Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Özet

Bu makale kriyo-elektron mikroskobu ile helisel monte moleküllerin üç boyutlu (3D) yapısı elde etmek için bir yöntem açıklanır. Bu protokol, HIV-1 kapsid meclisleri iteratif sarmal gerçek uzay rekonstrüksiyon yöntemi ile bir yoğunluk haritası ulaşmak için ayrıntılı 3 boyutlu rekonstrüksiyon prosedürü göstermek için kullanın.

Özet

Görüntü işleme ile birlikte Cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM), makromoleküler protein kompleksleri ve meclislerinin yapısı tayini için giderek daha güçlü bir araç. Aslında, tek parçacık elektron mikroskobu (2D) iki boyutlu elektron kristalografisi ² nispeten rutin metodolojileri ve çok sayıda yapılar haline gelmiştir ¹ ve bu yöntemler kullanılarak çözüldü. Aynı zamanda, görüntü işleme ve helis nesneleri üç boyutlu (3B) rekonstrüksiyonu, özellikle sarmal sarmal simetri ile birlikte tek parçacık analiz araçları kullanır gerçek-uzay rekonstrüksiyon (IHRSR) yöntemiyle ^3, iteratif hızla gelişmiştir. Sarmal bir varlık 3D yoğunluk haritası, tek bir projeksiyon elde edilebilir, çünkü pek çok biyolojik varlıklar, ipliksi ya da sarmal formları da dahil olmak üzere aktin ^filamentler 4, ^{mikrotüplerin} 5, amiloid ^lifleri 6, tütün mozaik ^virüsü 7, ve bakteri ^kamçısı 8, ve fonksiyon IHRSR yöntemi ile sarmal olmayan bir nesnenin 3D yeniden inşası için gerekli olan çok sayıda resim, esnek ve düzensiz sarmal meclislerinin yapısal analizi ile karşılaştırıldığında görüntü, şimdi ulaşılabilir.

Bu video makalede, cryo-EM cryo-EM numune hazırlama, düşük doz veri toplama protokoller de dahil olmak üzere bir sarmal protein montaj 3D yoğunluk haritası (HIV-1 kapsid ⁹ bizim örneğimizde), indeksleme elde etmek için detaylı protokolleri sarmal kırınım desenleri ve IHRSR kullanarak görüntü işleme ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, cryo-EM yakın doğal koşullar altında en iyi örnek koruma sunar. Örnekleri vitreus buz ince bir tabaka halinde hızlı dondurma, gömülü ve radyasyon hasarı en aza indirmek için düşük doz koşulları altında, sıvı azot sıcaklığında elektron mikroskopları imaged. Örnek görüntüler, düşük sinyal ve düşük kontrast kaydedilen mikrograflar pahasına yakın yerli koşullar altında elde edilir. Neyse ki, helisel yeniden yapılanma sürecini büyük ölçüde sarmal kırınım endeksleme dışında, otomatik olmuştur. Burada bir yaklaşım anasayfası sarmal yapısını tanımlamak ve sayısallaştırılmış mikrograflar, 3D helisel yeniden inşası için önemli bir adım sarmal simetriler (helisel parametreleri) belirlemek. Kısaca, biz IHRSR yöntemi uygulayarak ilk 3D yoğunluk haritası edinin. Bu ilk harita sonra iteratif böylece özgürlük derece kontrol, her segment hizasını parametreleri için kısıtlamalar getirerek rafine edilir. Elektron mikroskobu (genlik ve faz düzeltme) kontrast transfer fonksiyonu (CTF) düzelterek ve montaj sarmal simetri optimize ederek daha da iyileştirilmesi sağlanır.

Protokol

1. Frozen-sulu EM numune hazırlama

HIV-1 kapsid protein (CA) derlemeleri ⁹ cryo-EM görüntüler güçlü bir arka plan gürültü katkıda bulunan yüksek tuz (NaCl) 1M tampon, sadece kararlı olduğundan, biz geçici tuzu azaltmak için hızlı bir seyreltme ve arka tarafında blot yöntemi kullanın konsantrasyonu dondurulmuş sulu EM ızgara hazırlanıyor.

