هيكل HIV - 1 بواسطة جمعيات قفيصة البرد المجهر الإلكتروني وتكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء

Summary

توضح هذه المقالة طريقة للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) بنية الجزيئات helically تجميعها باستخدام البرد المجهر الإلكتروني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم تجميعات HIV - 1 قفيصة مفصلة لتوضيح الإجراء إعادة الإعمار 3D لتحقيق خريطة كثافة من تكرارية حلزونية طريقة اعادة الاعمار الحقيقية في الفضاء.

Abstract

البرد المجهر الإلكتروني (البرد م) ، جنبا إلى جنب مع معالجة الصور ، أداة قوية بشكل متزايد لتحديد بنية الجزيئات البروتينية المجمعات والتجمعات. في الواقع ، لقد تم حل واحد المجهر الإلكتروني الجسيمات ⁽¹⁾ وثنائية الأبعاد (2D) الإلكترون البلورات ² أصبحت روتينية منهجيات نسبيا وعدد كبير من الهياكل باستخدام هذه الأساليب. في الوقت نفسه ، وقد وضعت ومعالجة الصور ثلاثية الأبعاد (3D) إعادة بناء الأجسام حلزونية بسرعة ، وخاصة ، وتكرارية حلزونية الحقيقي الفضاء إعادة الإعمار (IHRSR) الأسلوب ³ ، والذي يستخدم أدوات التحليل واحد الجسيمات بالتعاون مع التماثل حلزونية. العديد من الكيانات البيولوجية وظيفة في أشكال حلزونية أو الخيطية ، بما في ذلك شعيرات أكتين ⁴ ، ميكروتثبول ⁵ ، ⁶ ألياف اميلويد ، والفيروسات فسيفساء التبغ ⁷ و ⁸ سياط الجراثيم ، وأنه يمكن التوصل إلى خريطة كثافة 3D كيان حلزونية من الإسقاط واحد الصورة ، بالمقارنة مع العديد من الصور المطلوبة لإعادة الإعمار 3D لكائن غير حلزونية ، مع أسلوب IHRSR ، التحليل البنيوي لهذه الجمعيات حلزونية مرنة والمختلين الآن يمكن بلوغه.

في هذه المقالة الفيديو ، ونحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية للحصول على خريطة كثافة 3D التجمع من البروتين حلزونية (HIV - 1 قفيصة ⁹ هو مثالنا) ، بما في ذلك بروتوكولات للتحضير العينة البرد EM ، وانخفاض جمع البيانات عن طريق جرعة والبرد EM ، وفهرسة أنماط الحيود حلزونية ، ومعالجة الصور وإعادة الإعمار 3D باستخدام IHRSR. مقارنة مع التقنيات الأخرى ، والبرد EM عروض الأمثل في ظل ظروف الحفاظ على عينة الأصلي القريب. هي جزء لا يتجزأ العينات في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي ، من خلال تجميد السريع ، وتصويرها في المجاهر الإلكترونية في درجة حرارة النتروجين السائل ، في ظل ظروف جرعة منخفضة للحد من أضرار الإشعاع. ويتم الحصول على عينة من الصور الأصلية في ظل ظروف قرب على حساب إشارة منخفضة وعلى النقيض من انخفاض في micrographs مسجل. لحسن الحظ ، تم إلى حد كبير عملية إعادة الإعمار حلزونية الآلي ، مع استثناء من فهرسة نمط حيود حلزونية. هنا ، نحن تصف نهجا للبنية حلزونية وتحديد مؤشر التماثلات حلزونية (لولبية المعلمات) من micrographs الرقمية ، وهي خطوة ضرورية لإعادة الإعمار 3D حلزونية. باختصار ، نحصل على كثافة 3D الخريطة الأولية عن طريق تطبيق أسلوب IHRSR. ومن ثم صقل هذه خريطة أولية تكرارا عن طريق إدخال قيود للمعلمات محاذاة كل قطعة ، وبالتالي السيطرة على درجة من الحرية. ويتم تحقيق مزيد من التحسن عن طريق تصحيح للالمقابل نقل وظيفة (CTF) من المجهر الالكتروني (السعة ومرحلة التصحيح) ، وتحقيق الاستفادة المثلى من التماثل حلزونية من التجميع.

