Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

Riepilogo

Un approccio affidabile e utile per rilevare modificazioni degli istoni sui geni impianto specifico è descritto. L'approccio combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e real-time PCR quantitativa. Esso consente il rilevamento di modifiche degli istoni su specifici geni con un ruolo in diversi processi fisiologici.

Abstract

Struttura della cromatina è importante per la regolazione dell'espressione genica negli eucarioti. In questo processo, le modifiche rimodellamento della cromatina, metilazione del DNA, e covalenti sulla code amino-terminali degli istoni H3 e H4 giocano un ruolo essenziale ^1-2. Modificazioni degli istoni H3 e H4 comprendono metilazione di lisina e arginina, acetilazione della lisina, e la fosforilazione di residui di serina ^1-2. Queste modifiche sono associati sia con l'attivazione del gene, la repressione, o uno stato innescato di gene che supporta l'attivazione più rapida e robusta di espressione dopo la percezione dei segnali appropriati (microbi associati modelli molecolari, luce, ormoni, ecc) ^3-7.

Qui, vi presentiamo un metodo per il rilevamento affidabile e sensibile di specifiche modificazioni della cromatina sui geni delle piante selezionate. La tecnica si basa sulla reticolazione di (modificato) istoni e del DNA con formaldeide ^8,9, estrazione e sonicazione della cromatina, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con modifica anticorpi specifici per ^9,10, de-reticolazione delle istone-DNA complessi, e gene-specifiche real-time PCR quantitativa. L'approccio si è dimostrato utile per la rilevazione di specifiche modificazioni degli istoni associati C ₄ la fotosintesi nel mais ^5,11 e l'immunità sistemica in Arabidopsis ^3.

Protocollo

1. Reticolazione del materiale vegetale

1. Vendemmia 1-2g di foglie di Arabidopsis (6 a 10cm di diametro rosetta) in una da 50 ml tubo di plastica e riempire fino a 40ml di buffer di reticolazione.
2. Assicurarsi che lascia soggiorno immerso, ad esempio ripieno un diritto su misura spugna filtro sopra la superficie del buffer. Poi posto i tubi in un essiccatore.
3. Vuoto infiltrarsi per 10min. Per aggiungere ogni tubo 2,5 ml di glicina 2M per fermare reticolazione, e invertire i tubi per garantire la dispersione pari della glicina.
4. Vuoto infiltrarsi per altri 5 minuti e scartare fluido durante la raccolta foglie su un setaccio.
5. Lavare le foglie due volte con 1 litro di acqua in un bicchiere di vetro, poi lascia asciugare con salviette di carta.
6. Raccogliere le foglie in un tubo di plastica fresca e congelare in azoto liquido. Conservare le foglie a -80 ° C fino isolamento cromatina.

2. Isolamento di cromatina

1. Foglie a terra con malta e pistillo che sono stati mantenuti in azoto liquido fino al momento dell'uso.
2. Trasferimento in polvere ad un 50-ml tubo di plastica e sospendere in tampone di estrazione 30mL # 1.
3. Incubare per 15 minuti a 4 ° C su un overhead shaker.
4. Sospensione filtrato attraverso quattro strati di miracloth in un nuovo 50-ml tubo di plastica.
5. Spin per 20 minuti a 2800 xg a 4 ° C.
6. Rimuovere il surnatante e sospendere pellet con un pennello a tampone di estrazione 1mL # 2. In primo luogo aggiungere un piccolo volume di tampone # 2, poi sospendere pellet con un pennello, e quindi aggiungere il resto dei buffer.
7. Trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C.
8. Nel frattempo, preparare 2 ml-microcentrifuga provette contenenti 1,5 ml di buffer di estrazione # 3.
9. Rimuovere il surnatante dal tubo filato (passo 2,7) e sospendere pellet in 300μL di tampone di estrazione # 3. In primo luogo aggiungere un piccolo volume di tampone # 3, sospendere pellet con un pennello, e quindi aggiungere il buffer residuo.
10. Con attenzione pipetta precipitato sospeso (passo 2,9) in cima al buffer di 1,5 ml di estrazione n. 3 preparati in fase 2.8. Assicurarsi che le due fasi non si mescolano. Spin per 1h a 16000 xga 4 ° C.
11. Rimuovere il surnatante e sospendere cromatina pellet con un pennello in 300μL di buffer di sonicazione.
12. Ultrasuoni cromatina con un sonotrodo, o in un bagno a ultrasuoni, a una dimensione del DNA di circa 400bp. Quando sonicating, fare cromatina che non sarà una temperatura superiore di circa 30 ° C per proteggere sensibili al calore legami crociati. La durata di sonicazione deve essere determinato sperimentalmente, perché varia in modo significativo tra i diversi dispositivi di sonicazione. Per la guida, le impostazioni per i due dispositivi differenti:

