)	ATCC	CRL - 1586
قوارير صغيرة زراعة الأنسجة ، والقبعات تنفيس ، 25 سم 2	الصقر -- بيكتون ديكنسون	353112
القوارير الكبيرة زراعة الأنسجة ، والقبعات تنفيس ، 175 سم 2	الصقر -- بيكتون ديكنسون	353108
النحاس المطلي BB لل، 4.5 ملم	Crosman	0767
الخلاط مطحنة	Retsch	MM300
رفوف الثلاجة Isopack	إيبندورف	022510240