الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

Summary

يوصف منهج موثوق بها ومفيدة للكشف عن تعديلات بسيطة على الجينات النباتية محددة. نهج يجمع بين لونين مناعي (رقاقة) في الوقت الحقيقي وPCR الكمي. فإنه يسمح الكشف عن تعديلات بسيطة على جينات معينة لها دور في العمليات الفسيولوجية المختلفة.

Abstract

هيكل لونين من المهم لتنظيم التعبير الجيني في حقيقيات النوى. في هذه العملية ، إعادة عرض لونين ، الحامض النووي ، والتساهمية التعديلات على ذيول الأميني من محطة H3 H4 histones وتلعب أدوارا أساسية ^1-2. H3 H4 وتشمل التعديلات هيستون مثيلة ليسين وأرجينين ، أستلة من ليسين ، والفسفرة مخلفات سيرين ^1-2. وترتبط هذه التعديلات إما مع تنشيط الجينات ، والقمع ، أو دولة معبى من الجين الذي يعتمد التنشيط أكثر سرعة وقوة في التعبير بعد إدراك الإشارات المناسبة (ميكروب المرتبطة بأنماط الجزيئية ، والضوء ، والهرمونات ، وغيرها) ^3-7.

هنا ، فإننا نقدم وسيلة للكشف عن موثوقة وحساسة من تعديلات محددة على لونين جينات النباتات المختارة. وتستند هذه التقنية على يشابك من (تعديل) والحمض النووي histones مع ^8،9 الفورمالديهايد ، واستخراج وصوتنة من لونين ، لونين مناعي (رقاقة) مع الاجسام المضادة المحددة تعديل ^9،10 ، دي يشابك المجمعات الدنا هيستون ، و جينات محددة في الوقت الحقيقي PCR الكمي. وقد أثبت هذا النهج مفيدا للكشف عن تعديلات بسيطة محددة مرتبطة C ₄ الضوئي ^5،11 في الذرة والحصانة الشاملة في ³ Arabidopsis.

Protocol

1. يشابك من المواد النباتية

1. الحصاد 1 - 2G من أوراق Arabidopsis (6 إلى قطرها 10cm ريدة) في أنبوب بلاستيكي 50 مل وملء ما يصل الى 40mL مع العازلة يشابك.
2. تأكد يترك البقاء مغمورة ، على سبيل المثال عن طريق حشو a مصممة الحق الاسفنج تصفية فوق سطح العازلة. ثم ضع الأنابيب في مجفف.
3. فراغ التسلل ل10min. إضافة إلى كل أنبوب 2.5mL من جليكاين 2M لوقف يشابك ، وعكس أنابيب لتبرير تشتت جليكاين على قدم المساواة.
4. فراغ 5min التسلل لآخر وتجاهل السائل في حين حصد يترك على منخل.
5. تغسل أوراق مرتين مع 1L المياه في كوب من الزجاج ، ثم يترك ليجف تماما مناشف ورقية.
6. جمع الأوراق في أنبوب بلاستيكي الطازجة والتجميد في النيتروجين السائل. تخزين الأوراق في عزلة -80 درجة مئوية حتى لونين.

2. عزلة لونين

1. كانت الأرض يترك مع مدافع الهاون والمدقة التي تم حفظها في النيتروجين السائل حتى الاستخدام.
2. نقل مسحوق لأنبوب بلاستيكي 50 مل وتعليق العازلة في استخراج 30mL # 1.
3. لاحتضان 15min في 4 درجات مئوية على شاكر في سماء المنطقة.
4. رشاحة تعليق من خلال أربع طبقات من miracloth في أنبوب جديد من البلاستيك 50 مل.
5. تدور في ل20min XG 2800 في 4 درجات مئوية.
6. إزالة ووقف بيليه طاف مع فرشاة الطلاء العازلة في استخراج 1mL # 2. أول إضافة كمية صغيرة من المخزن رقم 2 ، ثم وقف مع بيليه فرشاة الدهان ، ومن ثم إضافة بقية العازلة.
7. تعليق لنقل أنبوب microfuge 1.5mL وتدور في ل10min 12000 XG في 4 درجات مئوية.
8. وفي الوقت نفسه ، وإعداد 2mL - microfuge الأنابيب العازلة التي تحتوي على 1.5mL استخراج # 3.
9. طاف إزالة أنبوب من نسج (الخطوة 2.7) ووقف بيليه في 300μL العازلة من استخراج # 3. أولا إضافة كمية صغيرة من المخزن رقم 3 ، تعليق بيليه مع فرشاة الدهان ، ومن ثم إضافة العازلة المتبقية.
10. بعناية الماصة الموقوف بيليه (الخطوة 2.9) على أعلى من استخراج 1.5 مل العازلة # 3 أعدت في الخطوة 2.8. تأكد من مرحلتين وعدم الاختلاط. تدور في ل1H 16000 XG في 4 درجات مئوية.
11. إزالة طاف بيليه وتعليق لونين مع فرشاة الدهان في 300μL من صوتنة العازلة.
12. يصوتن لونين مع sonotrode ، أو في حمام بالموجات فوق الصوتية ، إلى حجم الحمض النووي ل400bp تقريبا. عندما sonicating ، وجعل لونين لا شك سوف تكون ساخنة فوق 30 درجة مئوية تقريبا لحماية حساسة للحرارة crosslinks. مدة صوتنة يجب أن يكون تجريبيا ، لأنه يختلف اختلافا كبيرا بين الأجهزة صوتنة مختلفة. للتوجيه ، وتقدم ضبط جهازين مختلفين :