Protocol

1. رطب مجمدة إعداد EM العينة

لأن HIV - 1 قفيصة البروتين (CA) التجميعات ⁹ مستقرة فقط في الملح (كلوريد الصوديوم 1M) العازلة ، مما يساهم في ضجيج الخلفية القوية البرد EM الصور ، نستخدم التخفيف السريع والعودة الجانبية طريقة للحد من النشاف عابر الملح التركيز عند إعداد الشبكة EM مجمدة المائية.

1. تصريف توهج الجانب الكربون من 200 شبكة R2 / 1 في إطار شبكات النحاس Quantifoil 25mA لمدة 25 ثانية.
2. استخدام البخاخات لجلب الرطوبة في الغرفة البيئية ، ومنزل من صنع الجاذبية دليل الغواص ، إلى 80 ٪.
3. الاتحاد الدولي للفروسية في ديوار الغطاس Vitrobot أو الإيثان السائل بارد باستخدام النيتروجين السائل. تحميل ديوار يغرق التجميد على المكبس اليدوي الجاذبية.
4. 2.5 ميكرولتر من تطبيق الحل CA مجمعة سلفا على الجانب الكربون من الشبكة ، التي شنت على ملقط ، وتحميل ملقط على المكبس مع الجانب الكربون من الشبكة التي تواجه بعيدا عنك.
5. إضافة 3 ميكرولتر من الملح العازلة منخفضة التخفيف (100 ملي مول كلوريد الصوديوم) إلى الجانب الخلفي من الشبكة وصمة عار على الفور في الجانب الخلفي من الشبكة مع قطعة من ورق الترشيح. وينبغي على السطح مرة أخرى كلها من الشبكة تكون على اتصال وثيق مع ورقة الترشيح لحوالي 6 ثوان ، قبل إزالة ورقة الترشيح. يغرق الشبكة على الفور الى الايثان السائل بعد إزالة ورقة الترشيح.
6. إزالة ملقط من المكبس ونقل بسرعة الى الشبكة الشبكة مربع التخزين.

2. البرد المجهر الإلكتروني المجالس أنبوبي CA

1. تحميل الشبكة رطب مجمدة الى الاتحاد الدولي للفروسية التشغيل G2 Polara المجهر الالكتروني في 200kv ومزودة كاميرا CCD غاتان 4Kx4K.
2. تحت وضع جرعة منخفضة من تفتيش ، في التكبير من ~ 200X وبجرعة <0.001e ^-- A / ² ، شاشة شبكة كاملة للمناطق مناسبة مع الثلج وحفظ مواقع هذه المناطق في ملف المرحلة.
3. أذكر مواقف حفظها وشاشة أخرى في هذه المجالات من التكبير 3900 x في وضع جرعة منخفضة من تفتيش. تحديد المناطق التي توجد فيها طبقة وموحدة رقيقة من الجليد يحتوي على فصل جيدا ، وأنابيب طويلة أكثر من الثقوب ، لجمع البيانات. حفظ مواقع هذه المناطق في ملف المرحلة الثانية.
4. التبديل إلى وضع التعرض في التكبير من 59000 س ، أقحم هدفا ميكرومتر 100 الفتحة ، وضبط الهدف وصم وكثافة شعاع لجرعة من ~ 15 ه ^-- / ² في التعرض.
5. عودة إلى وضع جرعة منخفضة من عملية البحث ، والانتقال إلى موقف حفظها وتحديد ومركز أنبوب جيدة باستخدام كاميرا CCD. التبديل إلى وضع التركيز ، وضبط التركيز ، وتعيين قيمة يزيل التباؤر ، ميكرومتر عادة بين 0،5-2،5. التبديل إلى وضع التعرض ، تعيين وقت تعرض 0،3-0،5 ثانية ، لجرعة من 15 ه ^-- / ² ، وجمع صورة. يتم جمع الصور على الكاميرا لوحة ، وينبغي السماح للأفلام لتسوية لمدة 10 ثانية قبل اتخاذ التعرض.
6. انتقال إلى الموضع التالي حفظ وكرر الخطوة 5 لجمع مزيد من الصور.
7. يتم تطوير هذه الأفلام في كامل قوته D19 لمدة 12 دقيقة ورقمية فائقة باستخدام الماسح الضوئي ED نيكون coolscan 9000 بحجم 6.35 ميكرون بكسل. تنسيق ملفات الصور وTIFF.