Per sonicazione con un marchio Bandelin sonotrodo esporre cromatina in tubo di 0,6 ml microcentrifuga cinque volte a 20 scatti con impostazioni 25% di energia, ciclo = 50. Così facendo, fresco campione ogni 20 scoppia ^° in un bagno di ghiaccio.

Per sonicazione con vasca Diagenode Bioruptor ultrasuoni, riempire bagno con acqua e ghiaccio e sonicare dieci volte per 30 secondi in tubi microcentrifuga 1,5 ml con l'impostazione 'alta'. Dopo ogni 30 secondi, i campioni di raffreddare per altri 30 secondi.

13. Spin sonicato campione per 5 min a 16.000 g a 4 ° C a precipitare materiale non disciolto. Il supernatante possono essere utilizzati direttamente per immunoprecipitazione. In alternativa, i campioni possono essere scossa congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino a quando un ulteriore uso.

3. Immunoprecipitazione

1. Preparare 2-mL tubi da microcentrifuga contenente 40μL proteina-A agarosio e 1.8mL di anticorpi di legame buffer. Aggiungere 200μL della preparazione cromatina (passo 2.13).
2. Incubare le provette per 1 ora su un overhead shaker.
3. Eliminare le proteine-A perline agarosio e l'utilizzo sopranatante per immunoprecipitazione.
4. Rimuovere un 40μL-aliquota per determinare la concentrazione della cromatina ('ingresso').
5. Aggiungi 30μL proteina-A agarosio e la quantità di modifica anticorpo specifico che è indicato nella tabella sottostante di reagenti e attrezzature specifiche per 400μL sospensione cromatina sonicato.
6. Incubare per 2.5 ore o durante la notte su una lavagna luminosa agitatore a 4 ° C.
7. Spin down perline per 2min a 440 x g.
8. Lavare tallone pellet con 900μL di ogni tampone di lavaggio (vedi elenco sotto). Per ogni buffer, perline incubare nel buffer per 10 minuti su un agitatore in testa a 4 ° C, poi girare per 2 minuti a 440 xg, scartare il surnatante e aggiungere il buffer successivo.
   1. Iposodica tampone di lavaggio
   2. Alta sale tampone di lavaggio
   3. LiCl tampone di lavaggio
   4. TE tampone di lavaggio
9. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere completamente qualsiasi residuo di buffer.

4. De-reticolazione degli istoni e del DNA, e la purificazione del DNA precipitato

1. Aggiungere 100μL di de-reticolazione tampone al pellet agarosio e il campione 'ingresso' il 40μl dal punto 3.4, mescolare per 5 min su un vortex, campioni di spin, e incubatoribate a 65 ° C durante la notte.
2. Purificare il DNA con il DNA commerciale o kit di purificazione PCR.
3. Tipicamente 5μl di una diluizione 1:5 del eluato della colonna finale sono sufficienti per eseguire convenzionali locus-specifiche real-time RT-PCR quantitativa (RT-qPCR).

