التصوير التصاق كريات بيضاء لبطانة الأوعية الدموية في الضغط داخل اللمعة السامية

Summary

هذا هو أسلوب لتصور التصاق الكريات البيض في بطانة الأوعية في الضغط المقطوع. هذه التقنية تتيح دراسة التصاق الأوعية الدموية تحت تدفق القص مع اختلاف الضغوط داخل اللمعة ما يصل الى 200 ملم زئبقي وبالتالي تقليد جي الظروف المرضية في جسم المريض من ارتفاع ضغط الدم.

Abstract

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease², stroke³ and heart failure⁴. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species⁵. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers⁶ however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration^7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry¹⁰. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model⁹ which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter¹¹ as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

Protocol

1. عزل الشرايين السباتية

1. Euthanase10 الاسبوع القديمة سبراغ داولي الفئران عبر CO ₂ / O ₂ الاختناق.
2. اليمين واليسار الموحد المكوس الشرايين السباتية مع الأبهر والقلب ضمان الحد الأدنى تمتد من السفن.
3. في المخزن الجليد الباردة كريبس فصل الشرايين السباتية من الشريان الأورطي والقلب وأداء تشريح قريبة.
4. تبقي السفن معزولة في كريبس على الجليد قبل التركيب.

تقريبا. الساعة = 45 دقيقة

2. فتيلة السفينة الغرفة

1. في الموصلات القريبة والبعيدة من غرفة عازلة سفينة كريبس تدفق الحفاظ على درجة الحموضة الفسيولوجية عن طريق غرس كربوجين الغاز (95 ٪ O ₂ ، 5 ٪ CO ₂₎ من خلال المنطقة العازلة في 37 درجة مئوية.
2. ضمان أنابيب ومسح cannulas تماما ويتم محاذاة.
3. تدفق كريب العازلة من خلال P1 (القريبة) ومحولات الطاقة P2 (قاص). إغلاق صنابير المياه لضمان عدم وجود فقاعات الهواء في محولات الطاقة.
4. ربط المحولات في موصلات المقابلة مرة أخرى وتدفق أكثر كريبس العازلة ضمان عدم فقاعات الهواء. إغلاق الصنابير الى قاعة المحكمة.

تقريبا. الساعة = 15 دقيقة

3. غرفة الضغط على سفينة

1. بدوره على معدات الضغط : أجهزة الضغط ومراقبة ضغط ، ومضخة تمعجية (الشكل 1).
2. مع مضخة تمعجية على الضغط والضغط على أجهزة أوتوماتيكية العازلة كريبس من خلال تشغيل الأنبوب عند 20 مم زئبق (الطلب في 1) ، وضمان عدم فقاعات الهواء.
3. توصيل أنابيب للمحول P2 مغلقة. وسوف تصبح ضغط مستقرة.
4. فتح الصنبور P2 إلى غرفة سفينة لطرد أي فقاعات ثم أغلق الخروج.
5. ملء حوض الاستحمام مع العازلة كريبس (5 -- 7 مل).

تقريبا. الساعة = 10 دقيقة

4. تصاعد السفينة

1. تحت المجهر مكان تشريح العلاقات البوليستر الأسود على كل قنية (الشكل 2).
2. نقل cannulas وأصحاب قنية ، وبصرف النظر جبل. ¼ السفينة (قوس الأبهر نهاية) على قنية P1 ضمان عدم تمزق السفينة.
3. استخدام حقنة مليئة العازلة كريبس تدفق الدم الزائد بلطف من السفينة عن طريق محول P1. إغلاق P1 إلى الغرفة.
4. تأمين السفينة إلى قنية P1 مع ربطة عنق البوليستر.
5. نقل cannulas / أصحاب قنية أقرب للتركيب على القنية P2.
6. جبل نهاية البعيدة للسفينة (~ ¼ طول) على القاصي قنية. آمنة مع ربطة عنق البوليستر.

