في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Summary

تصميم خطة واضحة سير العمل ليوم واحد لتشخيص مسببات الأمراض البكتيرية تمكن من التعرف السريع للالتهابات مجرى الدم. إدراج الأهداف الثمانية البكتيرية ذات الصلة سريريا وملفاتهم الشخصية المقاومة للمضادات الحيوية يقدم الطبيب نظرة أولية في نفس اليوم، والتي يمكن أن تؤدي إلى مزيد من العلاج الملائم.

Abstract

وترتبط عدوى مجرى الدم مع ارتفاع معدلات الوفيات بسبب ظهور محتمل للتسمم، وتعفن الدم الشديد والصدمة الإنتانية ^1. ولذلك، إدارة سريع من العلاج بالمضادات الحيوية الكافي يتسم بأهمية قبل كل شيء في علاج التهابات مجرى الدم. العنصر الحاسم في هذه العملية هو التوقيت، وتعتمد اعتمادا كبيرا على نتائج تحديد البكتيريا للمضادات الحيوية، واختبارات الحساسية. ويتم الحصول بصورة روتينية على حد سواء من هذه المعلمات من قبل ثقافة على أساس الاختبار، والتي تستغرق وقتا طويلا، ويأخذ في 24-48 ساعة في المتوسط ^{​​2 و 4.} وكان الهدف من الدراسة لتطوير المعتمدة على الحمض النووي لتحديد هوية المقايسات السريع للالتهابات مجرى الدم، وكذلك إجراء اختبارات الحساسية للمضادات الميكروبات السريع. الفحص الأول هو 16S eubacterial rDNA القائم على فحص PCR في الوقت الحقيقي مع استكمال الأنواع أو تحقيقات جنس محدد ^5. باستخدام هذه التحقيقات، الجراثيم سلبية الغرام بما في ذلك أنواع الزائفة، الزائفة الزنجاريةويمكن تمييزها القولونية، فضلا عن الجراثيم الإيجابية الغرام بما في ذلك النيابة العنقودية الذهبية.، المكورات العنقودية الذهبية، المعوية النيابة.، العقدية النيابة.، والعقدية الرئوية. باستخدام هذا الفحص multiprobe، أعطيت تحديد الأول من هذا الكائن الصغير المسبب للمرض بعد 2 ساعة.

ثانيا، قمنا بتطوير فحص شبه الجزيئية لإجراء اختبارات الحساسية للمضادات الحيوية من س. المذهبة، المعوية النيابة. و (اختياري) الميكروب الهوائي سلبية الغرام قضبان ^6. واستند هذا الاختبار على دراسة التي استخدمت PCR لقياس نمو البكتيريا ^7. يتم تحضين البكتيريا حصادها مباشرة من الثقافات الدم لمدة 6 ساعات مع مجموعة مختارة من المضادات الحيوية، وبعد Sybr الأخضر القائم على فحص PCR في الوقت الحقيقي ويحدد تثبيط نمو. ويمكن الجمع بين هاتين الطريقتين توجيه اختيار العلاج المناسب من المضادات الحيوية في اليوم نفسه (الشكل 1). في الختاموالتحليل الجزيئي لكلا تحديد وقابلية للمضادات الحيوية تقدم أسرع بديلة للكشف عن العوامل المسببة للأمراض، ويمكن تحسين تشخيص العدوى مجرى الدم.

Protocol

الجزء الأول: تحديد العوامل المسببة للأمراض

1. عينة تحضير

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ العمل كله الجزيئية كما هو موضح في بروتوكول التالية وفقا لتوصيات لضمان الجودة في التشخيص الجزيئي ^3.

1. إضافة قسامة 0.1 مل من ثقافة الدم إلى 0.9 مل 0.9٪ كلوريد الصوديوم في أنبوب رد فعل 1،5 مل لتصبح عينة 1:10 المخفف. (المخفف للحيلولة دون تثبيط qPCR).
2. أجهزة الطرد المركزي في 13400 عينة XG لمدة 5 دقائق لبيليه في الحمض النووي للبكتيريا.
3. Resuspend وبيليه البكتيرية في 100 عقيمة منشآتها ميكرولتر O. ₂ H
4. تخزين عينة من الحمض النووي في استخدام درجة مئوية حتى 4 أخرى.