5. Tabella dei buffer

Reticolazione tampone
Butirrato di sodio	10mM
Saccarosio	400mm
Tris-HCl, pH 8,0	10mM
β-mercaptoetanolo	5mM
Formaldeide	3% (v / v)

Tampone di estrazione # 1
Butirrato di sodio	10mM
Saccarosio	400mm
Tris-HCl, pH 8,0	10mM
β-mercaptoetanolo	5mM
Inibitori della proteasi completo	1x

Tampone di estrazione # 2
Butirrato di sodio	10mM
Saccarosio	250mm
Tris-HCl, pH 8,0	10mM
β-mercaptoetanolo	5mM
MgCl 2	10mM
Triton X-100	1% (w / v)
Inibitori della proteasi completo	1x

Tampone di estrazione # 3
Butirrato di sodio	10mM
Saccarosio	1.7M
Tris-HCl, pH 8,0	10mM
β-mercaptoetanolo	5mM
MgCl 2	2mM
Triton X-100	0,15% (w / v)
Inibitori della proteasi completo	1x

Sonicazione tampone
Tris-HCl, pH 8,0	25mM
NaOH-EDTA, pH 8,0	5mM
SDS	0,5% (w / v)
Inibitori della proteasi completo	1x

Anticorpi tampone vincolante
Tris-HCl, pH 8,0	50mM
NaOH-EDTA, pH 8,0	1 mM
NaCl	150mm
Triton X-100	0,1% (w / v)

Iposodica tampone di lavaggio
NaCl	150mm
SDS	0,1% (w / v)
Triton X-100	1% (w / v)
NaOH-EDTA, pH 8,0	2mM
Tris-HCl, pH 8,0	20 mM

Alta sale tampone di lavaggio
NaCl	500mm
SDS	0,1% (w / v)
Triton X-100	1% (w / v)
NaOH-EDTA, pH 8,0	2mM
Tris-HCl, pH 8,0	20 mM

LiCl tampone di lavaggio
Cloruro di litio	250mm
Nonidet-P40	1% (v / v)
Sodio desossicolato	1% (w / v)
NaOH-EDTA, pH 8,0	1 mM
Tris-HCl, pH 8,0	20 mM

TE tampone di lavaggio
NaOH-EDTA, pH 8,0	10mM
Tris-HCl, pH 8,0	1 mM

Decrosslinking tampone
Tris-HCl, pH 6.8	62,5 mm
NaCl	200mm
SDS	2% (w / v)
DTT	10mM

6. Rappresentante dei risultati:

Espressione del gene di Arabidopsis thaliana difesa PR2 che codifica per una β-1,3-glucanasi con attività antimicrobica ^12, è stata indotta da benzothiadiazole (BTH), un analogo sintetico del ormone vegetale acido salicilico ^3. Figura 1 dimostra che l'attivazione di PR2 espressione è associata ad un aumento della acetilazione degli istoni su residui di lisina H3 e H4 sul promotore PR2. Dal momento che la densità nucleosoma diminuisce durante l'attivazione del gene ^13, i valori acetilazione degli istoni sono stati normalizzati per il segnale ottenuto con un anticorpo ad una regione invariante di istone 3.

Figura 1 BTH induce l'acetilazione degli istoni sul promotore PR2 in Arabidopsis. Le piante sono state trattate con BTH 100μM o un controllo in polvere bagnabile. Dopo 72 ore, le foglie sono state raccolte e cromatina è stato isolato. Il segnale ottenuto dopo precipitazione con acetilazione anticorpi specifici (come indicato in figura) è stata normalizzata per il segnale ottenuto per precipitazione con un anticorpo a un dominio invariante dell'istone H3. Cromatina precipitato è stata quantificata mediante RT-qPCR. I dati sono standardizzati per livelli di modificazione degli istoni, in assenza di trattamento BTH.

Discussione

Passaggi più critici nel protocollo sono la reticolazione del DNA e istoni, il tipo e la quantità di materiale foglia, macinazione del materiale, e la sonicazione della cromatina. Per una discussione più dettagliata di questi problemi, vedere rif. 9 e 10.