3. حلزونية الفهرسة

يمكن فهرستها من قبل كائن حلزونية معلمتين : ترتيب بسل ، ن ، وطبقة رقم السطر ، ل. كل سطر في طبقة تحويل فورييه ، كما تميزت (ن ، ل) ، يناظر مجموعة من خطوط على سطح شعرية للكائن حلزونية الرمز بواسطة (ح ، ك) الأرقام القياسية ، وذلك باستخدام الرموز من 2D شعرية. عن أي (ح ، ك) ، وهو خط وطبقة (ن _{هونج كونج} ، ل _{هونج كونج)} هو مزيج خطي من اثنين من ناقلات الأساسية (ن ₁₀ ، ل ₁₀₎ و (ن ₀₁ ، ل ₀₁₎ ، والتي هي قيم n و لتر من يمكن الحصول على خطين طبقة الرئيسية (1 ، 0) ولتر (0 ، 1). طبقة من ارتفاع خط قياس طول المحور Z في تحويل فورييه. ويمكن تقدير قيمة ن باستخدام المعادلة التالية ¹⁰

πRr ≈ ≈ 1،1 J _ن | ن | -0.9.....................( 1)

حيث J _ن هي وظيفة بسل ، الذي يحدد كثافة طبقة ن خط ^الرابع ، ص هي دائرة نصف قطرها من وجوه حلزونية ، و R هو نصف قطرها من السعة القصوى للخط طبقة. ويرتبط عدد خط طبقة ، ل ، ن لبحكم اختيار ¹¹

ل = أم تينيسي +....................( 2)

حيث t و u ثوابت من الحلزون. عن أي الحلزون معين ، قد يكون هناك وحدات ش بالضبط في بالضبط (أو بشكل وثيق جدا) ر جomplete المنعطفات.

1. مربع من أنبوب مستقيم نسبيا وطويلة مع قطر موحدة باستخدام EMAN في البرنامج ¹² helixboxer وحفظ الصور في شكل لجنة نهر الميكونج.
2. تحديد المسافة تكرار حلزونية ، ج ، وذلك باستخدام البرنامج عبر العلاقة القائمة ، مثل 'imgccf ، في حزمة MRC ^13.
3. حساب تحويل فورييه بطول المربع الجديد الذي يشكل جزءا لا يتجزأ من المسافة تكرار ، ج.
4. اختيار اثنين من خطوط الطبقة الرئيسية التي تحدد شعرية two سطح الناقلة الأساسية (1،0) و (0،1).
5. قياس قطرها من الأنبوب ، ص ، وارتفاع ونصف قطرها من الخطين الرئيسيين في طبقة تحويل فورييه ، ل ₁₀ ، R ₁₀ ، ل ₀₁ R ₀₁ ، على التوالي (الشكل 1).
6. حساب ن ن ₁₀ و ₀₁ وفقا لمعادلة (1).
7. منذ يتم تقدير القيم ن فقط ، ويتم الكشف على مجموعات قليلة من ن ₁₀ و ₀₁ ن في خطوات لاحقة (انظر الخطوة 4.2) للعثور على التماثل حلزونية الصحيح باستخدام IHRSR حزمة البرنامج.
8. حساب التماثل المسمار التي وصفها رقمين الحقيقي : تناوب بين مفارز (Δφ) وارتفاع المحوري (Δz) من الحلزون بنجمة واحدة (ن = 1). نظرا ل ₁₀ ، ل ₀₁ ، ن ₁₀ ، والقيم ن ₀₁ ، يمكن الحصول على وش ر عن طريق اختبار مجموعة من القيم متر (على سبيل المثال ، -50 <م <50) وفقا لقاعدة الاختيار. أخيرا ، وتحسب Δφ Δz باستخدام Δφ = 360 طن / u و Δz = ج / ش.