1. 25 saniye için 200-örgü R2 / 1 Quantifoil bakır ızgaralar 25mA altında Glow deşarj karbon tarafında.
2. % 80 nem, ev yapımı bir el yerçekimi piston, çevre odasında getirmek için bir nebülizatör kullanın.
3. FEI Vitrobot Piston Dewar, sıvı nitrojen kullanarak serin sıvı etan. Dalma dondurma Dewar manuel yerçekimi piston üzerine monte edin.
4. Forseps üzerine monte edilmiş ızgara, karbon yüzüne 2.5 ul önceden monte edilmiş CA çözüm uygulayın ve forseps karbon yüzü size dönük ızgara piston üzerine yük.
5. Izgara, arka tarafına, düşük tuz seyreltme tamponu (100 mM NaCl) 3 ul ekleyin ve filtre kağıdı bir parça ızgara arka tarafında hemen kurulayın. Izgara tüm arka yüzeyine filtre kağıdı çıkarmadan önce, yaklaşık 6 saniye filtre kağıdı ile yakın temas halinde olmalıdır. Izgara filtre kağıdı çıkardıktan sonra hemen sıvı etan içine dalıyoruz.
6. Piston forseps çıkarın ve ızgara ızgara saklama kutusu içine hızlı bir şekilde aktarmak.

2. CA borulu Cryo-elektron mikroskobu

1. 200kv FEI Polara G2 elektron mikroskobu işletim dondurulmuş sulu ızgara Yük ve Gatan 4Kx4K CCD kamera ile donatılmıştır.
2. Düşük doz arama modu, ~ 200x büyütme altında ve bir doz <0.001e ^- / Å ^2, ekran uygun buz ve bir aşama dosyasını bu alanların konumları kaydetmek alanlar için tüm ızgara.
3. Düşük doz arama modunda 3900 x büyütme kayıtlı pozisyonları ve bu alanlarda daha fazla ekran hatırlayın. Veri toplama, delik üzerinde iyi ayrılmış, uzun tüpler içeren buz düzgün, ince bir tabaka ile alanları seçin. Ikinci bir aşama dosyasını bu alanların yerleri kaydedin.
4. 59.000 x büyütme, içerlek 100 mikron objektif diyafram pozlama modu Switch ve ~ 15 e bir doz için objektif stigmatism ve ışın yoğunluğunu ^ayarlayın başına / Å ² poz.
5. Düşük doz arama moduna dönün, kayıtlı bir konuma taşımak ve CCD kamera kullanarak iyi bir tüp belirlemek ve merkez. Odak moduna geçer, odak ayarlamak ve bulanıklaştırma değerini ayarlamak, normalde arasında 0,5 - 2,5 mm. Pozlama modu Switch, 15 e bir doz, 0.3-0.5 saniyelik bir pozlama süresi seti ^{- 2} / a, ve bir görüntü toplamak. Bir tabak kamera görüntüleri toplanır ve bir pozlama çekilmeden önce filmler 10 saniye boyunca yerleşmek için izin verilmelidir.
6. Sonraki kaydedilen pozisyona taşıyın ve daha fazla görüntü toplamak için 5. adımı yineleyin.
7. Filmler, 12 dakika için tam güç D19 geliştirilen ve 6.35 mikron piksel boyutu Nikon Super COOLSCAN 9000 ED, tarayıcı ile dijital. Görüntü dosyalarının formatı TIFF.

3. Helisel indeksleme

Sarmal bir nesne iki parametre endeksli olabilir: Bessel sipariş, n, ve katman hattı sayısı, l. Fourier dönüşümü (n, l) ile karakterize Her katman, 2D bir kafes notasyonu kullanarak, (h, k) endeksleri ifade sarmal nesnenin yüzey kafes çizgiler kümesi karşılık gelir. Herhangi bir (h, k), bir (n _HK, l _HK) katmanı hattı, n ve l değerleri iki temel vektörleri _(n = 10, _{l 10)} ve (n ₌ 01, _l 01), doğrusal bir kombinasyonu başlıca iki tabaka hatları (1, 0) ve (0, 1) l, Fourier dönüşümü, Z ekseni boyunca ölçülen tabaka satır yüksekliği elde edilebilir. N değeri aşağıdaki denklem ¹⁰ kullanılarak tahmin edilebilir

πRr ≈ J _n ≈ 1.1 | n | -0.9 .....................( 1)

J _n ^n'inci katman hattının yoğunluğunu belirleyen Bessel fonksiyonu, nerede, r yarıçapı sarmal nesne ve katman hattının maksimum genlik R yarıçapı. Katman satır numarasını, l, n seçim kuralı ¹¹ ile ilgili

l = tn + um ....................( 2)

t ve u sarmal sabitler. Herhangi bir sarmal için, (ya da çok yakından) aynen t c tam u birimleri olabiliromplete döner.

