Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Özet

Biz süreci için bir metodu tanımlar ve ekran alanında toplanan Vero hücre kültürü yöntemi ile virüs bir çeşitliliğe sivrisinekler. Bu tekniği kullanılarak, Connecticut toplanan sivrisinek 4 taksonomik ailelerden gelen 9 farklı virüsler tespit ettik.

Özet

Sivrisinekler Batı Nil virüsü, dang virüs ve chickungunya virüs gibi önemli insan patojenleri de dahil olmak üzere bir dizi farklı virüsler iletir. Bu virüslerin çoğu endemik aralıklarında yoğunlaştı ve yeni bölgeler için genişletilmiş, bu tehditlere yanıt vermek için, etkin bir gözetim ve kontrol programları gerektiren var. Virüs etkinliğini izlemek için bir strateji endemik sitelerinden çok sayıda sivrisinek toplama ve viral enfeksiyon için test içerir. Bu makalede, biz nasıl işleneceğini süreci tanımlamak ve Vero hücre kültürü yöntemi ile bulaşıcı bir virüs için sivrisinek alanında toplanan ekran. Sivrisinekler tuzak konumu ve türlerine göre sıralanır ve ≤ 50 bireyler içeren havuza gruplandırılmıştır. Pooled örnekleri karıştırıcı değirmen ve sulu faz konfluent Vero hücre kültürlerinde (Klon E6) üzerine inoküle kullanarak tamponlu salin içinde homojenize edilir. Hücre kültürleri 3-7 sonrası aşılama ve hücre kültüründe yetişen herhangi bir virüs uygun tanı testleri tarafından belirlenen gün sitopatik etki izlenir. Bu yaklaşımın kullanılması, Connecticut, ABD toplanan sivrisinekler 9 farklı virüsler izole var, ve bunlar arasında, 5 insan hastalığa neden olduğu bilinmektedir. Bu virüsler Üç (Batı Nil virüsü, Potosi virüs ve La Crosse virüsü), Kuzey Amerika ya da 1999 yılından bu yana New England bölgesi için yeni kayıtlar temsil eder. Geniş bir çeşitlilik virüs tespit yeteneği hem sivrisinek nüfus yılında kurulan ve yeni çıkan virüslere izlenmesi için kritik öneme sahiptir.

Protokol

1. Sivrisinek sıralama ve kimlik

1. Aşağıdaki prosedürler canlı sivrisinek ile çalışmak için eğitilmiş personel tarafından adanmış bir biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) laboratuar açık bir laboratuvar tezgahı üzerinde yapılmaktadır. "Soğuk zincir" prosedür boyunca korunur.
2. 5 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda sivrisinek toplama torbası koyarak erişkin sivrisinek canlı anestezisi. Kuru buz içeren bir izolasyonlu konteyner Transfer toplama torbası. Kapağını kapatın ve knock-down tam emin olmak için 1-3 dakika boyunca karbon dioksit sivrisinek maruz.
3. Kuru buz bir yatağın üzerine yerleştirilen bir ön-soğutulmuş tavada üzerine anestezi sivrisinek dokunun. Plastik kısmı su bardağı ince forseps ve yerinde kullanarak birbirinden ayrı dişi sivrisinekler. Kapak ve ıslak buz üzerinde yer bardak ile kaplayın.
4. Stereo diseksiyon mikroskobu (10-60X zoom) yardımı ile dış sivrisinek morfolojisi dayalı açıklayıcı taksonomik tuşlarını kullanarak türlerin sivrisinek tanımlamak elektronik bir soğuk masaya monte edilebilir.
5. Bakır BB içeren 2 ml ek kapaklı şişeleri ≤ 50 bireylerin havuza sivrisinek türü tespit birleştirin. Şişeler, benzersiz bir tanımlayıcı ile etiketlenir.
6. Tüm sivrisinekler belirlenmesini takiben, şişeleri etiketli torbalara yerleştirilmiş ve kuru buz içeren plastik bir soğutucu düzenlenecek.
7. Sivrisinek havuzları virüs testi kadar -80 ° C derin dondurucuda saklayın.