4. ثلاثي الأبعاد التعمير

1. تجزئة الجسيمات
   1. فتح صورة مجهرية تحتوي على جزيئات حلزونية ، وذلك باستخدام بوكسر برنامج رسومي ، والذي هو عبارة عن برنامج في حزمة EMAN.
   2. خفض الجسيمات حلزونية الى شرائح متداخلة. في لوحة التحكم من بوكسر ، واختيار وضع اللولب وتعيين المعلمات في رياضة الملاكمة : حجم مربع يجب أن تكون أكبر من قطر من الجسيمات والقيمة عن 'OLAP" ينبغي ~ 90 ٪ من حجم الصندوق.
   3. بعد اليسار بالضغط على حد سواء من الجسيمات حلزونية ، سوف تولد تلقائيا بوكسر سلسلة من مربعات الجسيمات على طول الحلزون.
   4. حفظ شرائح محاصر فضلا عن الإحداثيات الخاصة بها.
2. 3D إعادة الإعمار الأولية باستخدام برامج IHRSR
   1. المقلوب على النقيض من الصور البرد EM وتطبيق تمرير منخفض تصفية ¹⁴ (اختياري) قبل تجهيزها مع حلزونية متكررة الحقيقي الفضاء أسلوب إعادة الإعمار (IHRSR).
   2. فتح واجهة رسومية لبرنامج IHRSR بكتابة "مولد". توفير واجهة رسومية مع جميع المعلومات عن الجزيئات المكدس محاصر ، بما في ذلك اسم ومسار المكدس ، وعدد الصور في المكدس ، والقيم لمعلمات التناظر ، الخ انقر على زر "إنهاء" لإنشاء البرنامج النصي إعادة الإعمار ، b25.spi.
   3. استخدام اسطوانة صلبة أو جوفاء باعتبارها المرجعية الأولى والسماح للتنقل الداخلي حتى لم تعد هناك أي تغييرات في التماثل المسمار المعرفة ، والذي يحدث عادة بعد بضع دورات. وينبغي أن يكون التماثل حلزونية تعطي الحق التعمير ستابلي المتقاربة. وسوف تستخدم في إعادة الإعمار ولدت في الدورة الماضية مرجعا الأولية لمزيد من الصقل. IHRSR ينفذ باستخدام برامج إعادة الإعمار 3D سبايدر.
3. إعادة الإعمار مع تنقيح تكرارية ¹⁵ يستخدم الآن إعادة الإعمار التي تم إنشاؤها بواسطة 3D IHRSR كمرجع أولي لصقل إضافية. خلال صقل والتناظر هو ثابت في Δφ حلزونية وΔz ، والتي تتحدد من الإجراء IHRSR.
   1. تحديد يزيل التباؤر الاستجماتيزم والحاضر في صورة مجهرية باستخدام برامج CTFFIND3 وCTFTILT ^16.
   2. تتضاعف شرائح الجسيمات التي CTF باستخدام برامج سبايدر ^17. وتستخدم عملية يطلق FT في جناح سبايدر لحساب تحويل فورييه (FFT) للصورة 2d. بعد ذلك ، هو ضرب من قبل الاتحاد الفرنسي للتنس القيم CTF ، مصممة في الخطوات السابقة ، وذلك باستخدام عملية تسمى MU ضمن جناح سبايدر. القيمة التي تم الحصول عليها ومن ثم تحويلها مرة أخرى عكسية لتشكيل صورة جديدة (CTF لتصحيح) في الفضاء الحقيقي باستخدام عملية سبايدر ، FT مرة أخرى.
   3. إجراء مطابقة الاسقاط من خلال مقارنة حجم التوقعات من الإشارة مع CTF لتصحيح الصور ، وذلك باستخدام متعددة المرجعية المحاذاة. ويقتصر الاختلاف في زاوية الميل الخروج من الطائرة إلى -10 / + ° و عينات في الخطوات رقم 1. أعرض القيود ، مثل معاملات الارتباط العالية ، في الطائرة بالقرب من زوايا 0 درجة أو 180 درجة مئوية ، ومحدودة X - التحولات ، للمعلمات محاذاة كل قطعة. تدرج في اعادة الاعمار فقط تلك الشرائح التي تفي القيود.
   4. بعد كل دورة صقل تكراري ، يتم إنشاء التعمير 3D باستخدام الإسقاط الخلفي ومقسوما على مجموع CTF2.
   5. فرض التماثل حلزونية لتوليد حجم symmetrized. يتم إنهاء صقل تكرارية عندما لا مزيد من التحسن في قرار لإعادة الإعمار 3D جديد يحدث.
   6. يتم استخدام حزمة معالجة سبايدر الصورة لمعظم الخطوات الصقل. يتم التحكم في سلسلة من العمليات التي تقوم بها سبايدر النصية ، والتي تم إنشاؤها من قبل المستخدم التي تحتوي على ملفات التحكم دفعة تسلسل العمليات والقيم المعلمة. يتم حساب باستخدام برامج إعادة الإعمار النهائية في جناح سبايدر.