2. الفحص تحديد الهوية: في الوقت الحقيقي 16S rDNA PCR

1. تحضير مخاليط رد فعل على النحو التالي. الفحص يتكون من أربعة ردود فعل منفصلة لكل عينة. كل خليط يشمل 12،50 سيد ميكرولترمزيج و 0.9 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) ^7، و 0.6 ميكرومتر التمهيدي العكسي (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) ⁽⁸⁾ وفريق من تحقيقات. ونظرا لحجم تحقيقات لكل من ردود فعل منفصلة في 4 أدناه.
2. في أول رد فعل ما يلي:
   • 0.2 تحقيق عالمية ميكرومتر (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) ⁸
   • 0.2 ميكرومتر P. مسبار الزنجارية (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
3. رد الفعل الثاني يتضمن:
   • 0.2 ميكرومتر E. مسبار القولونية (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
   • 0.2 ميكرومتر الزائفة النيابة. مسبار (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
4. رد الفعل الثالث يتضمن:
   • 0.2 ميكرومتر المكورات العنقودية النيابة. مسبار (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
   • 0.2 ميكرومتر س. مسبار الذهبية (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
   • 0.2 ميكرومتر المعوية النيابة. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
5. رد الفعل 4 ويشمل:
   • 0.2 تحقيق عالمية ميكرومتر (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
   • 0.3 ميكرومتر العقدية النيابة. مسبار (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
   • 0.2 ميكرومتر س. مسبار الرئوية (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
6. إضافة معقم محلاة H ₂ O للتوصل إلى حجم ما مجموعه 20 ميكرولتر. إضافة 20 ميكرولتر من كل رد فعل على خليط من الآبار لوحة PCR 96-جيدا.
7. إضافة 5 ميكرولتر من عينة إلى كل بئر.
8. استخدام الفيلم لاصقة لاغلاق لوحة PCR 96-جيدا.
9. تشغيل لوحة على ABI PRISM 7900HT PCR الوقت الحقيقي النظام باستخدام ما يلي الظروف المثلى الدراجات الحرارية:
   • قبل التدفئة عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة
   • الأولي تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة
   • 42 دورات
     • تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 15 ق
     • الصلب في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة

3. تحليل النتائج

1. ضبط عتبة تحليل ط م إلى 0.1 في إعدادات تحليل التبويب. تضييق تكوينات خط الأساس لبدء (دورة): (6) ونهاية (دورة): 15.

2. تسجيل دورة عتبة (CT) قيمة بالنسبة لجميع العينات. ويمكن تعيين قيمة قطع للنظر في نتيجة PCR إيجابية إلى CT-قيمة من 35. وتراوحت كمية البكتيريا الموجودة في الدم الثقافات من ¹⁰ يوليو - 10 نوفمبر كفو / مل، وتوليد CT-القيم أقل من 35.

الجزء الثاني: اختبار الحساسية للمضادات الحيوية

4. عزل البكتيريا من الدم الثقافات الايجابية ⁹

1. نضح 5 مل من مرق من زجاجة الدم ثقافة إيجابية وتحويلها في أنبوب المصل الفاصل.
2. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب المصل الفاصل في 2000 XG لمدة 10 دقيقة.
3. تجاهل طاف من الأنبوب الفاصل المصل.
4. نقل البكالورياteria من طبقة الجل من الأنبوب مع مسحة القطن المعقمة في المياه المالحة 0.9٪ حتى يتم الحصول على 0،5 تعليق معيار مكفارلاند.

5. التلقيح من لوحات عيار مايكرو

1. تمييع تعليق مكفارلاند 0.5 في مزدوجة تتركز مولر مرق الثاني هينتون لتشكيل تعليق 5 × CFU ⁵ 10 / مل.
2. إضافة هذا التعليق للآبار من لوحة عيار الصغيرة التي تحتوي على مجموعة مختارة من المضادات الحيوية (الجدول 1).
3. احتضان لوحة صغيرة في عيار 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
4. تخزين 1 قسامة من التعليق على 4 درجات مئوية (ومراقبة النمو السلبي).
5. بعد 6 ساعات من الحضانة، ونقل محتوى كل بئر في أنبوب معقم، فضلا عن مراقبة نمو سلبية العينة التي تم تخزينها في 4 درجة مئوية.
6. منبذة الأنابيب في 16000 XG لمدة 5 دقائق.
7. إزالة بعناية وطاف، من دون إزعاج بيليه البكتيرية.
8. Resuspend لبيليه في H منشآتها عقيم _{2 O.}
9. تخفيف عينات بمقدار 10 أضعاف في معقم منشآتها O. ₂ H

