Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

Resumo

O desenho de um esquema de fluxo de trabalho simples de um dia para diagnóstico de patógenos bacterianos permite o reconhecimento rápido de infecções da corrente sanguínea. A inclusão de oito clinicamente relevantes alvos bacterianas e os seus perfis de resistência a antibióticos oferece a percepção um clínico inicial no mesmo dia, o que pode levar a uma terapia mais adequada.

Resumo

Infecções da corrente sanguínea estão associados a altas taxas de mortalidade por causa da manifestação provável de sepse, sepse grave e choque séptico ^1. Assim, a administração rápida de terapia antibiótica adequada é de grande importância no tratamento de infecções da corrente sanguínea. O elemento crítico neste processo é o tempo, fortemente dependente dos resultados da identificação bacteriana e testes de susceptibilidade aos antibióticos. Ambos estes parâmetros são rotineiramente obtido por cultura com base em testes, o que é demorado e leva em média 24-48 horas ^{2, 4.} O objectivo do estudo foi o de desenvolver baseados em DNA ensaios para a rápida identificação de infecções da corrente sanguínea, bem como testes de susceptibilidade antimicrobiana rápida. O primeiro ensaio é um 16S eubacterianas ADNr baseado em tempo real de ensaio PCR, complementados com espécies-ou género sondas específicas ^5. Usando estas sondas, bactérias gram-negativas, incluindo Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosae Escherichia coli, bem como bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., e Streptococcus pneumoniae poderiam ser distinguidas. Utilizando este ensaio Multiprobe, uma primeira identificação do micro-organismo causador foi dado após 2 h.

Em segundo lugar, nós desenvolvemos um ensaio semi-molecular para testes de susceptibilidade a antibióticos de S. aureus, Enterococcus spp. e (facultativo) aeróbios Gram-negativos hastes ^6. Este ensaio baseou-se um estudo em que a PCR foi utilizado para medir o crescimento de bactérias ^7. As bactérias colhidas directamente a partir de culturas de sangue são incubadas durante 6 h, com uma selecção de antibióticos, e seguindo um Sybr Verde baseado em tempo real ensaio de PCR determina a inibição do crescimento. A combinação destes dois métodos poderiam dirigir a escolha de uma terapia adequada antibiótico no mesmo dia (Figura 1). Em conclusão, A análise molecular de ambos identificação e antibiograma oferece uma alternativa mais rápida para a detecção de patógenos e pode melhorar o diagnóstico de infecções da corrente sanguínea.

Protocolo

PARTE I: identificação do patógeno

1. Preparação da Amostra

Nota: O fluxo de trabalho inteiro molecular como é descrito no protocolo seguinte deve ser realizada de acordo com as recomendações para garantia da qualidade do diagnóstico molecular ^3.

1. Adicionar uma alíquota de 0,1 ml de cultura de sangue a 0,9 ml de NaCl 0,9% para um tubo de reacção 1,5 ml a tornar-se uma amostra 1:10 diluído. (Diluir a fim de evitar a inibição qPCR).
2. Centrifugar amostra a 13.400 xg durante 5 min a pelete o ADN bacteriano.
3. Ressuspender o sedimento bacteriano em 100 uL estéril desmineralizada H ₂ O.
4. Armazenar a amostra de ADN a 4 ° C até uso posterior.

2. Ensaio de Identificação: Real-Time PCR rDNA 16s

1. Preparar as misturas de reacção como se segue. O ensaio consiste em quatro reacções separadas por amostra. Cada mistura inclui 12,50 mestre ulmistura, 0,9 uM para a frente de iniciadores (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) ^7, 0,6 mM iniciador reverso (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) ⁸ e um painel de sondas. A quantidade de sondas é dado para cada um dos quatro reacções separadas em baixo.
2. A primeira reacção inclui:
   • 0,2 mM da sonda universal (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) ⁸
   • 0,2 uM P. sonda aeruginosa (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
3. A segunda reacção inclui:
   • 0,2 uM E. sonda coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
   • 0,2 uM de Pseudomonas spp. sonda (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
4. A reacção terceira inclui:
   • 0,2 mM Staphylococcus spp. sonda (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
   • 0,2 uM de S. sonda aureus (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
   • 0,2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
5. A reacção quarto inclui:
   • 0,2 mM da sonda universal (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
   • 0,3 uM Streptococcus spp. sonda (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
   • 0,2 uM de S. pneumoniae sonda (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
6. Adicionar estéril desmineralizada _H2O para atingir um volume total de 20 uL. Adicionar 20 ul de cada mistura de reacção para os poços de uma placa de PCR de 96 poços.
7. Adicionar 5 ul de amostra a cada poço.
8. Use uma película adesiva para selar a placa de 96 poços de PCR.
9. Execute o prato no PRISM 7900HT ABI Real Time PCR System usando as seguintes condições óptimas de ciclos térmicos:
   • Pré-aquecimento a 50 ° C durante 10 min
   • Desnaturação inicial a 95 ° C durante 15 min
   • 42 ciclos de
     • Desnaturação a 95 ° C durante 15 s
     • Recozimento a 60 ° C durante 1 min

