Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Resumo

Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.

Resumo

Os mosquitos transmitem uma série de vírus diferentes, incluindo importantes patógenos humanos, tais como vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue eo vírus chickungunya. Muitos desses vírus se intensificaram nas suas gamas endêmicas e se expandiu para novos territórios, necessitando de programas eficazes de vigilância e controle para responder a essas ameaças. Uma estratégia para monitorar a atividade do vírus envolve a coleta de um grande número de mosquitos dos locais endêmicos e testá-las para a infecção viral. Neste artigo, descrevemos como lidar, processo e tela de campo coletados mosquitos de vírus infecciosos de células Vero por ensaio de cultura. Os mosquitos são classificadas por localização armadilha e espécies, e agrupados em pools contendo ≤ 50 indivíduos. Espécimes agrupados são homogeneizados em salina tamponada com um misturador-mill ea fase aquosa é inoculada em culturas de células Vero confluentes (Clone E6). Culturas de células são monitorados para efeito citopático do dia 07/03 pós-inoculação e qualquer vírus cresceu em cultura de células são identificadas pelos testes de diagnóstico apropriado. Ao utilizar esta abordagem, temos isolados 9 tipos diferentes de vírus a partir de mosquitos coletados em Connecticut, EUA, e entre estes, cinco são conhecidos por causar doenças no homem. Três destes vírus (vírus do Nilo Ocidental, vírus Potosi e La Crosse vírus) representam novos registros para a América do Norte ou da região da Nova Inglaterra desde 1999. A capacidade de detectar uma grande diversidade de vírus é fundamental para monitoramento ambos estabelecidos e vírus emergentes na população de mosquitos.

Protocolo

1. Triagem e identificação de mosquitos

1. Os seguintes procedimentos são realizados em uma bancada de laboratório aberto em uma dedicada biossegurança de nível 2 (BSL-2) por pessoal de laboratório que são treinados para trabalhar com os mosquitos vivos. A "cadeia de frio" é mantida durante todo o procedimento.
2. Anestesiar os mosquitos adultos vivem colocando bolsa coletora de mosquito em um freezer -20 ° por 5 minutos. Saco de transferência de coleção para um recipiente isolado contendo gelo seco. Feche a tampa e expor mosquitos para dióxido de carbono durante 1-3 minutos para garantir a completa knock-down.
3. Toque mosquitos anestesiados em uma panela pré-refrigerados colocado sobre uma cama de gelo seco. Individual separada mosquitos fêmeas usando uma pinça fina e coloque em copos de plástico. Cubra com tampa e coloque em copos de gelo molhado.
4. Identificar as espécies de mosquitos utilizando chaves taxonômicas descritiva com base na morfologia externa mosquito com o auxílio de um microscópio estéreo de dissecação (10-60X zoom) montado em uma mesa de frio eletrônica.
5. Combine identificou espécies de mosquito em piscinas de ≤ 50 indivíduos em 2 mL pressão cap-frascos contendo um BB de cobre. Frascos estão identificados com um identificador exclusivo.
6. Após a identificação de todos os mosquitos, os frascos são colocados em sacos etiquetados e mantidos em um refrigerador de isopor contendo gelo seco.
7. Loja pools de mosquitos em um freezer -80 ° C até que o teste do vírus.