Sonicazione e reticolazione:

E 'importante interrompere cromatina durante la sonicazione a frammenti di circa 400bp. Sonicazione esaustivo distruggerà cromatina interrompendo DNA e istoni, sonicazione insufficiente mentre lasceranno frammenti di cromatina lungo. Incidono sulla specificità del metodo, in quanto le modifiche degli istoni distale dal locus testati non possono essere discriminati da modifiche locali. Efficienza sonicazione è meglio testato attraverso la raccolta di cromatina 20μL da campioni prima e dopo la sonicazione, de-reticolazione DNA e istoni, isolare il DNA e determinare la lunghezza del DNA tranciate con elettroforesi su gel di agarosio. RNAse dovrebbero essere aggiunti ai campioni prima di elettroforesi, perché la preparazione della cromatina contiene ancora una grande quantità di RNA in questa fase di purificazione che potrebbero interferire con la visualizzazione del DNA frammentato. I campioni sono utili per immunoprecipitazione della cromatina se il DNA da quelli non tranciati cromatina è più lunga di 10kbp, mentre il DNA da cromatina tranciati forma un striscio con la massima intensità del segnale intorno 400bp di DNA.

Noi abitualmente uso il 3% (v / v) di formaldeide per reticolazione cromatina in foglie intatte, ma l'1% (v / v) di formaldeide potrebbe essere sufficiente nella maggior parte dei casi. Nelle nostre mani, basse concentrazioni di formaldeide consentire tempi più brevi sonicazione e segnali di fondo in conseguenti reazioni di PCR. Tuttavia, quantità insufficienti di formaldeide spesso sfociano in bassa riproducibilità del segnale PCR tra esperimenti indipendenti. Questo potrebbe essere dovuto alla scarsa penetrazione delle foglie con formaldeide a basse concentrazioni. Assicurati di scambiare il vostro stock di formaldeide spesso come il composto tende a polimerizzare con il tempo. Le soluzioni di formaldeide sono stabili solo per circa un mese, e questo periodo è appena prolungato dalla stabilizzazione metanolo. Si consiglia di verificare le concentrazioni di formaldeide diversi quando la creazione di condizioni sperimentali.

Quantità di materiale vegetale e di rettifica:

E 'importante per infiltrarsi basse quantità di materiale fogliare in un grande volume di tampone per evitare lascia attaccare gli uni agli altri. Foglia attaccare spesso si traduce in infiltrazione insufficiente di formaldeide. Inoltre, materiale vegetale troppo bloccherà i pori del tessuto miracloth. L'efficienza di macinazione dipende in misura considerevole con un mortaio e pestello con la misura perfetta. Noi abitualmente macinare con un raffreddamento ad azoto liquido pestello e mortaio, in assenza di ulteriori azoto liquido tre volte per 50 secondi fino a quando il materiale viene macinato in polvere finissima.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Proteina-A-Agarose	Roche	11 134 515 001	dipende dalla classe di anticorpi
Proteine-G-Agarosio	Roche	11 243 233 001	dipende dalla classe di anticorpi
Anti-hyperacetyl-H4	Millipore	06-946	abbiamo usato 5μL
Anti-acetil-H4K5	Millipore	07-327	abbiamo usato 5μL
Anti-acetil-H4K8	Millipore	07-328	abbiamo usato 5μL
Anti-acetil-H4K12	Millipore	07-595	abbiamo usato 5μL
Anti-acetil-H4K16	Millipore	07-329	abbiamo usato 5μL
Anti-acetil-H4K18	Millipore	07-354	abbiamo usato 1ml
Anti-acetil-H3K9	Millipore	07-352	abbiamo usato 5μL
Anti-acetil-H3K14	Millipore	07-353	abbiamo usato 1ml
Anti-trimetil-H3K4	Diagenode	PAB-003-50	abbiamo usato 5μL
Anti-dimetil-H3K4	Millipore	07-030	abbiamo usato 5μL
Anti-monometil-H3K4	Abcam	ab8895	2,5-10μL
Anti-H3	Abcam	ab1791	abbiamo usato 1ml per verificare la densità degli istoni
Bioruptor	Diagenode	UCD-200 A
Sonotrodo MS72	Bandelin
Miracloth	Calbiochem	475855
Inibitori della proteasi completo	Roche	11836145001