6. في الوقت الحقيقي 16S rDNA PCR ¹⁰

1. تحضير خليط PCR على النحو التالي:
   • 12.50 ميكرولتر معدل الذكاء SYBR الأخضر Supermix
   • 0.5 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي 16S-1 (5 TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) ¹¹
   • 0.25 ميكرومتر 16S-2 التمهيدي العكسي (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) ¹¹
   • معقم محلاة H ₂ O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 20 ميكرولتر
2. إضافة 20 ميكرولتر من خليط PCR للآبار من لوحة PCR 96-جيدا.
3. إضافة 5 ميكرولتر من عينة إلى كل بئر.
4. استخدام الفيلم لاصقة لاغلاق لوحة PCR 96-جيدا.
5. تشغيل لوحة على أحادية اللون MyiQ في الوقت الحقيقي نظام الكشف PCR، وذلك باستخدام ما يلي الظروف المثلى الدراجات الحرارية:
   • الأولي تمسخ في درجة مئوية لمدة 4 95 دقيقة
   • الأولي الصلب عند 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
   • 35 دورات
     • تمسخ في الساعة 95 درجات مئوية لمدة 15 ثانية
     • الصلب في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
   • تذوب تحليل منحنى (60-95 درجة مئوية في 20 دقيقة مع الزيادات من 0.57 درجة مئوية)

7. تحليل النتائج

1. حساب قيمة ط م وقف انتاج المواد الانشطارية باستخدام واحدة من الصيغ التالية (اعتمادا على نوع من المضادات الحيوية).
   • بشكل عام:
     وقف انتاج المواد الانشطارية ط م ط م = قيمة سيطرة قيمة نمو إيجابي + 0.5 × (CT سيطرة قيمة النمو السلبي - CT مراقبة نمو قيمة إيجابية)
   • بيبيراسيلين، بيبيراسيلين / tazobactam والسيفنازيديم في سالبة الجرام قضبان؛ أموكسيسيلين، أوكساسيلين والتريميثوبريم / سلفاميثوكسازول في S.aureus؛ أموكسيسيلين في الانواع المعوية:. الانشطارية ط م ط م = قيمة تحكم قيمة نمو إيجابي + 0.25 X (CT نمو قيمة سالبة مراقبة - CT مراقبة نمو قيمة إيجابية)
2. استخدم نموذج حضنت مع معقم محلاة O ₂ H ومراقبة نمو إيجابية.
3. اعتمادا على الكائنات الحية الدقيقة، واستخدام مناسب مراقبة نمو سلبي:
   • سالبة الجرام قضبان عينة حضنت مع مزيج من المضادات الحيوية
   • المعوية النيابة. عينة مخزنة في 4 درجات مئوية
   • عينة S.aureus المخزنة في 4 درجات مئوية
4. تحديد قابلية (S) أو المقاومة (R) من سلالة لاختبار مضاد حيوي على النحو التالي:
   • قيمة ط م أعلى من قيمة ط م قطع يشير إلى قابلية
   • قيمة ط م أقل من القيمة ط م قطع يشير إلى مقاومة

8. ممثل النتائج

الكائنات نموذج اثنين، أي E. سلبية الغرام كولاي وS. الإيجابية الغرام الذهبية، ويتم اختيار لتصور إجراءات مشتركة للكشف وتحديد مسببات الأمراض البكتيرية وتحديد الشخصية الخاصة بهم المضادة للميكروبات. الجزء الأول من البروتوكول يشمل تحديد العوامل المسببة للأمراض. جمعية مهندسي البترول وتهدف تحقيقات cific للكشف عن الكائنات الحية الدقيقة 8 ذات الصلة سريريا. في وجود هدف وشملت في لوحة البكتيرية، يتم إنشاء منحنيات التضخيم وتحسب القيم ط م (الشكل 2). يتم تعيين قيمة قطع للنظر في نتيجة PCR إيجابية إلى قيمة ط 35 عاما. في الشكل 2A، يظهر الملف وتحديد ثقافة الدم القولونية المصابة. يتم تضمين تحقيق عالمية 16S في اثنين من الخلائط رد فعل مستقل ويولد بالتالي منحنيات التضخيم 2 (ط م من 25.20 و 25.95). مشتق إشارة الثالث من معين لتحقيق E. كولاي (ط م من 27.04). تحديد هوية س. ويرد المكورات المصابين ثقافة الدم في الشكل 2B. التحقيق الشامل 16S لديها إشارات التضخيم من 33،35 و 33،71. وتستمد الإشارات المتبقيتين من تحقيقات النيابة محددة للبكتيريا. و س. الذهبية (ط م من 32.48 و 30.59).