1. EMAN programı ¹² helixboxer ve MRC formatında görüntü kaydetmek kullanarak düzgün bir çapa ile nispeten düz ve uzun bir tüp dışarı Kutusu.
2. MRC paketi ¹³ 'imgccf' gibi çapraz korelasyon tabanlı bir program kullanarak sarmal tekrar mesafe, c, belirleyin.
3. Fourier dönüşümü, tekrar mesafe, c ayrılmaz yeni bir kutu süresini hesaplayın .
4. Iki temel yüzey örgü vektörleri (1,0) ve (0,1) iki temel tabaka hatları seçin.
5. Tüp yarıçapı, r, Fourier dönüşümü, l _10, R _10, sırasıyla l ₀₁ R _01, (Şekil 1), iki ana katman hatları yükseklik ve yarıçapı ölçün .
6. N ₁₀ ve n _01, denklem (1) 'e göre hesaplayın.
7. N değerleri yalnızca tahmin olduğundan, birkaç kombinasyonları n ₁₀ ve n ₀₁ program paketi IHRSR kullanarak doğru sarmal simetri bulmak için (4.2 adım) daha sonraki adımda test edilmektedir .
8. Alt birimden (Δφ) ve tek-yıldızlı sarmalın eksenel artış (Δz) (n = 1) arasında rotasyon iki gerçek sayının tarafından açıklanan vida simetri hesaplayın. L _{10, 01,} l n = ₁₀ ve n ₀₁ değerleri göz önüne alındığında, u, t, m değerleri aralığı (örneğin, -50 <50) seçim kuralına göre test elde edilebilir Son olarak, Δφ ve Δz kullanılarak hesaplanmıştır Δφ = 360 t / u ve Δz = c / u.