2. Biyogüvenlik sivrisinek virüs izole etmek için düşünceler

1. Aşağıdaki işlemleri ¹ çevreleme bu seviyede çalışmak için eğitilmiş personel tarafından bir biyogüvenlik seviye-3 (BSL-3) laboratuvar yapılmaktadır. Laboratuvar olanakları, ekipman, prosedür ve uygulamaları, kurumsal, eyalet ve federal gözetim ve denetimine tabidir. Aşağıdaki protokoller denemeden önce uygun eğitim ve onay isteyin.
2. , Tek kullanımlık önlük, eldiven, yüz kalkanları ve solunum gibi her bir işlem için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin.
3. Çalışma yüzeyleri tamamladıktan prosedürler öncesinde ve sonrasında% 70 alkol ile dezenfekte edin.
4. Sınıf II Biyogüvenlik kabini (BSC) hücre kültürleri ve potansiyel olarak bulaşıcı malzeme ele alınır.
5. Sivrisinek havuzları bir BSC içine yerleştirilen bir karıştırıcı değirmen homojenize.
6. Sivrisinek homojenatlarında sıkı bir aerosol mikrosantrifüj santrifüj. Bu yordamı BSC içinde gerçekleştirilir mümkün değilse işletme ve santrifüj örnekler alınırken, operatör bir maske takmalıdır.
7. Pipetler ve BSC (biyogüvenlik kabini) malzeme taşıma pipetlemeyin ipuçları önce otoklav% 10 çamaşır suyu ile ıslatılmış. Tüm laboratuar atık bertarafına kadar önce otoklavlanarak dekontamine.

3. Vero hücrelerinde hazırlanması

1. Çamaşır suyu içeren atık behere konfluent Vero hücreleri (Klon E6) büyük bir doku kültürü balonuna (175 cm ²⁾ Durusu kültür ortamı.
2. 5 ml PBS kısım ve hücre tabakası üzerinde ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun balonun kenarları boyunca girdap ekleyerek Vero hücreleri yıkayın.
3. Durusu PBS atık behere.
4. 2,5 ml tripsin-EDTA ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun hücre tabakası üzerinde girdap ekleyin.
5. 37 5 dakika boyunca inkübatörde balon ° C'de,% 5 CO _2.
6. Alt yüzeyindeki hücreleri çıkarmak için yavaşça sallamak ve girdap şişesi. Hücreleri kolayca kaydırarak; hücreleri kolayca kaydırarak yoksa ek bir 1-5 dakika inkübe edin.
7. 5 Minimal Essential Medya mL (MEM),% 5 fetal sığır serumu (FBS), serolojik pipetlemeyin kullanarak ve pipetlemeyin ekle yukarı ve aşağı hücre kümeleri break up için 10-20 kez.
8. Toplam hacmi 22.5 mL için ek bir 15 mL MEM,% 5 FBS ekleyin ve iyice karıştırın.
9. 40 küçük doku kültürü şişeleri (25 cm ²⁾ dik iki rafları (20 şişeler / raf) olarak yerleştirin.
10. Biyogüvenlik kabini içinde şişelerin bulunduğu raflara yerleştirin ve şişe kapakları önünde yerleştirerek, şişesi kapakları kaldırmak.
11. MEM,% 5 FBS serolojik pipetlemeyin kullanarak her balona 4 mL koyun.
12. Her balona (~ 01:06 bölme oranı) şişesi kapakları değiştirin 0.5 mL askıya hücreleri koyun.
13. Geri kalan hücre süspansiyonu (~ 2.5 mL) içeren orijinal büyük doku kültürü şişesi,% 5 FBS MEM, 50 ml ekleyin ve inkübatör şişeyi geri. Aynı büyük doku kültürü şişesi 5 pasajlar yeniden kullanılabilir ve daha sonra yeni bir balon değiştirmek için set-up olmalıdır.
14. Yığınlar halinde tepsiye yerleştirin küçük doku kültürü şişeleri. Medya düzgün flaks alt kapsadığını emin olmak için Swirl tepsi.
15. 37 kuvöz küçük şişeler ° C,% 5 CO ₂ ve% 80-90 konfluent kadar bir gecede büyümek yerleştirin.

4. Sivrisinek havuzları hazırlanması

1. Sivrisinek havuzları test işlemleri sırasında soğuk tutun. Önceden soğutulmuş kullanın.rafları ve dondurucu karıştırıcı değirmen kasetleri, buz reaktifler ve soğutmalı santrifüj sivrisinek havuzları işleme.
2. Yeri tüpler önceden soğutulmuş dondurucu raf sivrisinek içeren ve 1 - 1,5 ml PBS-G sivrisinekler, her tüp.
3. Dondurucu karıştırıcı değirmen kaset al. Sonra her kaset içine koyun ve 24 tüplü karıştırıcı değirmen güvenli.
4. 4 dakika 25 devir / saniye örnekleri homojenize. Mikser değirmen sivrisinek dokuyu bozan, yüksek hız ve her tüp içinde bir metal BB tüpler sallar.
5. 7,000 rpm hızında 6 dakika için borular santrifüjleyin.
6. Dondurucu raflar yerleştirmek tüpler Vero hücre içine inoküle kadar.