لصوتنة مع العلامة التجارية لونين Bandelin فضح sonotrode في أنبوب microfuge 0.6mL خمس مرات إلى 20 رشقات نارية مع إعدادات الطاقة بنسبة 25 ٪ ، ودورة = 50. عند القيام بذلك ، عينة باردة بعد كل رشقات نارية ^ال 20 في حمام جليدي.

لصوتنة مع حمام Bioruptor Diagenode بالموجات فوق الصوتية ، وملء حوض الاستحمام بالماء والثلج ويصوتن عشر مرات لمدة 30 ثانية في أنابيب microfuge 1.5mL مع الإعداد "مرتفع". بعد كل 30 ثانية ، وعينات أخرى لتبريد 30 ثانية.

13. sonicated تدور في عينة ل5min ز 16000 في 4 درجات مئوية لترسيب المواد غير منحل. ويمكن مباشرة طاف تستعمل لمناعي. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون الصدمة عينات مجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

3. مناعي

1. إعداد أنابيب microfuge 2 مل تحتوي على البروتين و40μL. agarose و1.8mL من الأجسام المضادة ملزم العازلة إضافة 200μL إعداد لونين (الخطوة 2.13).
2. أنابيب لاحتضان 1H على شاكر في سماء المنطقة.
3. تجاهل البروتين - A الخرز agarose واستخدام طاف للمناعي.
4. إزالة 40μL - قسامة لتحديد تركيز لونين ('إدخال').
5. إضافة 30μL البروتين - A. agarose وكمية الأجسام المضادة المحددة التعديل الذي هو مبين في الجدول أدناه محددة من الكواشف والمعدات اللازمة لونين 400μL تعليق sonicated
6. احتضان ليلة وضحاها أو 2.5h على شاكر العامة في 4 درجات مئوية.
7. تدور باستمرار في حبات ل2min ز س 440
8. تغسل حبة بيليه مع 900μL كل العازلة يغسل (انظر القائمة أدناه). لكل العازلة ، الخرز احتضان في المنطقة العازلة ل10min شاكر على النفقات العامة في 4 درجات مئوية ، وتدور في ذلك الحين ل2min 440 XG ، تجاهل طاف ، وإضافة العازلة المقبل.
   1. العازلة منخفضة الملح تغسل
   2. العازلة عالية من الملح يغسل
   3. LiCl غسل العازلة
   4. TE غسل العازلة
9. بعد غسل النهائي ، تماما إزالة أي العازلة المتبقية.

4. دي يشابك من histones والحمض النووي ، وتنقيتها من الحمض النووي عجلت

1. إضافة 100μL اجتثاث يشابك العازلة لبيليه agarose وعينة "الإدخال" ل40μl من الخطوة 3.4 ، مزيج ل5min على خلاط دوامة ، وعينات تدور ، وincuباتي عند 65 درجة مئوية خلال الليل.
2. تنقية الحامض النووي DNA مع مجموعة تجارية أو PCR تنقية.
3. عادة 5μl لتخفيف 01:05 من شطافة العمود الأخير كافية لأداء التقليدية موضع محدد في الوقت الحقيقي الكمية RT - PCR (RT - qPCR).