2. Considerações de biossegurança para isolar vírus a partir de mosquitos

1. Os seguintes procedimentos são realizados em um nível de biossegurança 3 (NB-3) de laboratório por funcionários que são treinados para trabalhar com este nível de contenção de ^1. Laboratórios, equipamentos, procedimentos e práticas estão sujeitos à fiscalização institucional, estaduais e federais e de inspeção. Buscar a formação adequada e aprovação antes de tentar os seguintes protocolos.
2. Usar o equipamento de proteção individual (EPI) para cada procedimento, como batas descartáveis, luvas, protetores faciais, e respiradores.
3. Desinfetar superfícies de trabalho com álcool 70% antes e após os procedimentos de completar.
4. Culturas de células e materiais potencialmente infecciosos são tratados de Classe II biossegurança gabinete (BSC).
5. Pools de mosquitos são homogeneizadas em um misturador-mill que é colocado dentro de um BSC.
6. Homogeneizados de mosquito são centrifugadas em uma microcentrífuga anti-aerossol. Se este procedimento não pode ser realizada dentro de um BSC, o operador deve usar um respirador durante a operação e recuperação de amostras da centrífuga.
7. Pipetas e pontas de pipeta de manuseio de materiais no BSC (biossegurança gabinete) são embebidos em água sanitária a 10% antes da autoclavagem. Todos os resíduos de laboratório é descontaminados em autoclave antes do descarte.

3. Preparação de células Vero

1. Decantar meios de cultura de um grande frasco de cultura de tecidos (175 cm ²⁾ de células Vero confluentes (Clone E6) em copo resíduos contendo lixívia.
2. Lave as células Vero, adicionando uma alíquota de 5 mL de PBS e agite sobre a camada de células e ao longo dos lados do frasco certificando-se cobrir completamente monocamada inteiro.
3. Decantar PBS em copo de resíduos.
4. Adicionar 2,5 mL de tripsina-EDTA e agite sobre camada de células certificando-se cobrir completamente monocamada inteiro.
5. Incubar balão em incubadora por 5 minutos a 37 ° C CO, 5% _2.
6. Agitar suavemente e frasco agite para remover as células da superfície inferior. As células devem deslizar facilmente; incubar um adicional de 1-5 minutos se as células não são facilmente escorregar.
7. Adicionar 5 mL de Minimal Essential Media (MEM), 5% de soro fetal bovino (FBS), usando uma pipeta sorológica e pipeta up-and-down 10-20 vezes para quebrar os aglomerados de células.
8. Adicionar um adicional de 15 mL de MEM, 5% FBS para um volume total de 22,5 mL e misture bem.
9. Coloque 40 frascos pequenos cultura de tecidos (25 cm ²⁾ na vertical em dois racks (20 frascos / rack).
10. Coloque o racks contendo frascos dentro da cabine de segurança biológica e remover capacetes frasco, colocando tampas em frente dos frascos.
11. Dispense 4 mL de MEM, FBS 5% em cada frasco utilizando uma pipeta sorológica.
12. Dispense 0,5 mL células em suspensão em cada frasco (~ rácio divisão 1:6) Substitua as tampas frasco.
13. Adicionar 50 mL de MEM, 5% FBS de volta para o balão de grande cultura de tecidos de origem, contendo suspensão de células restantes (~ 2,5 ml) e retornar balão até a incubadora. O frasco mesma cultura grande tecido pode ser reutilizado até 5 passagens e, em seguida, um frasco deve ser novo set-up para substituí-lo.
14. Coloque pequenos frascos de cultura de tecidos em pilhas de bandeja. Redemoinho da bandeja para se certificar de que a mídia de maneira uniforme cobre o fundo do charlatões.
15. Coloque pequenos frascos na incubadora a 37 ° C CO, 5% ₂ e crescer durante a noite até confluentes 80-90%.

4. Preparação dos pools de mosquitos

1. Manter pools de mosquitos frio durante os procedimentos de teste. Use pré-refrigeradosracks freezer e liquidificador moinho de cassetes, gelada reagentes e uma centrífuga refrigerada durante o processamento de pools de mosquitos.
2. Colocar os tubos contendo os mosquitos em um rack freezer pré-refrigerados e adicionar 1-1,5 mL PBS-G para cada tubo de mosquitos.
3. Recuperar misturador moinho de cassetes do freezer. Coloque 24 tubos em cada cassete e depois segura no misturador-mill.
4. Homogeneizar as amostras durante 4 minutos a 25 ciclos / segundo. O moinho misturador sacode os tubos em alta velocidade e um BB de metal dentro de cada tubo rompe o tecido do mosquito.
5. Centrifugar os tubos por 6 minutos a 7.000 rpm.
6. Colocar os tubos de volta para racks freezer até inoculados em células Vero.

