رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

Summary

perfused تفاصيل هذه الورقة إجراء تشريح ، والإعداد مفيدة ، والظروف التجريبية خلال رسم الخرائط البصرية المحتملة عبر الغشاء (VM) والكالسيوم داخل الخلايا عابرة (CAT) في قلوب سليمة Langendorff معزولة الماوس.

Abstract

قلب الفأر هو نموذج شعبي للدراسات القلب والأوعية الدموية بسبب وجود التكنولوجيا منخفضة التكلفة للهندسة الوراثية في هذا النوع. يمكن phenotyping الفسيولوجية القلب والأوعية الدموية للقلب الفأر القيام به بسهولة باستخدام التصوير مضان تحقيقات مختلفة لتوظيف إمكانات عبر الغشاء (V _م) ، والكالسيوم العابرين (CAT) ، وغيرها من المعالم. يتميز الإثارة ، التي تقلص اقتران ديناميات العمل المحتملة والكالسيوم داخل الخلايا ، وبالتالي ، فمن المهم للغاية لتعيين كل من V _م واتفاقية مناهضة التعذيب واحد من نفس الموقع على القلب ^1-4. perfused رسم الخرائط البصرية المتزامنة من Langendorff قلوب الماوس لديه القدرة على توضيح الآليات الكامنة وراء فشل القلب وعدم انتظام ضربات القلب ، وأمراض التمثيل الغذائي ، وأمراض القلب الأخرى. التصور التنشيط ، لا يمكن أن سرعة التوصيل ، ومدة عمل محتمل ، وغيرها من المعالم في عدد لا يحصى من مواقع يمكن تحقيقه من تحقيق المستوى الخلوي ولكن يتم حلها بشكل جيد عن طريق تعيين البصرية ^1،5،6. في هذه الورقة نقدم الإعداد الأجهزة والظروف التجريبية لرسم الخرائط البصرية المتزامنة _م الخامس والقط في قلوب الفأر مع القرار المكانية والزمانية عالية باستخدام دولة من بين أحدث تكنولوجيا التصوير المكمل. التسجيلات البصرية التي تم الحصول عليها متسقة مع هذا الأسلوب أن توضح الخرائط البصرية المتزامنة قلوب Langendorff الماوس perfused أمر ممكن وموثوق بها.

Protocol

1. إعداد الحلول المتقدمة الأسهم

1. إعداد الحلول اثنين من الأسهم في حل Tyrode (16X) مقدما في الماء منزوع الأيونات وتخزينها في 4 درجات مئوية :
   1. الأسهم الأول (119.872 ز / كلوريد الصوديوم L ، 3.056 غرام / لتر CaCl ₂ (2H ₂ O) ، 5.6 غرام / لتر بوكل ، 2.6274 غ / ل ناه ₂ ص _{4 و} 3.408 غرام / لتر MgCl ₂ (6H ₂ O) ، (فيشر العلمي ، ديكورات المعرض ، ونيو جيرسي)) ؛
   2. الأسهم الثاني (26.88 غرام / لتر NaHCO3 ، (فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، ونيو جيرسي)).
2. إعداد حلول المخزون من الأصباغ الفلورية. لتجنب تكرار تجميد والذوبان ، نقوم بتخزين 30 aliquots ميكرولتر من الأصباغ في كل من -20 درجة مئوية ، وهو ما يكفي لتجربة واحدة :
   1. الجهد الحساسة محلول المخزون صبغ RH237 (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، 1.25 ملغ / مل حل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO ، سيغما ، وسانت لويس ، MO) ؛
   2. الكالسيوم مؤشر Rhod ، 02:00 محلول المخزون (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، 1 ملغ / مل حل في DMSO.
3. إعداد الإثارة ، تقلص المخزون blebbistatin حل uncoupler (Tocris العلوم البيولوجية ، وسانت لويس ، MO ، 2 ملغ / مل حل في DMSO) مقدما وتخزين blebbistatin الذائبة في 4 درجات مئوية.