5. Sivrisinek havuzu homojenatlarında Vero hücreleri Aşılanması

1. Yeterli confluency ve hücre sağlığını sağlamak için her bir serinin en az bir doku kültür şişelerinde inverted mikroskop altında kontrol edin;% 80-90 kapsama alanı hakkında bekliyoruz.
2. Hat kadar her sivrisinek havuzu karşılık gelen üyelik numaraları ile bir raf ve etiket şişeler 20 küçük doku kültürü şişeleri.
3. Kapaklar ve atık behere doku kültürü şişeleri medya süzün en gevşetin. Balonuna yeterli medya tamamen kat hücre tek tabaka bırakın.
4. Ilgili doku kültürü balona her işlenmiş sivrisinek havuzu süpernatant kısım 100μL.
5. Kültür şişesi kapağı yerine takın ve sıkın.
6. 35-40 rpm'de 5 dakika (oda sıcaklığı) çalkalamalı kültür şişeler düz yatırın.
7. 20 doku kültürü şişeleri BSC bir raf ve yerinde dik pozisyona dönün.
8. Bir seferde 3 doku kültürü şişeleri Sır, serolojik bir pipet kullanarak her bir balona 4 mL büyüme ortamı dağıtmak; kapakları yerine.
9. Pipet ucu kültür şişelerinde boyun veya dudak temas etmediğinden emin olun. Temas şişesi ile yapılır, gerektiğinde pipet uçları değiştirin.
10. 37 inkübe doku kültürü şişeleri ° C,% 5 CO _2.

6. Vero hücreleri virüs büyüme Eleme

1. Ekran, 3-7 gün sonrası aşılama, viral enfeksiyon belirtileri, sitopatik etki (CPE), doku kültürü şişeler inoküle.
2. Görme şişeler bükerek, CPE ve / veya kirlenme hücre kültürleri incelemek ve medya inceleyerek balonun altındaki havuzları. Hücrelerin CPE sırasında bozulabilir ya da büyüme, maya, mantar, veya bakteriyel kontaminasyon nedeniyle medya bulutlu görünecektir.
3. Ters bir mikroskop altında bulutlu medya sergi hücre kültürleri yeniden inceleyin. Virüsler hücreleri deforme olmaya ve kültür şişeler düşebileceği neden olacaktır. Görünür kirleticiler, örneğin maya, diğer bakteri, mantar ya da ağır sivrisinek enkaz, hücre kültürleri 0.22μM şırınga filtresi sayesinde orijinal sivrisinek havuzu geçerek yeniden test edilmektedir.
4. Aseptik serolojik bir pipet kullanarak etiketli cryotubes virüs pozitif hücre kültürleri medya 1-2 mL dağıtılıp.
5. Virüs kültürler -80 saklanan ° C uygun tanı testleri ile tespit kadar.

7. Reaktiflerin hazırlanması

1. MEM,% 5 FBS. 4 L gg H ₂ 0 son bir hacmi 37.6 gr toz MEM eritin. Çözüm medya şişe ve otoklavda 500 ml alikotları içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik her bir şişe 26 ml ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 5.2 mL L-Glutamine, 5.2 ml anti-biotic/mycotic ve 10.4 ml% 7.5 sodyum bikarbonat ekleyin. 4 ° C saklayınız
2. PBS-G. 16 g NaCl, 0,4 g KCI, 2.3 g Na ₂ HPO _4, 0.4 g KH ₂ PO _4, ve% 0.5 fenol Red 4 ml, 1000 ml dd _{H 2} 0 içine çözülür . 2 N NaOH (gerekirse) 7,1-7,4 pH ayarlayın. Ayrı bir beher, ısı 600 kaynamaya H ₂ 0 ml. Hot-plate çıkar, 10 gr jelatin ekleyin ve çözülür. PBS çözüm çözünmüş jelatin solüsyonu ekleyin ve 2 L dd H ₂ O. ile son ses seviyesini ayarlamak 100 ml solüsyon şişeleri ve otoklav içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik olarak 42.8 mL ısı ile inaktive edilmiş tavşan serumu ve 1.4 mL anti-biotic/mycotic ekleyin. 4 ° C saklayınız
3. PBS hücre yıkayın. 400 mL gg H ₂ O. 50 ml 10X Dulbecco'nun PBS 2 N NaOH ile pH 7.1 'e ayarlayın. Dd H ₂ O. ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın 0.2uM vakum filtre ünitesi ile filtre çözüm. 5 ml alikotları 8 ml vidalı kapaklı tüpler içine koyun. 4 ° C saklayınız