3. Análise dos Resultados

1. Ajuste o limiar da Análise de Ct para 0,1 nas configurações de análise de tabulação. Estreitar as configurações de base para iniciar (Ciclo): 6 e End (ciclo): 15.

2. Registre o ciclo limiar (Ct) para todas as amostras. O valor de corte para considerar um resultado PCR positivo como pode ser definido como um Ct valor de 35. A quantidade de bactérias presentes em culturas de sangue variou de julho ^10-novembro 10 CFU / ml, gerando Ct-valores abaixo de 35.

PARTE II: TESTES susceptibilidade a antimicrobianos

4. Isolamento de bactérias a partir de hemoculturas positivas ⁹

1. Aspirar 5 ml de caldo de uma garrafa de sangue positivo cultura e transferi-lo para um tubo de separador de soro.
2. Centrifugar o tubo separador de soro a 2000 xg durante 10 min.
3. Descartar o sobrenadante do tubo separador de soro.
4. Transferência de bactérios a partir da camada de gel do tubo com uma mecha de algodão estéril em solução salina a 0,9% até 0,5 de McFarland uma suspensão padrão é obtida.

5. Inoculação de placas de Micro Titre

1. Dilui-se a suspensão 0,5 McFarland em duplo concentrado Mueller Hinton II caldo para formar uma suspensão de 5 x 10 ⁵ UFC / ml.
2. Adicionar esta suspensão para os poços de uma placa de micro titulação, contendo uma selecção de antibióticos (Tabela 1).
3. Incubar a placa de micro titulação, a 37 ° C durante 6 h.
4. Armazenar uma alíquota da suspensão a 4 ° C (como controlo de crescimento negativo).
5. Após 6 h de incubação, transferir o conteúdo de cada poço para um tubo de estéril, bem como a amostra de controlo negativo de crescimento que foi armazenada a 4 ° C.
6. Centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 5 min.
7. Cuidadosamente remover o sobrenadante, sem perturbar o sedimento bacteriano.
8. Ressuspender o sedimento em H desmineralizada esterilizada _{2 O.}
9. Diluir as amostras de 10 vezes na estéril desmineralizada H ₂ O.

6. Real-time PCR rDNA 16s ¹⁰

1. Preparar a mistura de PCR como se segue:
   • 12,50 ul iQ SYBR Green Supermix
   • 0,5 uM primer dianteiro 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) ¹¹
   • 0,25 iM reversa 16S-2 primer (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) ¹¹
   • estéril desmineralizada _H2O para um volume total de 20 uL
2. Adicionar 20 ul de mistura de PCR para os poços de uma placa de PCR de 96 poços.
3. Adicionar 5 ul de amostra a cada poço.
4. Use uma película adesiva para selar a placa de 96 poços de PCR.
5. Execute o prato no Single-Cor MyiQ Sistema de Detecção de Real-Time PCR, utilizando os seguintes óptimas condições de ciclos térmicos:
   • Desnaturação inicial a 95 ° C durante 4 min
   • Inicial de recozimento, a 65 ° C durante 30 s
   • 35 ciclos de
     • Desnaturação a 95 ° C durante 15 s
     • Recozimento a 60 ° C durante 1 min
   • Derreter análise da curva (60-95 ° C em 20 min com incrementos de 0,57 ° C)

7. Análise dos Resultados

1. Calcular o valor de corte Ct, utilizando uma das seguintes fórmulas (dependendo do tipo de antibiótico).
   • Em geral:
     Cut-off Ct valor = valor Ct controle do crescimento positivo + 0,5 x (valor Ct controle do crescimento negativo - valor Ct controle de crescimento positivo)
   • Piperacilina, piperacilina / tazobactam e ceftazidima em bacilos Gram-negativos; amoxicilina, oxacilina e trimetoprim / sulfametoxazol em S.aureus; Amoxicilina em Enterococcus spp:. Cut-off Ct valor = valor Ct controle do crescimento positivo + 0,25 x (Ct crescimento valor negativo controle - valor Ct controle de crescimento positivo)
2. Use a amostra incubada com desmineralizada estéril H ₂ O, como controle de crescimento positivo.
3. Dependendo do microorganismo, utilizar o controlo de crescimento negativa adequada:
   • Gram-negativas Amostra hastes incubadas com uma mistura de antibióticos
   • Enterococcus spp Amostra. Armazenado a 4 ° C
   • Exemplo S.aureus armazenado a 4 ° C
4. Determinar a susceptibilidade (S) ou a resistência (R) da estirpe para o antibiótico testado como se segue:
   • Um valor Ct superior ao valor Ct de corte indica susceptibilidade
   • Um valor Ct inferior ao valor Ct de corte indica resistência