تقريبا. الساعة = 20 دقيقة

5. الضغط على سفينة

1. ضبط أصحاب قنية لضمان عدم الانحناء أو التمدد في السفينة.
2. مع P1 و P2 مغلقة إلى غرفة تبديل أجهزة ضغط من تلقائي إلى يدوي. التحقق من مضاعفات ضغط عدم وجود انخفاض في ضغط متواصل في غضون 10 ثانية. إذا كان هناك ، يتم حدوث تسرب وصلات ومحولات الطاقة تحتاج إلى المضمون في المكان.
3. ضبط مضاعفات ضغط مرة أخرى إلى التلقائي P2 ثم فتح الى قاعة المحكمة. تحت المجهر مراقبة السفينة تمدد عند فتح الصنبور إلى الغرفة.
4. تبديل أجهزة الضغط إلى يدوي. الاختيار مرة أخرى للانخفاض المستمر في الضغط في غضون 10 ثانية. إذا كان هناك تسرب ثم النظام لا ضغط ضيق وهناك من المرجح أن يكون ثقبا في السفينة.
5. التبديل إلى P1 فتح التلقائي للغرفة. على إعداد دليل تأكد من أن الضغوط لا تزال مستقرة.
6. إذا لم يحصل أي تسرب ، على إعداد دليل لزيادة الطلب 2 (40 مم زئبق).
7. التكيف التلقائي ومراقبة السفينة تحت المجهر. إذا لزم الأمر ، وضبط صاحب قنية لضمان عدم خضوع في vessel.Check عن التسريبات حول إعداد يدوي.
8. كرر الخطوات من 5،6-5،7 زيادة الطلب على 3 (60 ملم زئبقي) ، 4 (80 مم زئبق) وهلم جرا ، حتى يتم التوصل إلى الضغط المطلوب.

تقريبا. الوقت = 15 -- 30 دقيقة

6. تفرخ السفينة الضغط

1. مجموعة الاتصال وحدة تحكم في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
2. مع الثانية مضخة تمعجية العازلة كريبس يروي (1 مل / دقيقة) في الإناء حمام الغرفة.
3. الاتصال تتم إزالة الشافطة لضمان الغرفة فقط الطبقة العليا من حوض الاستحمام.
4. احتضان سفينة الضغط على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الضغط لتعيين التلقائي.
5. تحقق من عدم حدوث أي تسرب الضغط (التحول إلى دليل) بشكل دوري.
6. ويمكن ملاحظة آثار التدخلات الدوائية المختلفة ببساطة عن طريق إضافة إلى مجمع الحمام أثناء الحضانة.

تقريبا. الوقت = 1 ساعة

7. Perfusing السفينة مع ضغط الدم الكامل

1. خلال الحصول على حضانة على الأقل 7.5 مل من الدم البشري كله / السفينة التي تم جمعها في الهيبارين يو 40 / مليلتر دم. في احتضان الصقر 50 مل عند 37 درجة مئوية.
2. 10 دقائق قبل نهاية طنانه الدم حضانة التسمية مع VybrantDil (1:1000) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
3. بعد 10 دقيقة ، وجمع الدم في حقنة إزالة أي فقاعات ، ونعلق على مضخة المحاقن مع سترة الحرارة وضعت في 37 درجة مئوية.
4. إغلاق محول P1 للغرفة / السفينة والمحاقن وتوصيل أنابيب النفايات.
5. تطهير الدم في 1000 ميكرولتر / دقيقة عن طريق أنابيب النفايات لإزالة أي فقاعات.
6. فتح P1 الى قاعة المحكمة. فإن أجهزة ضبط الضغط تلقائيا للحفاظ على الضغط المطلوب.
7. يروي الدم عند 100 ميكرولتر / دقيقة.
8. باستخدام المجهر الفلورسنت بالإضافة إلى كاميرا رقمية حقول two سجل السفينة perfused لمدة 15 ثانية في 1 و 3 و 5 و 7.5 و 10 دقائق.
9. ويمكن تقييم سلامة نضح آخر وظيفة بطانة الأوعية الدموية عن طريق تقنيات مثل الدوائية يمكن تحديد myograph والتصاق جزيء التعبير التي المناعية للتحقق من صحة مزيد من الاستجابة للالتهابات.

تقريبا. الساعة = 15 دقيقة

8. ممثل النتائج :

ويظهر رسم تخطيطي للضغط الإعداد الغرفة في الشكل 1. ويمكن تصور أن يكون مع كاميرا رقمية بالإضافة إلى النتائج المجهر الفلورسنت على الفور عن طريق تسجيلات فيديو حية. وينظر الى صور الفيديو ممثل في الشكل 3 حيث تعتبر الكريات البيضاء لتكون ملتصقة على البطانة اذا ظلت ثابتة لمدة 10 ثانية. يمكن مع تسجيلات فيديو على الخلايا حلقة مستمرة انضمت تحسب حقل متوسط. في حين أن كلا منخفضة (الشكل 3A) وعالية (الشكل 3B) الضغط سوف يسبب قدرا من الالتصاق وينظر الى زيادة كبيرة في التصاق الكريات البيض في الضغط العالي داخل اللمعة ويتجلى هذا أيضا كميا (الشكل 4).

