Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

Riepilogo

Questo articolo descrive un metodo per ottenere un modello tridimensionale (3D) struttura delle molecole elicoidale assemblati con crio-microscopia elettronica. In questo protocollo, utilizziamo gruppi di HIV-1 capside per illustrare la procedura dettagliata ricostruzione 3D per ottenere una mappa della densità del iterativo elicoidale reale spazio metodo di ricostruzione.

Abstract

Cryo-microscopia elettronica (cryo-EM), combinata con l'elaborazione delle immagini, è uno strumento sempre più potente per la determinazione della struttura di complessi proteici macromolecolari e assiemi. In realtà, solo la microscopia elettronica di particelle ¹ e bidimensionali (2D) cristallografia elettroni ² sono diventati metodologie relativamente di routine e un gran numero di strutture sono stati risolti con questi metodi. Allo stesso tempo, l'elaborazione delle immagini e tridimensionali (3D) la ricostruzione di oggetti elicoidale si è rapidamente sviluppata, in particolare, il iterativo elicoidale nello spazio reale ricostruzione (IHRSR) metodo ^3, che utilizza solo strumenti di analisi delle particelle in collaborazione con simmetria elicoidale. Molte entità biologiche funzione in forme filamentose o elicoidali, tra filamenti di actina ^4, microtubuli ^5, fibre amiloidi ^6, virus del mosaico del tabacco ^7, e flagelli batteri ^8, e, perché una mappa 3D di densità un'entità elicoidale può essere raggiunta da un'unica proiezione immagine, rispetto alle molte immagini necessarie per la ricostruzione 3D di un oggetto non-elicoidale, con il metodo IHRSR, l'analisi strutturale di tali assiemi flessibili e disordinato elicoidale è ora raggiungibile.

In questo articolo video, forniamo protocolli dettagliati per l'ottenimento di una mappa 3D di densità di un assemblaggio di proteine ​​elicoidale (HIV-1 capside ⁹ è il nostro esempio), compresi i protocolli per Cryo-EM preparazione dei campioni, a bassa dose di raccolta dati da parte di Cryo-EM, l'indicizzazione di modelli di diffrazione elicoidali, e l'elaborazione delle immagini e la ricostruzione 3D utilizzando IHRSR. Rispetto ad altre tecniche, Cryo-EM offre la conservazione ottimale del campione in condizioni quasi nativa. I campioni sono incorporati in un sottile strato di ghiaccio vitreo, di congelamento rapido, e ripreso in microscopi elettronici alla temperatura dell'azoto liquido, in condizioni di basse dosi di ridurre al minimo i danni da radiazioni. Immagini di esempio sono ottenuti in condizioni quasi nativa a discapito di segnale basso e basso contrasto nel micrografie registrato. Fortunatamente, il processo di ricostruzione elicoidale è stato in gran parte automatizzato, con l'eccezione di indicizzazione del modello elicoidale di diffrazione. Qui, descriviamo un approccio alla struttura dell'indice elicoidale e determinare simmetrie elicoidale (parametri elicoidale) da micrografie digitalizzati, un passo essenziale per la ricostruzione 3D elicoidale. In breve, si ottiene una mappa 3D di densità iniziale applicando il metodo IHRSR. Questa mappa iniziale è poi iterativamente raffinato con l'introduzione di vincoli per i parametri di allineamento di ogni segmento, controllando così la loro gradi di libertà. Un ulteriore miglioramento si ottiene attraverso la correzione per la funzione di trasferimento contrasto (CTF) del microscopio elettronico (correzione di ampiezza e fase) e ottimizzando la simmetria elicoidale del gruppo.

Protocollo

1. Frozen-idratata EM campione preparazione

Perché l'HIV-1 proteina del capside (CA) assemblee ⁹ ​​sono stabili solo in sale alta (1M NaCl) tampone, che contribuisce forte rumore di fondo in Cryo-EM immagini, si usa una rapida diluizione e back-side metodo assorbente per ridurre temporaneamente il sale concentrazione nella preparazione del gelato-idratata griglia EM.