ق ق = "jove_content"> بعد الجزء الأول من البروتوكول، ومن المعروف أن الكائنات الحية الدقيقة المسببة ويمكن تحديد الشخصية المضادة للجراثيم. الشكل (3) هو مثال على مؤامرة حساسية للمضادات الحيوية التضخيم الاختبار، والتي تمثل سلالة القولونية التي عرضت أيضا في الشكل 2A. كل سطر يمثل أحد المضادات الحيوية التي تم تحضين العينة مع البكتيرية. عينة بقيمة ط م منخفض هي نموذج في النمو الذي حدث في وجود مقاومة، والمضادات الحيوية مشيرا إلى أن المضادات الحيوية التي تم اختبارها. على العكس من ذلك، قيمة عالية ط م تمثل عينة التي لا نمو قد حدث بسبب العامل الفعال للحساسية، مضاد حيوي للإشارة إلى المضادات الحيوية التي تم اختبارها. ويوضح الجدول 1 تحديد ملف المضادة للميكروبات من E. كولاي وس. الذهبية المعزولة. تم الإبلاغ عن جميع القيم والتصوير المقطعي و، وذلك باستخدام صيغ المذكورة في نص بروتوكول (7.1)، وهما وقف انتاج المواد الانشطارية القيم ط م هي calcuذا الصلة إلى التمييز بين المقاومة وحساسية. وهذا النوع مقاوم للمضادات الحيوية إذا كانت قيمة ط م ذكرت أقل من القيمة المحسوبة ط م وقف انتاج المواد الانشطارية (والعكس بالعكس).

الرسم البياني رقم 1 التدفق. من تحديد مسببات المرض والمضادات الحيوية إجراء اختبار الحساسية للأدوية في الوقت الحقيقي باستخدام 16S rDNA PCR.

الشكل 2 فحص الهوية: المؤامرات التضخيم والقيم عتبة دورة (القيم ط م) تم الكشف عن ثقافة الدم إيجابية من قبل لجنة التحقيق الشامل rDNA 16S، في حين يتم استخدام مجسات خاصة للتعرف على الممرض السببية. A. مؤامرة التضخيم من ثقافة الدم التي تحتوي على E. كولاي، باء مؤامرة التضخيم من ثقافة الدم التي تحتوي على س. المكورات؛ Pseu AE، Pseudomonكما الزنجارية، يوني، 16S عالمي التحقيق؛ Ecoli، القولونية مسبار القولونية؛ Pseu ليرة سورية، الزائفة النيابة. مسبار، S. PNEU، المكورات التحقيق؛ بكتيريا ليرة سورية، العقدية النيابة. مسبار، الأمعاء، المعوية النيابة. مسبار، S. المذهبة، المكورات العنقودية الذهبية التحقيق؛ المكورات العنقودية يرة سورية، والمكورات العنقودية النيابة. مسبار.

مؤامرة شخصية التضخيم 3. من اختبار الحساسية للمضادات الحيوية من E. كولاي عزل (عينة 1). كل منحنى يمثل أحد المضادات الحيوية التي تم تحضين مع السلالة. ويتسبب إشارة مبكرة من الحمل بكتيرية عالية، مما يعني أنه من سلالة نمت في ظل وجود المضادات الحيوية اختبارها ومقاومة وبالتالي للمضادات الحيوية. إشارات تدل على أن وقت متأخر من سلالة لم نمت في ظل وجود المضادات الحيوية، وبعبارة أخرى، فمن عرضة.

نموذج 1: E. كولاي			نموذج 2: س. الذهبية
AST	ط م	R / S	AST	ط م	R / S
أموكسيسيلين 8 ملغم / لتر	16،83	R	أموكسيسيلين 0.25 ملغم / لتر	21،03	R
أموكسيسيلين clavulanate-8/4 ملغم / لتر	17،36	R	أوكساسيلين 2 ملغم / لتر	25،80	S
بيبيراسيلين 16 ملغم / لتر	16،67	R	فانكومايسين 2 ملغم / لتر	25،20	S
بيبيراسيلين-tazobactam 16 /4 ملغم / لتر	24،15	S	جنتاميسين 4 ملغم / لتر	25،86	S
سيبروفلوكساسين 1 مغ / لتر	29،72	S	تريميثوبريم، سلفاميثوكسازول 2/38 ملغم / لتر	24،62	S
السيفنازيديم 1 مغ / لتر	24،03	S
السيفنازيديم 8 ملغم / لتر	26،58	S
جنتاميسين 4 ملغم / لتر	29،83	S
تريميثوبريم، سلفاميثوكسازول 2/38 ملغم / لتر	27،60	S
مراقبة نمو سلبي (مزيج من المضادات الحيوية)	30،41		مراقبة نمو سلبي (عينة تخزينها في درجة مئوية 4)	27،42
نمو إيجابي في السيطرة	16،90		نمو إيجابي في السيطرة	20،22
قطع CT-قيمة 1 *	21،76		قطع CT-قيمة 1 ***	23،82
قطع CT-قيمة 2 **	18،75		قطع CT-القيمة 2 ****	22،02
* للحصول على أموكسيسيلين، أموكسيسيلين-clavulanate، سيبروفلوكساسين، gentamicفي، تريميثوبريم، سلفاميثوكسازول * للحصول على بيبيراسيلين، بيبيراسيلين-tazobactam، السيفنازيديم			*** للفانكومايسين والجنتاميسين **** للحصول على أوكساسيلين، أموكسيسيلين وتريميثوبريم سلفاميثوكسازول-