8. Temsilcisi Sonuçlar

4 taksonomik ailelerden gelen virüslerin Dokuz farklı 1997-2010 (Tablo 1) Connecticut eyalet çapında sürekli gözetim sırasında toplanan sivrisinekler kurtarıldı. Bu virüsler Beş insan hastalığı, Batı Nil virüsü ve doğu at ensefaliti virüsü olan en önemli patojenlerin neden olduğu bilinmektedir. Yeni keşifler toplanan sivrisinekler WNV ilk izolasyonKuzey Amerika, 1999 ² 2005 ⁴ 2000 ³ kuzeydoğu ABD'de Potosi virüsün ilk izolasyon, ve New England'da La Crosse virüsünün ilk izolasyon.

Virüs	Aile	No izole	No yerlerde	No yıl denetliyor	Insan hastalığı	Refs.
Batı Nil virüsü	Flaviviridae	1.002	94	12	Orta şiddetli, ateş, ensefalit	2,5
Doğu at ensefaliti virüsü	Togaviridae	292	41	10	Şiddetli, ensefalit	6,7
Highlands J virüsü	Togaviridae	178	39	11	Bilinmiyor	6
Jamestown Kanyon virüsü	Bunyaviridae	305	74	14	Hafif ve orta şiddette, ateş, menenjit	8
Potosi virüs	Bunyaviridae	259	76	4	Bilinmiyor	3
Cache Valley virüs	Bunyaviridae	114	51	8	Iki belgelenmiş durumda şiddetli, ateş, nörolojik hastalık Hafif
Trivittatus virüs	Bunyaviridae	83	21	11	Bilinmiyor
La Crosse virüsü	Bunyaviridae	1	1	1	Orta şiddetli, ensefalit	4
Flanders virüs	Rhabdoviridae	4	4	2	Bilinmiyor

Tablo 1. Virüsler Vero hücre kültürü yöntemi ile alanında toplanan sivrisinekler algılandı. Sivrisinekler 1997-2010 Connecticut eyalet çapında gözetim sırasında toplanmıştır.

Tartışmalar

Vero hücre kültürü testi virüs bir çeşitlilik için ekran alan toplama sivrisinekler için etkili bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bu özellikle hedef bir veya bir kaç ilgi virüslerin moleküler yöntemler tezat. Ayrıca, Vero hücre kültürü tahlil eşit değilse, ^RT-PCR 7 daha hassas ve gelecek çalışmalar için referans koleksiyonu saklanır virüs izolatları ile bize sunuyor bulduk . Bununla birlikte, hücre kültürü sistemleri, birçok durumda uygun olmayabilir. Bu yaklaşım, ek ma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / ekipman Adı	Şirket	Katalog Numarası
Fetal sığır serumu	Gibco - Invitrogen	16140
Anti-biotic/mycotic	Gibco - Invitrogen	15240
Sodyum bikarbonat, NaHCO 3,% 7.5 Soln.	Gibco - Invitrogen	25080
L-Glutamine 200mm 100x	Gibco-Invitrogen	25030
Toz gerekli minimum orta (MEM)	Gibco - Invitrogen	11700
10X Dulbecco'nun Kullanıcı PBS	Gibco - Invitrogen	14080
Tripsin-EDTA	Gibco - Invitrogen	15400
Tavşan serumu	Gibco - Invitrogen	16120
Vero Hücreleri (Klon E6)	ATCC	CRL-1586
Küçük doku kültürü matara, havalandırmalı kapakları, 25 cm 2	Falcon - Becton Dickinson	353112
Büyük doku kültürü matara, havalandırmalı kapakları, 175 cm 2	Falcon - Becton Dickinson	353108
Bakır kaplı BB, 4.5 mm	Crosman	0767
Mikser Mill	Retsch	MM300
Isopack dondurucu raflar	Eppendorf	022510240