1. Glow discharge il lato di carbonio di 200-mesh R2 / 1 griglie di rame Quantifoil sotto 25mA per 25 secondi.
2. Utilizzare un nebulizzatore per portare l'umidità nella camera ambientale, un fatto in casa stantuffo gravità manuale, al 80%.
3. Nella FEI Vitrobot pistone dewar, fresco etano liquido con azoto liquido. Montare il tuffo-congelamento dewar sul pistone gravità manuale.
4. Applicare 2,5 ml di soluzione CA preassemblati sul lato di carbonio della griglia, che è montato su pinza, e caricare la pinza sul pistone con il lato di carbonio della griglia di fronte lontano da voi.
5. Aggiungere 3 ml di tampone a bassa diluizione di sale (100 mM NaCl) per la parte posteriore della griglia e asciugare immediatamente tamponando la parte posteriore della griglia con un pezzo di carta da filtro. L'intera superficie posteriore della griglia dovrebbe essere a stretto contatto con la carta da filtro per circa 6 secondi, prima di rimuovere la carta da filtro. Immediatamente tuffo la griglia in etano liquido dopo aver rimosso la carta da filtro.
6. Rimuovere la pinza dal pistone e trasferire rapidamente la griglia in un contenitore griglia.

2. Crio-microscopio elettronico di CA assemblee tubolari

1. Caricare il frozen-idratata griglia in una Polara microscopio FEI G2 operativo di elettroni a 200kV e dotato di una fotocamera Gatan 4Kx4K CCD.
2. Sotto basse dosi-modalità di ricerca, con un ingrandimento di circa 200x e con una dose <0.001e ^- / A ^2, la griglia schermo intero per le zone con ghiaccio idonee e salvare la posizione di queste aree in un file di scena.
3. Ricordiamo le posizioni salvate e schermo ulteriormente queste aree con un ingrandimento di 3.900 x in basse dosi-modalità di ricerca. Selezionare le aree con un uniforme, sottile strato di ghiaccio contenente ben separati, lunghi tubi sopra i buchi, per la raccolta dati. Salva la posizione di queste aree in un file di seconda fase.
4. Passa alla modalità di esposizione con un ingrandimento di 59.000 x, inserto di 100 micron apertura obiettivo, e regolare la stigmatism obiettivo e l'intensità del fascio per una dose di ~ 15 e ^- / a ² per l'esposizione.
5. Tornare alla modalità a basso dosaggio di ricerca, passare a una posizione salvata e di identificare e centro di un tubo di buona con la fotocamera CCD. Passare alla modalità di messa a fuoco, regolare il fuoco, e impostare un valore di defocus, normalmente tra 0,5 e 2,5 micron. Passare alla modalità di esposizione, impostare un tempo di esposizione di 0.3-0.5 secondi, per una dose di 15 e ^- / A ^2, e raccogliere un'immagine. Le immagini sono raccolte in una fotocamera piatto, e il film dovrebbe essere permesso di stabilirsi per 10 secondi prima che l'esposizione sia preso.
6. Passare alla posizione successiva salvati e ripetere il passaggio 5 per raccogliere altre immagini.
7. I film sono sviluppati in piena forza D19 per 12 minuti e digitalizzati utilizzando un Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner con una dimensione dei pixel di 6,35 micron. Il formato di file di immagine TIFF è.