5. ممثل النتائج :

وكان احد HIV - 1 CA A92E أنبوب (الشكل 1A) من أصل محاصر ، وكان يحسب لها تحويل فورييه (الشكل 1B) للفهرسة حلزونية. لخطوط طبقة (1 ، 0) و (0 ، 1) ، ل ₁₀ = 28 ، ل ₀₁ = 37 ، ص ₁₀ = 55 ، ص ₀₁ = 44. تعطى نصف قطرها أنبوب 211.57Å ، يقترب نحن ن ₁₀ =- 12 ، ن ₀₁ = 11 (هنا ، ومحددة سلفا من الإنصاف). مع تكرار مسافة 5195.48Å ، تم تحديد التماثل المسمار من الأنبوب كما Δz = 6.8093Å ، Δφ = 328.88 درجة. وتم تنقيح وΔz Δφ ل7.1321Å و328.86 · استخدام IHRSR (الشكل 2A) ، ويظهر في الشكل الأولي التعمير. 2B. تعمير النهائية (الشكل 3) ، وتحسنت بعد تنقيح تكرارية ، والخريطة كثافة بكثير من النموذج الأولي مع احتساب IHRSR (الشكل 2B).

الشكل 1. الفهرسة من HIV - 1 أنبوب حلزوني CA. (أ) واحد HIV - 1 A92E CA أنبوب الصورة. مقياس بار ، 30 نانومتر. (ب) وتحويل فورييه من الأنبوب هو موضح في (A). وتدل المؤشرات حلزونية (ن ₁₀ =- 12 ، ن = ₀₁ 11). النقاط رأس السهم إلى خط طبقة في القرار 23A.

الشكل 2. أولي للتعمير IHRSR به. (أ) تحديد التماثل برغي لكل دورة تكرارية. وΔφ Δz ، بدءا من القيم الأولية ، تتلاقى مع قيم مستقرة بعد 10 دورات متكررة الصقل. (ب) وكثافة 3D الخريطة الأولي بعد 10 دورات متكررة.