5. Inoculação de células Vero com homogenatos piscina mosquito

1. Verifique pelo menos um frasco de cultura de tecido de cada série em microscópio invertido para assegurar a saúde e confluência celular adequada; esperar cerca de 80-90% de cobertura.
2. Line up 20 frascos pequenos cultura de tecidos em um rack e frascos de etiquetas com números de adesão correspondente de cada grupo mosquito.
3. Solte as tampas e mais decantar dos meios de comunicação de frascos de cultura de tecidos em copo de resíduos. Deixe a mídia o suficiente no frasco completamente monocamada de células do revestimento.
4. 100μL alíquota do sobrenadante de cada grupo mosquito processados ​​para o balão correspondente cultura de tecidos.
5. Recolocar e apertar cap garrafa de cultura.
6. Lay frascos de cultura de apartamento no shaker por 5 minutos (temperatura ambiente) a 35-40 rpm.
7. Retorno de 20 frascos de cultura de tecidos para a posição vertical em um rack e coloque no BSC.
8. Desoperculação 3 frascos de cultura de tecido de uma só vez, dispensar quatro meios de crescimento mL em cada frasco utilizando uma pipeta sorológica, recoloque as tampas.
9. Certifique-se que a ponta da pipeta não contato com o gargalo do balão cultura ou lábio. Trocar a ponteira, se necessário, se o contato é feito com o frasco.
10. Frascos de cultura de tecidos incubar a 37 ° C, 5% CO _2.

6. Triagem células Vero para o crescimento do vírus

1. Tela inoculados frascos de cultura de tecidos para sinais de infecção viral, o efeito citopático (CPE), 3-7 dias após a inoculação.
2. Inspecionar visualmente culturas de células para CPE e / ou contaminação pela inclinação do frascos e examinar os meios de comunicação que reúne na parte inferior do balão. A mídia vai aparecer nublado como as células se deterioram durante o CPE ou devido ao crescimento de leveduras, fungos ou contaminação bacteriana.
3. Re-examinar culturas de células que exibem media nublado em microscópio invertido. Vírus fará com que as células se tornam deformadas e libertar-se dos frascos de cultura. Culturas de células com contaminantes visíveis, por exemplo, o fermento, outras bactérias, fungos ou detritos mosquito pesados, são re-testadas, passando a piscina mosquito original através de um filtro de seringa 0.22μM.
4. Assepticamente dispensar 1-2 mL de mídia a partir do vírus-positivos culturas de células em criotubos rotulados com uma pipeta sorológica.
5. Culturas de vírus são armazenadas a -80 ° C até identificados utilizando os ensaios de diagnóstico apropriado.

7. Preparação de reagentes

1. MEM, 5% FBS. Dissolver 37,6 g de MEM em pó em um volume final de 4 L de dd H ₂ 0. Dispense solução em 500 mL em frascos de alíquotas de mídia e autoclave. Quando a solução tiver arrefecido, adicionar assepticamente 26 inativado pelo calor mL de soro fetal bovino, 5,2 mL L-glutamina, 5,2 anti-biotic/mycotic mL, e 10,4 mL de bicarbonato de sódio 7,5% para cada garrafa. Armazenar a 4 ° C.
2. PBS-G. Dissolver 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na ₂ HPO _4, 0,4 g KH ₂ PO _4, e 4 mL de 0,5% Vermelho Fenol em 1000 mL dd H ₂ 0. Ajustar o pH a 7,1-7,4 com 2 N NaOH (se necessário). Num copo separado, o calor de 600 mL H ₂ 0 a ferver. Remover da placa-quente, adicione 10 g de gelatina, e dissolver. Adicione a gelatina dissolvida solução para a solução PBS e ajustar o volume final de 2 L com dd H ₂ O. Dispensar 100 mL de solução em garrafas e autoclave. Quando a solução tiver arrefecido, adicionar assepticamente 42,8 ml de soro de coelho inativado pelo calor e 1,4 anti-biotic/mycotic mL. Armazenar a 4 ° C.
3. PBS lavar celular. Adicionar 50 mL 10X Dulbecco PBS a 400 mL dd H ₂ O. Ajustar o pH para 7,1 com NaOH 2 N. Ajustar o volume final de 500 mL com dd H ₂ O. Solução de filtro com unidade de vácuo 0.2uM filtro. Dispense em 5 mL em alíquotas de 8 mL tampa de rosca tubos. Armazenar a 4 ° C.