4. Üç boyutlu rekonstrüksiyon

1. Parçacık segmentasyon
   1. EMAN paket bir program grafik programı Boxer, kullanarak, sarmal parçacıklar içeren bir mikrografı açın.
   2. Sarmal parçacık örtüşen bölümler halinde kesin. Boxer kontrol paneli, Helix modunu seçebilir ve boks için parametreleri ayarlayın: kutusunun boyutu, partikül çapı ve 'Olap' kutusu boyutu ~% 90 olmalıdır değeri daha büyük olmalıdır.
   3. Sarmal parçacığın her iki uçta da sol tıkladıktan sonra, Boxer sarmalın uzunluğu boyunca bir dizi parçacık kutuları otomatik olarak üretecektir.
   4. Kutulu segmentleri yanı sıra onların koordinatlarını kaydedin.
2. İlk 3 boyutlu rekonstrüksiyon IHRSR programları kullanarak
   1. Cryo-EM görüntülerin kontrast ters çevirin ve iteratif sarmal gerçek uzay rekonstrüksiyon yöntemi (IHRSR) ile işleme önce ¹⁴ (isteğe bağlı) filtreleme alçak geçiren uygulamak.
   2. "Generator" yazarak grafik arayüzü IHRSR programı açın. Kutulu parçacıklar yığınının adını ve yolunu yığın yığın görüntülerin sayısı da dahil olmak üzere tüm bilgi, grafik arayüzü sağlayın, simetri parametreler için değerler, vb yeniden yapılanma komut dosyası oluşturmak için "Finish" düğmesine tıklayın. b25.spi.
   3. Katı veya içi boş silindir ilk bir referans olarak kullanın ve genellikle birkaç döngüsünden sonra oluşur tanımlanan vida simetri hiçbir değişiklik olana kadar geçiş yapmak için prosedür izin. Doğru bir sarmal simetri stably bir tümleşik yeniden yapılanma vermelidir. Son döngüsünde oluşturulan yeniden yapılanma için bir başlangıç ​​daha fazla arıtma referans olarak kullanılacaktır. IHRSR ÖRÜMCEK programları kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon gerçekleştirir.
3. Iteratif arıtma ¹⁵ ile İmar IHRSR tarafından oluşturulan 3 boyutlu rekonstrüksiyon artık ek bir arıtma için ilk referans olarak kullanılır. Arıtma sırasında, sarmal simetri Δφ ve Δz, IHRSR prosedürü belirlenir sabittir.
   1. Odak ve astigmatizma mevcut programları CTFFIND3 ve CTFTILT ¹⁶ mikrografı belirleyin.
   2. ÖRÜMCEK programları kullanarak ¹⁷ CTF parçacık segmentleri çarpın. ÖRÜMCEK suite FT olarak adlandırdığı operasyon 2B görüntü Fourier dönüşümü (FFT) hesaplamak için kullanılır. Bundan sonra, FFT ÖRÜMCEK paketi içinde MU olarak adlandırılan işlemi kullanarak, önceki adımlarda belirlenen, CTF değerleri ile çarpılır. Elde edilen değer, daha sonra ters ÖRÜMCEK işlemi kullanarak gerçek uzayda yeni bir resim (CTF düzeltilmiş) formuna geri dönüştürülmüş, FT tekrar.
   3. Çok referans hizalama kullanılarak referans hacimleri projeksiyonları, CTF-düzeltilmiş görüntüleri karşılaştırarak projeksiyon eşleşen gerçekleştirin. Düzlem-dışı eğim açısı değişimi + / -10 ° ve 1 ° adımları örneklenir. Her segmentin hizalama parametreler için, bu tür yüksek korelasyon katsayıları gibi sınırlamalar, 0 ° veya 180 °, ve x-vardiya sınırlı yakınında düzlem açıları tanıtın. Kısıtlamaları karşılamak yeniden yapılanma, sadece bu bölümlerini içerir.
   4. Her arıtma döngüsü yinelemeli sonra, 3D rekonstrüksiyon CTF üzerinden toplamı geri projeksiyon kullanarak üretilen ve bölünmüş.2.
   5. Sarmal simetri simetrik olmadı hacmi oluşturmak için uygulanmalıdır. Yeni 3 boyutlu rekonstrüksiyon çözünürlükte daha fazla iyileşme meydana geldiğinde iteratif arıtma sonlandırıldı.
   6. Görüntü işleme paketi ÖRÜMCEK arıtma adımları çoğu için kullanılır. Bir dizi operasyon, operasyon ve parametre değerleri dizileri içeren kullanıcı tarafından oluşturulan toplu denetim dosyaları ÖRÜMCEK scriptleri, tarafından kontrol edilir. Nihai yeniden yapılanma ÖRÜMCEK suite programları kullanılarak hesaplanır.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Tek bir HIV-1 CA A92E tüp (Şekil 1a) kutulu çıkışı ve onun Fourier dönüşümü (Şekil 1b) sarmal indeksleme için hesaplandı. L ₁₀ tabaka hatları (1, 0) ve (0, 1) = 28, ₀₁ L = 37, R ₁₀ = 55, R ₀₁ = 44. 211.57Å bir tüp yarıçapı göz önüne alındığında, biz yaklaştırılmış n ₁₀ = 12, n ₀₁ = 11 (burada, ellilik önceden belirlenmiş). 5195.48Å tekrar mesafesi ile, tüp vidalı simetri Δz olarak belirlendi = 6.8093Å Δφ = 328,88 °. Δz ve Δφ 7.1321Å ve 328,86 rafine ° IHRSR (Şekil 2a) ve ilk rekonstrüksiyon Şekil kullanarak. 2b. Nihai yeniden yapılanma (Şekil 3), arıtma yinelemeli sonra, IHRSR (Şekil 2b) ile hesaplanan ilk model yoğunluk haritası önemli ölçüde geliştirilmiş.