الشكل 3. الخريطة 3D الكثافة بعد تنقيح تكرارية. (AC) ويتم عرض خريطة كثافة أنابيب CA الى ثلاثة شرائح متعامد : مواز للمحور الأنبوب وعلى مقربة من السطح (A) ، عمودي على محور الأنبوب (B) ، وبالتوازي مع المحور ، ومن خلال أنبوب (C) . أشرطة النطاق ، 10 نانومتر. (د) يجعل سطح خريطة كثافة 3D احيط في 1.8s تضم 100 وحدة التخزين ٪.

Discussion

نقدم مجموعة من البروتوكولات لتوفير نهج مباشرة للحصول على هياكل 3D الأجسام حلزونية. باستخدام الإجراءات المذكورة ، حصلنا على هيكل 3D من HIV - 1 قفيصة التجمع من صورة أنبوب واحد (176 شرائح). ويمكن تحقيق أعلى هياكل القرار بما في ذلك المزيد من البيانات الصورة.

هناك العديد من النقاط الحاسمة لجمع البيانات وتحليلها الأمثل : أولا ، أثناء إعداد عينة البرد - EM ، يجب أن تكون العينة نشف الحل بعيدا ، وترك موحدة ، طبقة رقيقة من الحل الذي هو أكثر سمكا قليلا من حجم العينة. هناك عدة طرق مختلفة لطخة العينة. لعينات الخلايا البكتيرية وأنبوبي ، مثل HIV - 1 التجمع CA ، النشاف من جانب واحد ، ولا سيما من الجانب الخلفي ، هي الأكثر ملاءمة.

الثانية ، والإنصاف من الحلزون يحتاج إلى تحديد ، وهذا لا يمكن أن تقوم به فهرسة حلزونية أو إعادة الإعمار. ومن الممارسات الشائعة هو استخدام تشميد ، تليها دوارة ¹⁸ التظليل لتحديد الطغيان. ويمكن أيضا الإنصاف أن تحدد بعد إعادة الإعمار عندما حل الخريطة كثافة عالية بما فيه الكفاية ، ونماذج 3D الذري للعناصر الفردية يجب أن تتوافق جيدا في خريطة الكثافة عندما يتم افتراض الإنصاف الصحيح. خلاف ذلك ، ينبغي أن تولى الطغيان المعاكس.

ثالثا ، ينبغي استخدام عامل تصفية فينر خلال معالجة الصور ، سواء بالنسبة لمرحلة التصحيح والسعة ، للحد من التضخيم الضوضاء. منذ CTF من صورة واحدة دائما صفر المعابر ، وفقدان جزء من المعلومات في الفضاء متبادلة. لذا ، فمن الضروري الحصول على بيانات الإسقاط متعددة شملت مجموعات لإعادة الإعمار 3D ، في تصوير كل القيم يزيل التباؤر مختلفة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	مصدر	تعليقات
توهج تصريف الجهاز 100X	توهج تصريف الجهاز 100X
Tecnai Polara F30 المجهر مع حقل بندقية الانبعاثات	الاتحاد الدولي للفروسية ، هيلزبورو ، OR
غاتان 4K X كاميرا CCD 4K	غاتان ، بليزانتون ، كاليفورنيا
الغطس للتجميد الجهاز		محلية الصنع المكبس اليدوي الجاذبية
Quantifoil R2 / 1 200 شبكات سلكية النحاس holely الكربون	Quantifoil مايكرو أدوات ، جينا ، ألمانيا
EM البرمجيات EMAN	http://blake.bcm.edu/EMAN/
EM البرمجيات IHRSR	http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /	إدوارد المتاحة من البرامج H. Egelman
EM البرمجيات العنكبوت	http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
MRC تجهيز البرامج القائمة على حلزونية	http://www.riken.jp/biostrmech/index.html	المتاحة من البرامج يونيكورا كوجي
CTFFIND3/CTFTILT وريال مدريد في الفضاء برامج التحسين حلزونية	http://emlab.rose2.brandeis.edu/software