الجدول رقم 1. تحديد اختبار الحساسية للمضادات الحيوية في العينتين (القولونية وS.aureus). تم نسخ القيم المقطعية لفحص PCR-إلى هذا ملف اكسل، والتي يمكن أن تحسب تلقائيا وهما وقف انتاج المواد الانشطارية alues ​​ط م من السيطرة على نمو إيجابية وأخرى سلبية، وذلك باستخدام الصيغ هو موضح في نص البروتوكول. إذا مضاد حيوي يدل على قيمة ط م أقل من القيمة ط م وقف انتاج المواد الانشطارية، وهذا النوع مقاوم للمضادات الحيوية، إذا كانت قيمة ط م كان أعلى من وقف انتاج المواد الانشطارية، من سلالة معرضة.

Discussion

البروتوكول وصفها هنا يمكن التعرف السريع على مسببات الأمراض، ويقدم لمحة فنية المضادة للجراثيم التي يمكن أن تؤدي إلى الإدارة في وقت مبكر من المضادات الحيوية الكافية وبالتالي تحسين تشخيص المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم. تبعا للظروف وطلبت من الاختبار، أي منخفضة التكلفة، وإنتاجية عالية، الحد الأدنى من فترة التسليم، ويمكن تعديل ظروف الاختبار. لا يمكن أن يؤديها الإجراء بأكمله في غضون يوم عمل واحد. وعلاوة على ذلك، يمكن تنفيذ جزأين من البروتوكول في وقت واحد، مما يقلل من وقت دورانها بشكل ملحوظ. كما وردت هنا، لوحة الهوية هي مجموعة من البكتيريا الأكثر صلة سريريا في المستشفى. منذ المبدأ الرئيسي هو استهداف المنطقة الجينات 16S، يمكن تصميم تحقيقات محددة لالكائنات الحية الدقيقة الأخرى، وأضيف إلى فحص. كان من المفترض الفحص الكامل للتحليل السريع للثقافات الدم، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لمعالجة سمواد ذر عينة. هذا هو الحال أيضا بالنسبة للمضادات الحيوية التي تم استخدامها لاختبار الحساسية للمضادات الحيوية: يمكن إضافة المضادات الحيوية أو غيرها، استنادا إلى أنماط المقاومة المحلية والمبادئ التوجيهية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	ميرك للمواد الكيميائية	106404	0.9٪ في الماء
Vacutainer فاصل المصل طائرة أسرع من الصوت الأنبوبة 5 مل	دينار بحريني أنظمة التشخيص	367986
مولر هينتون الثاني مرق	دينار بحريني تشخيص Dystems	212322	44 جم / لتر في المياه
منبذة Rotixa 50 RS	أندرياس Hettich GMBH & CO.	4910
منبذة 5415 D	إيبندورف	توقف
الاشعال	سيغما الدريخ	NA
تحقيقات	Sigma-Aldrich/Applied النظم البيولوجية	NA
TaqManEnvironmental سيد مزيج 2.0	النظم البيولوجية التطبيقية	4396838
معدل الذكاء SYBRGreen Supermix	الحيوي راد مختبرات BV	170-8880
MicroAmp بصري 96-حسنا بلايت رد الفعل	النظم البيولوجية التطبيقية	N8010560
MicroAmp فيلم لاصق بصري	النظم البيولوجية التطبيقية	4311971
معدل الذكاء 96-حسنا لوحات PCR	الحيوي راد مختبرات BV	223-9441
Microseal B لاصق الأختام	الحيوي راد العملatories BV	MSB-1001
في الوقت الحقيقي ونظام الكشف PCR	النظم البيولوجية التطبيقية	ABI PRISM 7900HT
في الوقت الحقيقي ونظام الكشف PCR	الحيوي راد مختبرات BV	MyiQ أحادية اللون