8. Resultados representante

Nove diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas foram recuperados a partir de mosquitos coletados durante a vigilância contínua em todo o estado de Connecticut 1997-2010 (tabela 1). Cinco desses vírus são conhecidos por causar doenças no homem, os patógenos mais importantes que estão sendo vírus do Nilo Ocidental e Oriental, vírus da encefalite eqüina. Novas descobertas incluem: o primeiro isolamento do WNV a partir de mosquitos coletados emAmérica do Norte em 1999 ^2, o primeiro isolamento do vírus Potosi, no nordeste dos EUA em 2000 ^3, eo ​​primeiro isolamento do vírus La Crosse na Nova Inglaterra em 2005 ^4.

Vírus	Família	Não. isola	Locais No.	Não. ano detectado	Doença humana	Refs.
Vírus do Nilo Ocidental	Flaviviridae	1002	94	12	Moderada a grave, febre, encefalite	2,5
Oriental vírus da encefalite eqüina	Togaviridae	292	41	10	Encefalite, grave	6,7
Highlands J vírus	Togaviridae	178	39	11	Não conhecido	6
Jamestown Canyon vírus	Bunyaviridae	305	74	14	Leve a moderada, febre, meningite	8
Vírus Potosi	Bunyaviridae	259	76	4	Não conhecido	3
Cache Valley vírus	Bunyaviridae	114	51	8	Leve a grave, febre, doença neurológica em dois casos documentados
Trivittatus vírus	Bunyaviridae	83	21	11	Não conhecido
La Crosse vírus	Bunyaviridae	1	1	1	Moderada a encefalite, grave	4
Flanders vírus	Rhabdoviridae	4	4	2	Não conhecido

Vírus tabela 1. Detectado no campo de coleta de mosquitos por Vero ensaio de cultura de células. Os mosquitos foram coletados durante a vigilância em todo o estado de Connecticut 1997-2010.

Discussão

Vero ensaio de cultura celular serve como um método eficaz para mosquitos tela de campo recolhidas para uma diversidade de vírus. Isto contrasta com os métodos moleculares que atingem especificamente a um ou alguns vírus de interesse. Além disso, descobrimos que ensaio de cultura de células Vero é tão ou mais sensível do que a RT-PCR ⁷ e fornece-nos isolados do vírus que são armazenados em nossa coleção de referência para estudos futuros. No entanto, os sistemas de cultura de células pode não ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / equipamentos	Companhia	Número de catálogo
Soro fetal bovino	Gibco - Invitrogen	16140
Anti-biotic/mycotic	Gibco - Invitrogen	15240
De bicarbonato de sódio NaHCO 3, Soln 7,5%.	Gibco - Invitrogen	25080
L-Glutamine 200mM 100x	Gibco-Invitrogen	25030
Meio mínimo essencial em pó (MEM)	Gibco - Invitrogen	11700
10X Dulbecco PBS	Gibco - Invitrogen	14080
Tripsina-EDTA	Gibco - Invitrogen	15400
Soro de coelho	Gibco - Invitrogen	16120
Células Vero (Clone E6)	ATCC	CRL-1586
Frascos de cultura de tecido pequena, tampas ventiladas, 25 cm 2	Falcon - Becton Dickinson	353112
Frascos grandes de tecido de cultura, tampões ventilados, 175 cm 2	Falcon - Becton Dickinson	353108
Cobre revestido do BB, 4,5 mm	Crosman	0767
Mixer Moinho	Retsch	MM300
Freezer racks Isopack	Eppendorf	022510240