8. Os resultados representativos

Dois organismos modelo, ou seja, uma E. Gram-negativas coli e S. uma Gram-positivos aureus, são escolhidos para visualizar o procedimento combinado para a detecção e identificação de agentes patogénicos bacterianos e de determinação do seu perfil de antimicrobiana. A primeira parte do protocolo compreende a identificação do patógeno. Spesondas específicos são concebidos para a detecção de oito microrganismos clinicamente relevantes. Em presença de um alvo incluídos no painel de bacteriana, as curvas de amplificação são gerados e valores Ct são calculados (Figura 2). O valor de corte para considerar um resultado positivo de PCR como está definido para um valor de Ct de 35. Na Figura 2A, o perfil de identificação de uma cultura de E. coli sangue infectado é mostrado. A sonda 16S universal está incluído em duas misturas de reação separadas e, conseqüentemente, gera duas curvas de amplificação (Ct de 25,20 e 25,95). O terceiro sinal é derivado da sonda específica para E. coli (Ct de 27,04). A identificação de um S. aureus infectado cultura de sangue é mostrado na Figura 2B. A sonda 16S universal tem sinais de amplificação de 33,35 e 33,71. Os dois sinais restantes são derivadas das sondas específicas para Staphylococcus spp. e S. aureus (Ct de 32,48 e 30,59).

Após a primeira parte do protocolo, o microorganismo causador é conhecida eo perfil antimicrobiana pode ser determinada. A Figura 3 é um exemplo de um antibiótico trama amplificação susceptibilidade de teste, que representa a estirpe de E. coli que foi também mostrado na Figura 2A. Cada linha representa um antibiótico que a amostra bacteriana foi incubada com. Uma amostra com um valor baixo Ct é uma amostra na qual o crescimento ocorreu na presença de uma resistência, antibiótico indicando ao antibiótico testado. Pelo contrário, um valor elevado Ct representa uma amostra na qual nenhum crescimento ocorreu por causa de o funcionamento eficaz da susceptibilidade, antibiótico indicando ao antibiótico testado. A Tabela 1 ilustra a determinação do perfil de antimicrobiana do E. coli e S. isolados aureus. Todos os valores são relatados Ct e, usando as fórmulas mencionadas no texto protocolo (7,1), dois valores de corte Ct são calculadosisoladas de distinguir entre a resistência e susceptibilidade. A estirpe é resistente ao antibiótico se o valor relatado Ct é menor do que o valor calculado Ct cut-off (e vice-versa).

Figura Fluxograma 1. Da identificação do patógeno e procedimento de teste de sensibilidade aos antibióticos em tempo real usando 16S rDNA PCR.

A Figura 2 ensaio Identificação:. Gráficos de amplificação e os valores de limiar de ciclo (valores Ct) Uma cultura de sangue positivo é detectado pelo universal 16S rDNA sonda, enquanto as sondas específicas são utilizados para a identificação do agente patogénico causal.. A. enredo ampliação da cultura de sangue contendo E. coli, B. enredo ampliação da cultura de sangue contendo S. aureus; Pseudomonas ae, Pseudomoncomo aeruginosa; uni, 16S sonda universal; Ecoli, Escherichia coli sonda; Pseudomonas sp, Pseudomonas spp. sonda; S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae sonda; Strep sp, Streptococcus spp. sonda; Entero, Enterococcus spp. sonda; S. aureus, Staphylococcus aureus sonda; Staph sp, Staphylococcus spp. sonda.

Figura enredo Amplificação 3. Dos testes de susceptibilidade a antibióticos de um E. coli isolado (amostra 1). Cada curva representa um antibiótico que a estirpe foi incubada com. Um sinal precoce é causada por uma carga elevada de bactérias, o que significa que a estirpe cresceu na presença do antibiótico testado e é, portanto, resistente ao antibiótico. Sinais tardios indicam que a estirpe não cresceu na presença do antibiótico, por outras palavras, ela é susceptível.