3. Elicoidale indicizzazione

Un oggetto elicoidali possono essere indicizzati da due parametri: l'ordine di Bessel, n, e la linea il numero di livelli, l. Ogni linea di livello nella trasformata di Fourier, in quanto caratterizzato da (n, l), corrisponde a un insieme di linee sul reticolo superficie dell'oggetto elicoidale indicati con (h, k) gli indici, utilizzando la notazione da un reticolo 2D. Per ogni (h, k), una (n _hk, l _hk) linea strato è una combinazione lineare di due vettori di base (n = _10, l ₁₀₎ e (n _01, l _01), che sono i valori di n e l le due linee principali strato (1, 0) e (0, 1). litri è disponibile presso l'altezza della linea strato misurato lungo l'asse Z la trasformata di Fourier. Il valore di n può essere stimato utilizzando la seguente equazione ¹⁰

πRr ≈ J _n ≈ 1.1 | n | -0,9 .....................( 1)

dove J _n è la funzione di Bessel, che determina l'intensità della linea n ^° strato, r è il raggio dell'oggetto elicoidale, e R è il raggio della massima ampiezza della linea strato. Il numero di riga strato, l, è legato al n per la regola di selezione ¹¹

l = tn + um ....................( 2)

dove t e u sono costanti dell'elica. Per qualsiasi elica data, ci possono essere unità esattamente u esattamente (o molto vicino) t complete giri.

1. Box in un tubo relativamente dritto e lungo con diametro uniforme utilizzando il programma di EMAN ¹² helixboxer e salvare l'immagine in formato MRC.
2. Determinare la distanza elicoidale ripeto, c, utilizzando un cross-correlazione programma basato, come 'imgccf', nel pacchetto MRC ^13.
3. Calcolare la trasformata di Fourier con una lunghezza nuova scatola che è parte integrante della distanza ripeto, c.
4. Scegliere due linee principali strati che definiscono due vettori di base reticolo superficiale (1,0) e (0,1).
5. Misurare il raggio del tubo, r, e l'altezza e il raggio delle due linee principali strato in trasformata di Fourier, L _10, R _10, L ₀₁ ​​R _01, rispettivamente (Fig. 1).
6. Calcolare n ₁₀ e n ₀₁ secondo l'equazione (1).
7. Dal momento che n valori sono solo stime, alcune combinazioni di n _{10 en 01} sono testati nelle fasi successive (vedere il punto 4.2) per trovare la corretta simmetria elicoidale IHRSR utilizzando il pacchetto di programmi.
8. Calcolare la simmetria vite descritto da due numeri reali: la rotazione tra subunità (Δφ) e la crescita assiale (Δz) di one-stella elica (n = 1). Dato l _10, l _01, n _10, n ₀₁ e ​​valori, u e t può essere ottenuta con test un intervallo di valori m (per esempio, -50 <50) secondo la regola di selezione. Infine, Δφ e Δz sono calcolati utilizzando Δφ = 360 t / u e Δz = c / u.

