Un giorno Scheme flusso di lavoro per batterica Rilevazione dei patogeni e test di resistenza antimicrobica dalle emocolture

Riepilogo

La progettazione di un semplice schema di un giorno di workflow per la diagnostica dei patogeni batterici permette il rapido riconoscimento di infezioni del sangue. L'inclusione di otto obiettivi clinicamente rilevanti batteriche ed i loro profili di resistenza agli antibiotici offre al medico una prima idea il giorno stesso, che può portare ad una terapia più adeguata.

Abstract

Infezioni del sangue sono associati con alti tassi di mortalità a causa della manifestazione probabile di sepsi, sepsi grave e shock settico ^1. Pertanto, la somministrazione rapida di una terapia antibiotica è di primaria importanza nel trattamento delle infezioni del sangue. L'elemento fondamentale in questo processo è di temporizzazione, fortemente dipendente dai risultati di identificazione batterica e test di sensibilità agli antibiotici. Entrambi questi parametri sono comunemente ottenuti dalla cultura test basato, che richiede molto tempo e richiede in media 24-48 ore ^{2, 4.} Lo scopo dello studio era di sviluppare saggi a base di DNA di identificazione rapida di infezioni del sangue, nonché un rapido test di suscettibilità antimicrobica. Il primo saggio è una 16S rDNA eubacterial-based real-time PCR integrate con specie o dei generi di sonde specifiche ^5. Utilizzando queste sonde, i batteri Gram-negativi compreso Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosae Escherichia coli, nonché batteri gram-positivi compresi Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., e Streptococcus pneumoniae potrebbero essere distinti. Usando questo saggio multisonda, una identificazione prima della causativo microrganismo è stato dato dopo 2 ore.

In secondo luogo, abbiamo sviluppato un semi-test molecolare per i test di sensibilità agli antibiotici di S. aureus, Enterococcus spp. e (facoltativo) aerobi gram-negativi ^6. Questo saggio è stato basato su uno studio in cui venne usato PCR per misurare la crescita di batteri ^7. I batteri raccolti direttamente da colture di sangue vengono incubate per 6 h con una selezione di antibiotici, e dopo un SYBR Green basato real-time PCR determina inibizione della crescita. La combinazione di questi due metodi possono indirizzare la scelta di una terapia antibiotica idonea lo stesso giorno (Figura 1). Insomma, L'analisi molecolare sia di identificazione e sensibilità agli antibiotici offre una alternativa più veloce per il rilevamento degli agenti patogeni e potrebbe migliorare la diagnosi delle infezioni del sangue.

Protocollo

PARTE I: IDENTIFICAZIONE PATHOGEN

1. Preparazione del campione

Nota: L'intero flusso di lavoro molecolare, come è descritto nel seguente protocollo deve essere eseguita secondo le raccomandazioni per la garanzia della qualità nella diagnostica molecolare ^3.

1. Aggiungere una aliquota 0,1 ml di coltura di sangue a 0,9 ml di NaCl allo 0,9% in una provetta da 1,5 ml di reazione per diventare un campione diluito 1:10. (Diluire al fine di impedire l'inibizione qPCR).
2. Centrifugare il campione a 13.400 xg per 5 minuti a pellet del DNA batterico.
3. Risospendere il pellet batterico in 100 microlitri sterile demineralizzata H ₂ O.
4. Conservare il campione di DNA a 4 ° C fino ad ulteriore utilizzo.

2. Identificazione Assay: Real-time PCR 16S rDNA

1. Preparare le miscele di reazione come segue. Il test consiste di quattro reazioni separate per campione. Ogni miscela contiene 12,50 maestro plmix, 0,9 uM avanti di primer (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) ^7, primer 0,6 micron inverso (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) ⁸ e un pannello di sonde. La quantità di sonde è dato per ciascuno dei quattro reazioni separate in seguito.
2. La prima reazione comprende:
   • 0,2 pM sonda universale (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) ⁸
   • 0,2 pM P. aeruginosa sonda (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
3. La seconda reazione comprende:
   • 0,2 pM E. coli sonda (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
   • 0,2 pM Pseudomonas spp. Sonda (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
4. La terza reazione comprende:
   • 0,2 pM Staphylococcus spp. Sonda (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
   • 0,2 pM S. aureus sonda (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
   • 0,2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
5. La quarta reazione comprende:
   • 0,2 pM sonda universale (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
   • 0,3 pM Streptococcus spp. Sonda (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
   • 0,2 pM S. pneumoniae sonda (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
6. Aggiungere demineralizzata sterile H ₂ O a raggiungere un volume totale di 20 pl. Aggiungere 20 pl di ciascuna miscela di reazione ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti PCR.
7. Aggiungere 5 pl di campione in ciascun pozzetto.
8. Usare un film adesivo per sigillare la piastra a 96 pozzetti PCR.
9. Eseguire la piastra sul ABI PRISM 7900HT sistema in tempo reale PCR utilizzando le seguenti condizioni ottimali cicli termici:
   • Pre-riscaldamento a 50 ° C per 10 min
   • Denaturazione iniziale a 95 ° C per 15 min
   • 42 cicli di
     • Denaturazione a 95 ° C per 15 s
     • Ricottura a 60 ° C per 1 min