الشكل 1. مضغوطة سفينة فيفو السابقين التخطيطي الغرفة. سفينة مقنى متصلا محول (P1) القريبة والبعيدة (P2) محولات ضغط الدم الذي يمكن أن يتم التلاعب داخل السفينة. يتم الاحتفاظ نضح من خلال محول P1 و P2 الضغط عبر محول.

الشكل 2. Cannuala مع العلاقات بين البلدين. مرفقة العلاقات البوليستر الأسود إلى كل قنية.

الشكل 3. صور الفيديو التمثيلية. الحيوي التصاق الخلية (السهم الأحمر) تحت مضان في 80 مم زئبق (أ) و 120 مم زئبق (B) بعد 10 دقيقة من نضح.

الشكل 4. السباتي التصاق كريات بيضاء في الشرايين بعد سبراغ داولي حضانة ساعة 1 في انخفاض (80 مم زئبقي) والضغط العالي (120 مم زئبق). *** P <0.001 ، وتحليلها وبنسبة 2 في اتجاه والتدابير المتكررة ANOVA باستخدام اختبار آخر مخصص Bonferroni.

Discussion

هذا هو أسلوب لدراسة تعديل لالتصاق الكريات البيض في بطانة الأوعية الدموية سليمة في ظل ظروف الضغط معزولة في الوقت الحقيقي. نضح من الغرفة وحدها السفينة تمكن من التحقق من صحة السريع الموالية للالتهابات سلالات من الفئران الكبيرة والسفن الفئران. تمكين التلاعب الضغط يسمح لوحظ من التفاعلات الحيوية الخلية المنخفض لضغوط داخل اللمعة عالية جدا ، وبالتالي أفضل تقليد جي الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. ويمكن أيضا للسفن القطر يقاس باستخدام خلايا كافية تصوير برنامج ويمكن تحديد تدفق القص وبالتالي معدل وبالتالي التلاعب.

مع قدرات myograph والخمسين ، التدخلات الدوائية وضعها في حمام تضيف بعدا آخر للظروف تجريبية محتملة مع هذا النموذج من الدراسات تمكين المسارات الآلية والإشارات. في حين لا يستطيع المحافظة على البطانية خلال التلاعب وأكد أن الضغوط ، يمكن أن تتم الاستجابة لأدن تشافيز وPE نضح آخر ^9.

وتجدر الإشارة إلى أن هذا يدل على الإعداد آثار الضغط داخل اللمعة على الخلية الى خلية التفاعلات لا آثار تدفق الدم الانقباضي أو نابض ولا الضغوط الانبساطي. وعلاوة على ذلك ، في حين لوحظت تغييرات الضغط الحاد على التصاق الكريات البيض ، ويمكن استخدام هذا الإعداد أيضا أن ننظر إلى آثار الضغط المزمن (أي زيادة مرات حضانة واستخدام الحيوانات الضغوط المزمنة نموذجا). وأظهرت سبراغ الشرايين السباتية داولي المشتركة في هذه المجموعة لكنها يمكن أن تستخدم السلالات والأنواع الأخرى مع إجراء التعديلات المناسبة لحجم قنية. في الواقع ، فمن المهم أن نلاحظ أن العمر والوزن من الحيوانات تؤثر على حجم السفينة ، وبالتالي أن مجموعة يحتاج إلى ما يقارب تكون فردية عن كل سفينة. يمكن تشريح وثيق ودقيق لتحسين التصور النسيج الضام من الكريات البيض كثيرا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف / المعدات	شركة	فهرس العدد	تعليقات
مجهر	كارل زايس ، وشركة	STEREO ديسكفري V.20
الدكتوراه مضخة الحقنة 2000	جهاز هارفارد	70-2016
كاميرا رقمية والمراقب المالي	هاماماتسو ORCA - ER	C4742 - 95
مضان نظام الإضاءة.	التجويف حيوية	X - سايت 120
سفينة غرفة	نظم التهوية المعيشة	CH/1/SH
الضغط ومضخة هيدروليك المراقب تحوي	نظم التهوية المعيشة	PS -- 200
ضغط التروية مراقب	نظم التهوية المعيشة	م -- 4
2 X محول الضغط	نظم التهوية المعيشة	PT -- F
درجة الحرارة المراقب المالي	نظم التهوية المعيشة	TC - 01
مضخة تمعجية	Instech المختبرات ، وشركة	P720
VybrantDil الخلية وضع العلامات الحل	Invitrogen	V - 22885	استخدام 1:1000