Exemplo 1: E. coli			Exemplo 2: S. aureus
AST	Ct	R / S	AST	Ct	R / S
A amoxicilina de 8 mg / L	16,83	R	A amoxicilina de 0,25 mg / L	21,03	R
Amoxicilina-clavulanato mg 8/4 / L	17,36	R	Oxacilina 2 mg / L	25,80	S
Piperacilina 16 mg / L	16,67	R	A vancomicina 2 mg / L	25,20	S
Piperacilina-tazobactam 16 /4 mg / L	24,15	S	Gentamicina 4 mg / L	25,86	S
Ciprofloxacina 1 mg / L	29,72	S	Trimetoprima-sulfametoxazol mg 2/38 / L	24,62	S
A ceftazidima 1 mg / L	24,03	S
A ceftazidima 8 mg / L	26,58	S
Gentamicina 4 mg / L	29,83	S
Trimetoprima-sulfametoxazol mg 2/38 / L	27,60	S
Controlo de crescimento negativo (mistura de antibióticos)	30,41		Controlo de crescimento negativo (amostra armazenada a 4 ° C)	27,42
Controle de crescimento positiva	16,90		Controle de crescimento positiva	20,22
Cut-off valor Ct-1 *	21,76		Cut-off valor Ct-1 ***	23,82
Cut-off Ct-valor 2 **	18,75		Cut-off Ct-valor 2 ****	22,02
* Para amoxicilina, amoxicilina-clavulanato, ciprofloxacina, gentamicna, sulfametoxazol-trimetoprim ** Para piperacilina, piperacilina-tazobactam, ceftazidima			*** Para vancomicina e gentamicina Para **** amoxicilina, oxacilina e sulfametoxazol-trimetoprim

Tabela 1. Determinação dos testes de susceptibilidade aos antibióticos das duas amostras (E.coli e S.aureus). Os valores de TC do PCR-ensaio foram copiados para este ficheiro Excel, como o que pode automaticamente calcula os dois alores de corte Ct a partir do controlo de crescimento positivo e negativo, usando as fórmulas mostradas no texto de protocolo. Se um antibiótico mostra um valor Ct inferior ao valor Ct de corte, a estirpe é resistente ao antibiótico, se o valor Ct foi maior do que o ponto de corte, a estirpe é susceptível.

Discussão

O protocolo descrito aqui permite a rápida identificação de patógenos e fornece um perfil funcional antimicrobiano que poderia conduzir a administração precoce de antibióticos adequados, melhorando o prognóstico de pacientes com infecções da corrente sanguínea. Dependendo das condições requeridas de um teste, isto é, baixo custo, com rendimento elevado, o mínimo tempo de rotação, as condições de ensaio pode ser ajustada. Todo o procedimento pode ser realizado dentro de um dia útil. Além disso, as duas partes do protocolo pode ser realizada simultaneamente, o que reduz o tempo de rotação de forma significativa. Como apresentado aqui, o painel de identificação é uma seleção das bactérias mais clinicamente relevantes em nosso hospital. Uma vez que o principal princípio tem como alvo a região do gene 16S, as sondas específicas para outros microorganismos podem ser concebidos e adicionado ao ensaio. O ensaio completo foi originalmente destinado para a análise rápida de culturas de sangue, mas também pode ser usado para o processamento de Oamostra materiais Ther. Este é também o caso para os antibióticos que foram usados ​​para os testes de susceptibilidade aos antibióticos: mais antibióticos ou outras podem ser adicionados, com base em padrões de resistência locais e orientações.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de sódio (NaCl)	Merck Chemicals	106404	0,9% em água
Vacutainer SST tubo separador de soro de 5 ml	BD Diagnostic Systems	367986
Mueller Hinton II caldo	BD Diagnostic Dystems	212322	44 g / L em água
Centrifugar Rotixa 50 rs	Andreas Hettich GmbH & Co. KG	4910
Centrífuga 5415 D	Eppendorf	Descontinuado
Primers	Sigma-Aldrich	nd
Sondas	Sigma-Aldrich/Applied Biosystems	nd
TaqManEnvironmental mestre mix 2,0	Applied Biosystems	4396838
iQ SYBRGreen Supermix	Bio-Rad Laboratories BV	170-8880
MicroAmp Optical 96-Bem Placa de Reacção	Applied Biosystems	N8010560
Película adesiva MicroAmp Optical	Applied Biosystems	4311971
iQ placas de 96 poços de PCR	Bio-Rad Laboratories BV	223-9441
Microseal B Adesivo Selos	Bio-Rad Trabalhoatories BV	MSB-1001
Real-time Sistema de Detecção de PCR	Applied Biosystems	ABI PRISM 7900HT
Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories BV	MyiQ Single-Cor