4. Ricostruzione tridimensionale

1. Particelle di segmentazione
   1. Aprire una micrografia contenente particelle elicoidale, con il Boxer grafica del programma, che è un programma nel pacchetto EMAN.
   2. Tagliare la particella elicoidale in segmenti che si sovrappongono. Nel pannello di controllo di Boxer, scegliete la modalità Helix e impostare i parametri per il pugilato: la dimensione della casella deve essere maggiore del diametro della particella e il valore per 'Olap' dovrebbe essere ~ 90% della dimensione del box.
   3. Dopo aver lasciato clic su entrambe le estremità della particella elicoidale, Boxer genera automaticamente una serie di caselle particella lungo la lunghezza elica.
   4. Salva segmenti in scatola e le loro coordinate.
2. Iniziale ricostruzione 3D utilizzando programmi IHRSR
   1. Invertire il contrasto della Cryo-EM immagini e applicare filtri passa-basso ¹⁴ (opzionale) prima del trattamento con il metodo iterativo elicoidale reale ricostruzione spazio (IHRSR).
   2. Aprire l'interfaccia grafica del programma IHRSR digitando "Generator". Forniscono l'interfaccia grafica con tutte le informazioni per la pila in scatola particelle, incluso il nome e il percorso dello stack, il numero di immagini in stack, i valori per i parametri di simmetria, ecc Clicca su "Fine" per creare lo script ricostruzione, b25.spi.
   3. Utilizzare un cilindro pieno o vuoto come riferimento iniziale e consentire la procedura di ciclo fino a quando non ci sono cambiamenti nella simmetria vite definito, che si verifica in genere dopo pochi cicli. Una simmetria elicoidale destra dovrebbe dare una ricostruzione stabilmente convergente. La ricostruzione generata nel ciclo verrà utilizzato come riferimento iniziale per un ulteriore affinamento. IHRSR esegue ricostruzione 3D tramite programmi di SPIDER.
3. Ricostruzione con raffinamento iterativo ¹⁵ La ricostruzione 3D generato da IHRSR è ora utilizzato come riferimento iniziale per ulteriore affinamento. Durante la raffinatezza, la simmetria elicoidale è fissata a Δφ e Δz, che sono determinati dalla procedura IHRSR.
   1. Determinare la defocus e presente astigmatismo nella micrografia utilizzando programmi CTFFIND3 e CTFTILT ^16.
   2. Moltiplicare i segmenti delle particelle dal CTF utilizzando programmi SPIDER ^17. L'operazione denominata FT nella suite SPIDER è utilizzata per calcolare la trasformata di Fourier (FFT) dell'immagine 2D. Successivamente, la FFT è moltiplicato per i valori CTF, determinati nei passi precedenti, con l'operazione denominata MU all'interno della suite SPIDER. Il valore ottenuto viene poi trasformata inversa di nuovo per formare una nuova immagine (CTF-corrected) nello spazio reale utilizzando l'operazione SPIDER, FT di nuovo.
   3. Eseguire corrispondenza proiezione confrontando proiezioni dei volumi di riferimento con il CTF-correzione delle immagini, con riferimento multi-allineamento. La variazione in out-of-plane angolo di inclinazione è limitata a + / -10 ° e campionato di 1 °. Introdurre vincoli, come ad esempio i coefficienti di correlazione elevata, nel piano angoli vicino a 0 ° o 180 ° e limitati x-turni, per i parametri di allineamento di ogni segmento. Includere nella ricostruzione solo i segmenti che soddisfano i vincoli.
   4. Dopo ogni ciclo iterativo raffinatezza, una ricostruzione 3D viene generato utilizzando la proiezione posteriore e somma divisa per il CTF2.
   5. Imporre la simmetria elicoidale di generare un volume simmetrizzate. Il raffinamento iterativo termina quando nessun ulteriore miglioramento nella risoluzione della nuova ricostruzione 3D si verifica.
   6. L'elaborazione dell'immagine SPIDER pacchetto viene utilizzato per la maggior parte dei passi di raffinamento. Una serie di operazioni sono controllate da script SPIDER, che sono file creati dall'utente controllo batch contenente sequenze di operazioni e di valori dei parametri. La ricostruzione finale viene calcolato utilizzando programmi in SPIDER suite.

5. Rappresentante dei risultati:

Un singolo di HIV-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) era fuori in scatola e la sua trasformata di Fourier (Fig. 1b) è stata calcolata per l'indicizzazione elicoidale. Per linee strato (1, 0) e (0, 1), l ₁₀ = 28, l ₀₁ = 37, R ₁₀ = 55, R ₀₁ = 44. Dato un raggio del tubo di 211.57Å, abbiamo approssimato n ₁₀ =- 12, n ₀₁ = 11 (qui, la prepotenza era predeterminato). Con una distanza di ripetere 5195.48Å, la simmetria vite del tubo è stato determinato come Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz e Δφ erano raffinato per 7.1321Å e 328,86 ° con IHRSR (Fig. 2a) e la ricostruzione iniziale è mostrato in fig. 2b. La ricostruzione finale (Fig. 3), dopo il raffinamento iterativo, ha migliorato la mappa densità significativamente dal modello iniziale calcolato con IHRSR (Figura 2b).