3. Analisi dei risultati

1. Regolare la soglia del Analysis Ct a 0,1 nelle impostazioni di analisi della scheda. Limitare le configurazioni di base per iniziare (ciclo): 6 e End (Cycle): 15.

2. Registrare il ciclo soglia (Ct) il valore per tutti i campioni. Il valore di cut-off di considerare un risultato positivo come PCR può essere impostato ad un valore di Ct-35. La quantità di batteri presenti in colture di sangue variava da ¹⁰ luglio - 10 Novembre CFU / ml, generando Ct valori inferiore a 35.

PARTE II: PROVE DI SENSIBILITA 'AGLI ANTIBIOTICI

4. Isolamento di batteri da emocolture positive ⁹

1. Aspirare 5 ml di brodo da una bottiglia coltura positiva sangue e trasferirlo in un tubo separatore siero.
2. Centrifugare la provetta siero separatore a 2000 xg per 10 min.
3. Eliminare il surnatante dal tubo separatore siero.
4. Transfer bacbatteri dallo strato di gel del tubo con un tampone di cotone sterile in soluzione fisiologica 0,9% fino a McFarland 0,5 sospensione titolata è ottenuta.

5. Inoculazione di Micro Piastre Titre

1. Diluire il 0,5 sospensione McFarland in doppia concentrato Mueller Hinton II brodo per formare una sospensione di 5 x 10 ⁵ CFU / ml.
2. Aggiungere questa sospensione ai pozzetti di una piastra di micro titolo contenente una selezione di antibiotici (Tabella 1).
3. Incubare la piastra micro titolo a 37 ° C per 6 h.
4. Conservare una aliquota della sospensione a 4 ° C (come controllo negativo della crescita).
5. Dopo 6 ore di incubazione, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta sterile, così come il campione negativo di controllo della crescita che è stato conservato a 4 ° C.
6. Centrifugare le provette a 16000 xg per 5 min.
7. Rimuovere con cautela il surnatante, senza disturbare il pellet batterico.
8. Risospendere il pellet in H sterile demineralizzata _{2 O.}
9. Diluire i campioni di 10 volte in sterile demineralizzata H ₂ O.

6. Real-time PCR 16S rDNA ¹⁰

1. Preparare la miscela di PCR come segue:
   • 12,50 ul iQ SYBR Green Supermix
   • 0,5 pM innesco in avanti 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) ¹¹
   • 0,25 16S-2 pM primer reverse (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) ¹¹
   • demineralizzata sterile H ₂ O a un volume totale di 20 pl
2. Aggiungere 20 pl di miscela PCR ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti PCR.
3. Aggiungere 5 pl di campione in ciascun pozzetto.
4. Usare un film adesivo per sigillare la piastra a 96 pozzetti PCR.
5. Esegui il piatto sul singolo colore MyiQ Real-Time PCR Detection System, usando le seguenti condizioni ottimali cicli termici:
   • Denaturazione iniziale a 95 ° C per 4 min
   • Ricottura iniziale a 65 ° C per 30 s
   • 35 cicli di
     • Denaturazione a 95 ° C per 15 s
     • Ricottura a 60 ° C per 1 min
   • Melt analisi della curva (60-95 ° C in 20 min con incrementi di 0,57 ° C)

7. Analisi dei risultati

1. Calcolare il cut-off Ct utilizzando una delle seguenti formule (a seconda del tipo di antibiotico).
   • In generale:
     Cut-off Ct = valore Ct valore positivo controllo della crescita + 0,5 x (valore negativo Ct controllo della crescita - il valore Ct positivo controllo della crescita)
   • Piperacillina, piperacillina / tazobactam e ceftazidime in gram-negativi, Amoxicillina, oxacillina e trimetoprim / sulfametossazolo in S.aureus, amoxicillina in Enterococcus spp. Cut-off Ct = valore Ct positivo controllo della crescita + 0,25 x (Ct crescita del valore negativo controllo - il valore Ct positivo controllo della crescita)
2. Utilizzare il campione incubato con sterile demineralizzata H ₂ O, come controllo della crescita positivo.
3. A seconda del microrganismo, utilizzare il controllo appropriato crescita negativa:
   • Gram-negativi Esempio aste incubate con miscela di antibiotici
   • Enterococcus spp. Campione conservato a 4 ° C
   • Esempio S.aureus conservati a 4 ° C
4. Determinare la suscettibilità (S) o resistenza (R) del ceppo per l'antibiotico testate come segue:
   • Un valore Ct superiore al valore di cut-off Ct indica suscettibilità
   • Un valore Ct inferiore al valore di cut-off Ct indica la resistenza