5. جدول المخازن المؤقتة

يشابك العازلة
الصوديوم الزبدات	10MM
السكروز	400mM
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	10MM
β - المركابتويثانول	5mM
الفورمالديهايد	3 ٪ (V / V)

العازلة استخراج # 1
الصوديوم الزبدات	10MM
السكروز	400mM
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	10MM
β - المركابتويثانول	5mM
إكمال البروتياز المانع	1X

استخراج عازلة # 2
الصوديوم الزبدات	10MM
السكروز	250mM
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	10MM
β - المركابتويثانول	5mM
MgCl 2	10MM
تريتون X - 100	1 ٪ (W / V)
إكمال البروتياز المانع	1X

العازلة استخراج # 3
الصوديوم الزبدات	10MM
السكروز	1.7M
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	10MM
β - المركابتويثانول	5mM
MgCl 2	2mm و
تريتون X - 100	0.15 ٪ (W / V)
إكمال البروتياز المانع	1X

صوتنة العازلة
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	25mM
EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0	5mM
SDS	0.5 ٪ (W / V)
إكمال البروتياز المانع	1X

العازلة الضد ملزمة
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	50mM
EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0	1MM
كلوريد الصوديوم	150mM
تريتون X - 100	0.1 ٪ (W / V)

العازلة منخفضة الملح تغسل
كلوريد الصوديوم	150mM
SDS	0.1 ٪ (W / V)
تريتون X - 100	1 ٪ (W / V)
EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0	2mm و
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	20mM

العازلة عالية من الملح يغسل
كلوريد الصوديوم	500mM
SDS	0.1 ٪ (W / V)
تريتون X - 100	1 ٪ (W / V)
EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0	2mm و
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	20mM

LiCl غسل العازلة
كلوريد الليثيوم	250mM
Nonidet - P40	1 ٪ (V / V)
الصوديوم desoxycholate	1 ٪ (W / V)
EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0	1MM
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	20mM

TE غسل العازلة
EDTA - هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0	10MM
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0	1MM

Decrosslinking العازلة
تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 6.8	62.5mM
كلوريد الصوديوم	200MM
SDS	2 ٪ (W / V)
DTT	10MM

6. ممثل النتائج :

التعبير عن الجينات thaliana Arabidopsis الدفاع PR2 ترميز β -وكان المستحث 1،3 - glucanase مع نشاط مضادات الميكروبات ¹² ، قبل benzothiadiazole (BTH) ، والتناظرية الاصطناعية لمصنع حامض الساليسيليك هرمون ^3. الشكل 1 يوضح أن تفعيل PR2 التعبير يرتبط بزيادة في أستلة من بقايا يسين على هيستون H3 H4 وعلى المروج PR2. منذ انخفاض كثافة النيوكليوسومات أثناء تنشيط الجين ¹³ ، وتطبيع قيم أستلة هيستون للإشارة تم الحصول عليها مع أجسام مضادة لمنطقة ثابتة من 3 هيستون.

الشكل 1 BTH يدفع أستلة هيستون على المروج في PR2 Arabidopsis. وعولج النباتات مع BTH 100μM أو السيطرة مسحوق قابل للبلل. بعد 72H ، تم جمع الأوراق وكان معزولا لونين. وكان تطبيع إشارة تم الحصول عليها بعد هطول الأمطار مع الاجسام المضادة المحددة أستلة (كما هو مبين في الشكل) للإشارة التي تم الحصول عليها عن طريق الترسيب مع الضد إلى مجال ثابتة من H3 هيستون. وكان كميا لونين التي عجلت RT - qPCR. بيانات موحدة للمستويات تعديل هيستون في غياب العلاج BTH.

Discussion

أهم الخطوات في البروتوكول هي يشابك من الحمض النووي وhistones ، نوع وكمية المواد ورقة ، وطحن المواد ، وصوتنة من لونين. للاطلاع على مناقشة أكثر تفصيلا لهذه القضايا ، انظر الحكام. 9 و 10.