Figura 1. Indicizzazione di HIV-1 tubo CA elicoidale. (A) Un singolo virus HIV-1 CA immagine tubo A92E. Scala grafica, 30 nm. (B) La trasformata di Fourier del tubo mostrato in (A). Gli indici elicoidale (n = ₁₀ =- 12, n ₀₁ = 11) sono indicati. I punti di punta di freccia alla linea di livello alla risoluzione 23A.

Figura 2. Una prima ricostruzione utilizzando IHRSR. (A) simmetria determinazione a vite per ogni ciclo iterativo. Δφ e Δz, a partire dai valori iniziali, convergono ai valori stabili dopo 10 cicli iterativi raffinatezza. (B) La mappa 3D di densità iniziale dopo 10 cicli iterativi.

Figura 3. La mappa 3D di densità dopo il raffinamento iterativo. (AC) La mappa densità di CA tubi viene visualizzato come tre fette ortogonali: parallela all'asse del tubo e vicino alla superficie (A), perpendicolare all'asse del tubo (B), e la parallela e attraverso l'asse del tubo (C) . Barre di scala, a 10 nm. (D) il rendering di superficie della mappa 3D di densità sagomato a 1.8s racchiude 100% vol.

Discussione

Vi presentiamo una serie di protocolli per fornire un approccio diretto per ottenere strutture 3D di oggetti elicoidali. Usando le procedure descritte, abbiamo acquisito una struttura 3D di HIV-1 di assemblaggio del capside da un'immagine singolo tubo (176 segmenti). Strutture ad alta risoluzione può essere ottenuto inserendo i dati delle immagini più.

Ci sono diversi punti critici per ottimizzare la raccolta e analisi dei dati: in primo luogo, durante la preparazione di un Cryo-EM campione, la soluzione campione deve essere cancellato, lasciando una divisa, sottile strato di soluzione che è leggermente più spesso rispetto alla dimensione del campione. Ci sono diversi modi per cancellare il campione. Per le cellule batteriche e campioni tubolari, come l'HIV-1 CA di montaggio, cancellando da un lato, in particolare dal lato posteriore, è più appropriato.

In secondo luogo, la prepotenza della spirale deve essere determinato, in quanto questo non può essere fatto con l'indicizzazione elicoidale o ricostruzione. Una pratica comune è quella di utilizzare freeze-etching, seguita da rotante shadowing ¹⁸ a determinare la manualità. Manualità può essere determinata anche post-ricostruzione quando la risoluzione della mappa di densità è sufficientemente alto, i modelli 3D atomici dei singoli componenti dovrebbe inserirsi bene nella mappa della densità quando una manualità corretta è assunto. Altrimenti, la prepotenza opposto dovrebbe essere assunto.

In terzo luogo, un filtro Wiener deve essere usato durante l'elaborazione delle immagini, sia per la correzione di fase e ampiezza, per ridurre l'amplificazione del rumore. Dal momento della CTF da una singola immagine è sempre zero crossing, parte delle informazioni nello spazio reciproco è perduto. Pertanto, è necessario disporre di dati più set di proiezione 3D incluso per la ricostruzione, ognuno ripreso a valori defocus diversi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Fonte	Commenti
Glow-scarico dispositivo 100X	Glow-scarico dispositivo 100X
Tecnai Polara F30 microscopio con una pistola Field Emission	FEI, Hillsboro, OR
Gatan 4K x 4K telecamera CCD	Gatan, Pleasanton, CA
Tuffo-congelamento dispositivo		Fatto in casa manuale stantuffo gravità
Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-carbonio griglie di rame	Quantifoil Micro Strumenti, Jena, Germania
EM software EMAN	http://blake.bcm.edu/EMAN/
EM software IHRSR	http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /	Programmi disponibili da Edward H. Egelman
EM software Spider	http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
MRC base elicoidale software di elaborazione	http://www.riken.jp/biostrmech/index.html	Programmi disponibili da Koji Yonekura
CTFFIND3/CTFTILT e Real-space software raffinatezza elicoidale	http://emlab.rose2.brandeis.edu/software