8. Risultati rappresentativi

Due organismi modello, cioè un Gram-negativo E. coli e Gram-positivi S. aureus, vengono scelti per visualizzare la procedura combinata per il rilevamento e l'identificazione di patogeni batterici e la determinazione del loro profilo antimicrobica. La prima parte del protocollo comprende l'identificazione patogeno. Spesonde specifici sono progettate per il rilevamento di otto microrganismi clinicamente rilevanti. In presenza di un bersaglio incluso nel pannello batterica, curve di amplificazione vengono generati e valori di Ct sono calcolati (Figura 2). Il valore di cut-off di considerare un risultato positivo PCR come è impostata su un valore di Ct 35. In figura 2A, il profilo di identificazione di un E.coli cultura infettata ematico. La sonda 16S universale è incluso in due miscele di reazione separati e genera di conseguenza due curve di amplificazione (Ct di 25,20 e 25,95). Il terzo segnale è derivato dalla sonda specifica per E. coli (Ct di 27,04). L'identificazione di un S. aureus-cultura sangue infetto è mostrato nella figura 2B. La sonda universale 16S ha acquisito il segnale di amplificazione di 33,35 e 33,71. I due segnali rimanenti sono derivate dalle sonde specifiche per Staphylococcus spp. e S. aureus (Ct di 32,48 e 30,59).

"jove_content" Dopo la prima parte del protocollo, il microrganismo responsabile è nota ed il profilo antimicrobica può essere determinata. Figura 3 è un esempio di un antibiotico trama amplificazione test di sensibilità, che rappresenta il ceppo E. coli che è stato anche dimostrato nella Figura 2A. Ogni riga rappresenta un antibiotico che il campione è stato incubato con batterica. Un campione con un valore basso Ct è un esempio in cui la crescita si è verificata in presenza di un antibiotico, indicando resistenza all'antibiotico testato. Al contrario, un valore elevato Ct rappresenta un campione in cui si è verificata alcuna crescita a causa del funzionamento efficace del antibiotico, indicando suscettibilità all'antibiotico testato. La Tabella 1 illustra la determinazione del profilo antimicrobica della E. coli e S. aureus isolati. Tutti i valori sono riportati Ct e, utilizzando le formule indicate nel testo del protocollo (7.1), due cut-off valori Ct sono calcolatiregolamentato di distinguere tra resistenza e suscettibilità. Il ceppo è resistente all'antibiotico se il valore riportato Ct è inferiore al calcolato cut-off Ct (e viceversa).

Figura 1. Diagramma di flusso del patogeno identificazione e test di suscettibilità agli antibiotici procedure utilizzando real-time PCR 16S rDNA.

Figura 2 Identificazione dosaggio:. Trame di amplificazione e valori ciclo soglia (valori di Ct) Una coltura di sangue positiva viene rilevata dal universale 16S rDNA sonda, mentre le sonde specifiche vengono utilizzati per l'identificazione del patogeno causale.. Amplificazione plot A. della cultura sangue contenente E. coli; amplificazione trama B. della cultura sangue contenente S. aureus, pseudo ae, Pseudomoncome aeruginosa; uni, 16S sonda universale; Ecoli, Escherichia coli sonda; pseudo sp, Pseudomonas spp. sonda; S. pneu, Streptococcus pneumoniae sonda; Strep sp, Streptococcus spp. sonda; Entero, Enterococcus spp. sonda; S. aureus, Staphylococcus aureus sonda; Staph sp, Staphylococcus spp. sonda.

Figura 3. Plot di amplificazione delle prove di suscettibilità agli antibiotici di E. coli isolare (campione 1). Ciascuna curva rappresenta un antibiotico che il ceppo è stato incubato con. Un primo segnale è causata da un elevato carico batterico, il che significa che il ceppo è cresciuto in presenza dell'antibiotico testato ed è quindi resistente all'antibiotico. Segnali tardiva indicano che il ceppo non è cresciuto in presenza dell'antibiotico, in altre parole, esso è suscettibile.