صوتنة ويشابك :

من المهم أن تعطيل لونين خلال صوتنة إلى شظايا من حوالي 400bp. سوف صوتنة تدمير شاملة لونين من خلال تعطيل الحمض النووي وhistones ، في حين سيغادر صوتنة كافية لونين شظايا طويلة. هذه تؤثر على خصوصية الأسلوب ، لأنه لا يمكن إدخال تعديلات بسيطة القاصية من موضع اختبار يكون هناك تمييز من التعديلات المحلية. يتم اختبار كفاءة صوتنة أفضل من خلال جمع عينات من لونين 20μL قبل وبعد صوتنة الحمض النووي دي يشابك ، وhistones وعزل الحمض النووي وتحديد طول الحمض النووي المنفصمة التي agarose هلام إستشراد. وينبغي أن يضاف إلى ريبونوكلياز عينات قبل الكهربائي ، لأن التحضير لونين لا يزال يحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي في هذه المرحلة من التنقية التي قد تتداخل مع التصور من الحمض النووي مجزأة. نماذج مفيدة للمناعي لونين إذا دنا من لونين غير المنفصمة أطول من 10kbp ، في حين أن الحمض النووي من لونين المنفصمة أشكال مسحة مع كثافة إشارة حول الأقصى 400bp من الحمض النووي.

نستخدم عادة 3 ٪ (V / V) الفورمالدهيد لونين يشابك في أوراق سليمة ، ولكن 1 ٪ (V / V) الفورمالدهيد قد يكون كافيا في معظم الحالات. في أيدينا ، وتركيزات منخفضة الفورمالديهايد تسمح لأوقات أقصر صوتنة الخلفية والإشارات في تفاعلات PCR يترتب على ذلك. ومع ذلك ، كميات كافية من الفورمالديهايد في كثير من الأحيان نتيجة للتكرار منخفضة للإشارة PCR بين التجارب المستقلة. هذا قد يكون راجعا إلى عدم كفاية اختراق يترك مع الفورمالدهايد بتركيزات منخفضة. تأكد من أن البورصة الخاص الفورمالديهايد كثيرا ما يميل إلى مجمع تتبلمر مع مرور الوقت. الفورمالديهايد حلول مستقرة فقط لمدة شهر واحد تقريبا ، وتكاد هذه الفترة لفترات طويلة قبل تحقيق الاستقرار الميثانول. ينصح لاختبار تركيزات مختلفة الفورمالديهايد عند إعداد الشروط التجريبية.

كمية من المواد النباتية وطحن :

من المهم أن التسلل كميات قليلة من المواد لأوراق الشجر في كمية كبيرة من أوراق عازلة لتجنب الالتصاق مع بعضها البعض. أوراق شائكة غالبا ما يؤدي إلى عدم كفاية تسلل الفورمالديهايد. وعلاوة على ذلك ، فإن الكثير من المواد النباتية كتلة مسام النسيج miracloth. كفاءة طحن تعتمد بشكل كبير على استخدام قذائف المورتر ومدقة مع مثاليا. نحن عادة طحن مع النيتروجين السائل تبرد مدقة وهاون في غياب النتروجين السائل إضافية ثلاث مرات لمدة 50 ثانية حتى يتم الارض المادية إلى مسحوق ناعم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
بروتين - A - Agarose	روش	11 134 515 001	يعتمد على الطبقة الأضداد
بروتين - G - Agarose	روش	11 243 233 001	يعتمد على الطبقة الأضداد
مكافحة hyperacetyl - H4	ميليبور	06-946	استخدمنا 5μL
المضادة للأسيتيل H4K5	ميليبور	07-327	استخدمنا 5μL
المضادة للأسيتيل H4K8	ميليبور	07-328	استخدمنا 5μL
المضادة للأسيتيل H4K12	ميليبور	07-595	استخدمنا 5μL
المضادة للأسيتيل H4K16	ميليبور	07-329	استخدمنا 5μL
المضادة للأسيتيل H4K18	ميليبور	07-354	استخدمنا 1μL
المضادة للأسيتيل H3K9	ميليبور	07-352	استخدمنا 5μL
المضادة للأسيتيل H3K14	ميليبور	07-353	استخدمنا 1μL
المضادة للثلاثي ، H3K4	Diagenode	PAB - 003-50	استخدمنا 5μL
المضادة للثنائي ميثيل - H3K4	ميليبور	07-030	استخدمنا 5μL
مكافحة monomethyl - H3K4	Abcam	ab8895	2،5 - 10μL
مكافحة H3	Abcam	ab1791	استخدمنا لفحص كثافة 1μL هيستون
Bioruptor	Diagenode	UCD TO - 200
Sonotrode MS72	Bandelin
Miracloth	Calbiochem	475855
إكمال البروتياز المانع	روش	11836145001