Şekil 1, HIV-1 CA helisel tüp Endeksleme . (A) tek bir HIV-1 CA A92E tüp görüntü. Ölçeği bar, 30 nm. (B) (A) gösterilen tüp Fourier dönüşümü. Helisel indeksleri (n = ₁₀ = 12, n ₀₁ = 11) gösterilir. 23a çözünürlükte katman çizgiye ok ucu noktaları.

Şekil 2 IHRSR kullanan bir ilk rekonstrüksiyon. (A) her yinelemeli döngüsü için Vida simetri belirlenmesi. 10 arıtma döngüleri iteratif Δφ ve Δz sonra, ilk değerlerinden başlayarak, sabit değerler yakınsar. (B) 10 saniye sonra ilk 3D yoğunluk haritası döngüleri yinelemeli.

Şekil 3. Iteratif arıtma sonra 3D yoğunluk haritası. (AC) CA tüplerin yoğunluğu haritası üç ortogonal dilim olarak görüntülenir: tüp eksenine paralel ve dik tüp ekseni (B), yüzey (A) yakın ve paralel olarak tüp ekseni (C) aracılığıyla . Ölçek barlar, 10 nm. (D)% 100 hacim içine 1.8s 3D yoğunluk haritası Yüzey render konturlu.

Tartışmalar

Biz sarmal nesnelerin 3D yapılar elde etmek için basit bir yaklaşım sağlamak için bir dizi protokoller mevcut. Açıklanan prosedürleri kullanarak, tek bir tüp görüntü (176 parça), HIV-1 kapsid montaj 3 boyutlu bir yapı elde etti. Yüksek çözünürlüklü yapıları, daha fazla görüntü verilerinin de dahil elde edilebilir.

En uygun veri toplama ve analiz için pek çok kritik nokta vardır: Birincisi cryo-EM örneğinin hazırlanması sırasında, örnek çözümü örneklem büyüklüğü biraz daha kalın bir çözüm üniforma, ince bir tabaka bırakarak uzakta, lekelenen olmalıdır. Örnek blot için birkaç farklı yolu vardır. Bakteri hücreleri ve HIV-1 CA montaj gibi borulu örnekler, özellikle arka-yan, bir tarafı blot için çok uygundur.

İkincisi, sarmalın ellilik bu sarmal indeksleme ya da yeniden yapılamaz olarak tespit edilmesi gerekiyor. Döner ellilik belirlemek için ¹⁸ gölgeleme takip dondurma yakma, ortak bir uygulama kullanmak için. Ellilik, yoğunluk haritası çözünürlük yeterince yüksek olduğunda da yeniden yapılandırma sonrası tespit edilebilir, doğru bir ellilik varsayılır bileşenleri tek tek 3 boyutlu atom modelleri de yoğunluk haritasına uygun olmalıdır. Aksi takdirde, bunun tam tersi ellilik kabul edilmelidir.

Üçüncü olarak, Wiener filtresi, gürültüyü amplifikasyon azaltmak için, her iki faz ve genlik düzeltme için görüntü işleme sırasında kullanılan olmalıdır. Tek bir görüntü CTF her zaman sıfır geçişleri bu yana, karşılıklı alan bilgilerin bir kısmını kaybetmiş. Bu nedenle, farklı odak dışı değerleri 3D rekonstrüksiyon, her görüntülü dahil birden fazla projeksiyon veri setleri için gereklidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Kaynak	Yorumlar
100X Kızdırma deşarj	100X Kızdırma deşarj
Tecnai Polara Field Emission Gun F30 mikroskop	FEI, Hillsboro, OR
Gatan 4K x 4K CCD kamera	Gatan, Pleasanton, CA
Dalma-donma cihaz		Ev yapımı el yerçekimi piston
Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-karbon, bakır ızgaralar	Quantifoil Micro Araçlar, Jena, Almanya
EM yazılımı EMAN	http://blake.bcm.edu/EMAN/
EM yazılımı IHRSR	http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /	Edward H. Egelman Programlar
EM yazılımı Örümcek	http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
MRC merkezli helisel işleme yazılımı	http://www.riken.jp/biostrmech/index.html	Koji Yonekura Programlar
CTFFIND3/CTFTILT ve Gerçek uzay sarmal arıtma yazılımı	http://emlab.rose2.brandeis.edu/software