Esempio 1: E. coli			Esempio 2: S. aureus
AST	Ct	R / S	AST	Ct	R / S
Amoxicillina 8 mg / L	16,83	R	Amoxicillina 0,25 mg / L	21,03	R
Amoxicillina-acido clavulanico 8/4 mg / L	17,36	R	Oxacillin 2 mg / L	25,80	S
Piperacillina 16 mg / L	16,67	R	Vancomicina 2 mg / L	25,20	S
Piperacillina-tazobactam 16 /4 mg / L	24,15	S	Gentamicina 4 mg / L	25,86	S
Ciprofloxacina 1 mg / L	29,72	S	Trimetoprim-sulfametossazolo 2/38 mg / L	24,62	S
Ceftazidime 1 mg / L	24,03	S
Ceftazidime 8 mg / L	26,58	S
Gentamicina 4 mg / L	29,83	S
Trimetoprim-sulfametossazolo 2/38 mg / L	27,60	S
Controllo della crescita negativo (miscela di antibiotici)	30,41		Controllo della crescita negativo (campione conservato a 4 ° C)	27,42
Controllo positivo di crescita	16,90		Controllo positivo di crescita	20,22
Cut-off Ct-valore 1 *	21,76		Cut-off Ct-valore 1 ***	23,82
Cut-off Ct-valore 2 **	18,75		Cut-off Ct-valore 2 ****	22,02
* Per amoxicillina, amoxicillina-acido clavulanico, ciprofloxacina, gentamicin, trimetoprim-sulfametossazolo ** Per piperacillina, piperacillina-tazobactam, ceftazidime			*** Per vancomicina e gentamicina **** Per amoxicillina, oxacillina e trimetoprim-sulfametossazolo

Tabella 1. Determinazione del test di sensibilità agli antibiotici dei due campioni (E. coli e S. aureus). Valori Ct della PCR-analisi sono stati copiati a questo file excel, in quanto in grado di calcolare automaticamente i due cut-off ALORI Ct dal controllo di crescita positivo e negativo, utilizzando le formule indicate nel testo del protocollo. Se un antibiotico mostra un valore Ct inferiore al valore soglia Ct, il ceppo è resistente all'antibiotico, se il valore Ct è maggiore del cut-off, il ceppo è sensibile.

Discussione

Il protocollo qui descritto permette la rapida identificazione di agenti patogeni e fornisce un profilo funzionale antimicrobico che potrebbe portare alla somministrazione precoce di antibiotici adeguati, migliorando così la prognosi dei pazienti con infezioni del sangue. A seconda delle condizioni richieste di test, cioè a basso costo, velocità elevata, minimo tempo di ritorno, condizioni di prova può essere regolata. L'intera procedura può essere eseguita entro un giorno lavorativo. Inoltre, le due parti del protocollo possono essere eseguite contemporaneamente, che riduce il tempo di ritorno in modo significativo. Come qui presentata, il pannello di identificazione è una selezione dei batteri più clinicamente rilevanti nel nostro ospedale. Poiché il principio fondamentale è il targeting del gene 16S regione, sonde specifiche per altri microrganismi possono essere progettati e aggiunte al saggio. Il dosaggio completo era originariamente prevista per l'analisi rapida di emocolture, ma può anche essere utilizzato per la trasformazione di oltre campioni di materiali. Questo è anche il caso per gli antibiotici che sono stati utilizzati per i test di sensibilità agli antibiotici: antibiotici più o di altro tipo possono essere aggiunti, in base a pattern di resistenza locali e le linee guida.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Cloruro di sodio (NaCl)	Merck Chemicals	106404	0,9% in acqua
Vacutainer SST Siero Tubo Separator 5 ml	BD Diagnostic Systems	367986
Mueller Hinton II brodo	BD Diagnostic Dystems	212322	44 g / L in acqua
Centrifugare Rotixa 50 rs	Andreas Hettich GmbH & Co. KG	4910
Centrifuga 5415 D	Eppendorf	Fuori
Primers	Sigma-Aldrich	na
Sonde	Sigma-Aldrich/Applied Biosystems	na
TaqManEnvironmental master mix 2,0	Applied Biosystems	4396838
iQ SYBRGreen Supermix	Bio-Rad Laboratories BV	170-8880
MicroAmp ottica piastra a 96 pozzetti di reazione	Applied Biosystems	N8010560
MicroAmp Film adesivo ottico	Applied Biosystems	4311971
iQ 96 pozzetti PCR Piastre	Bio-Rad Laboratories BV	223-9441
Microseal B Adesivo Seals	Bio-Rad Laboratories BV	MSB-1001
Real-time PCR Detection System	Applied Biosystems	ABI PRISM 7900HT
Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories BV	MyiQ singolo-Color