2. إعداد حلول الارواء والإعداد التجريبية ⁷

4. يعد حديثا في حل Tyrode 2L (128.2mM كلوريد الصوديوم ، CaCl 1.3mM ₂ (2H ₂ O) ، 4.7mM بوكل ، 1.05mM MgCl ₂ (6H ₂ O) ، 1.19mM ناه ₂ ص ₄ ، NaHCO 20mM ₃ ، 11.1mM D - غلوكوز منزوع الأيونات في درجة الحموضة والمياه = 7.35 ± 0.05). إذا كان يتم استخدام محلول المخزون لجعل 2L حل لTyrode (تكفي لتجربة واحدة) تأخذ 1750 مل من الماء منزوع الأيونات وتخلط في 125 مل من ألبوم I ، 125 مل من ألبوم الثاني ، و4G من الجلوكوز.
5. بدوره على اثنين من مضخات نظم الارواء. ضبط مضخة تمعجية (شبه ستار ، WPI ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة) التي يتم استخدامها لنضح الوراء الى 40 مل / دقيقة. ضبط مضخة أخرى تمعجية (كول ، Parmer مضخة Peristalic Masterflex L / S ، كول ، Parmer شركة الصك ، فيرنون هيلز ، ايلينوي) التي يتم استخدامها لsuperfusion وللعودة مرة أخرى إلى سائل الإرواء الخزان القابضة على 80 مل / دقيقة.
6. غسل نظام الارواء مع الإيثانول 70 ٪ لمدة 30 دقيقة ثم مع الماء منزوع الأيونات 2L.
7. بمجرد أن يتم إجلاء جميع الماء منزوع الأيونات من الغرفة ، وتعميم الحل Tyrode وتمريرها من خلال مرشح 5 ميكرون (ميليبور ، فالجهاز يبث اشعة تماثل ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة). تسخين سائل الإرواء إلى +37 درجة مئوية مع سترة المياه وشكل دائري (ThermoNESLAB EX7 ، نيوتاون ، الولايات المتحدة) وسائل الإرواء الأوكسجين من قبل محتدما O ₂ / CO ₂ (95 ٪ / 5 ٪) الغاز الى الحل. رصد الرقم الهيدروجيني من الحل مع متر الرقم الهيدروجيني (أوكتون الآلات ، وفيرنون هيلز ، IL) ، وضبط معدل O ₂ / CO ₂ محتدما للحفاظ على درجة الحموضة في 7.35 ± 0.05. تواصل رصد درجة الحموضة ودرجة الحرارة أثناء التجربة.
8. المزدوج جهاز رسم الخرائط البصرية يتكون من اثنين من كاميرات CMOS MiCAM أولتيما - L (SciMedia ، وكوستا ميسا ، كاليفورنيا) التي مكانية عالية (100x100 بكسل ، 230 ± 20 ميكرون لكل بكسل) والزمانية القرار (1،000-3،000 إطارات / ثانية). الإصلاح مرشح تمرير النطاق (590 ± 15 نانومتر ، Thorlabs ، نيوتن ، نيوجيرسي) أمام كاميرا التصوير الكالسيوم المعين ، في حين ، مرشح تمرير طويل (> 700 نانومتر ، Thorlabs ، نيوتن ، نيوجيرسي) يحتاج إلى وضعه في أمام الكاميرا الجهد التصوير المعينة. يتم ترتيب الكاميرات عمودي على بعضها البعض بواسطة حامل ، والذي يحتوي على مرآة مزدوج اللون (635 قطع نانومتر ، أوميغا البصرية ، براتلبورو ، VT). مباشرة أسفل حامل الكاميرا المزدوجة هناك العدسة (نيكون NIKKOR 55 ملم 1:1.4 235052) ، والذي يركز الضوء الانبعاثات تأتي من القلب على المرآة مزدوج اللون. المسافة العمل هو 3cm تقريبا.
   يتم إنشاؤها على ضوء الإثارة بواسطة مصباح الهالوجين (نيوبورت اوريل الآلات ، ستراتفورد ، CT ؛ SciMedia ، وكوستا ميسا ، كاليفورنيا) ، ويتم تمريرها من خلال مرشح الحرارة ، ومصراع الكاميرا ، والفرقة تمرير التصفية (520 ± 45 نانومتر). دليل ضوء مرونة يوجه ضوء الفرقة تمرير تصفيتها على إعداد ، ويستخدم مصراع للتأكد من أن تتعرض للضوء التحضير فقط خلال الحصول على الصور لتجنب photobleaching من الأصباغ.
9. إعداد حج / ₂ AgCl أقطاب للسرعة والاستشعار عن بعد في وقت مبكر وتثبيتها في الغرفة قبل وضعها في القلب. تأكد من أن يتم ضبط مكبرات الصوت والمرشحات إلى مستويات مناسبة.

3. حصاد قلب فأر ، يقني ؛ يدخل القنية ، وإعداد Langendorff نضح

10. تخدير الفأر مع الكيتامين / زيلازين (ketamin ، 80mg/kg وزن الجسم ؛ زيلازين ، و 10 ملغم / كغم من وزن الجسم) والهيبارين (100 وحدة) عن طريق الحقن داخل الصفاق. أؤكد مستوى مناسب من التخدير بسبب عدم وجود منعكس الألم.
11. بعد شق منتصف القصية ، بسرعة إزالة القلب وغسله في الاوكسيجين (95 ٪ O ₂ ، 5 ٪ CO ₂₎ ، ودرجة حرارة ثابتة (37 ± 1 درجة مئوية) محلول تايرود.
12. باستخدام مجهر تشريح، وتحديد بسرعة الأبهر واجراء خفض نظيفة عبر الشريان الأبهر الصاعد أدناه الشريان تحت الترقوة اليمنى. ومن ثم تعلق مقطع قصير من الشريان الأورطي إلى العرف عيار 21 قنية مع طرف اندلعت. يستخدم 4-0 خياطة الحرير الأسود مضفر (تخصصات جراحية المؤسسة ، القراءة ، والسلطة الفلسطينية) لإصلاح القلب على القنية. بعد إقناء ؛ إدخال القنية ، وperfused retrogradely القلب وsuperfused مع الحل في Tyrode. يتم ضبط معدل نضح الوراء في مجموعة من 2-5 مليلتر / دقيقة للحفاظ على الضغط الأبهري ما بين 60 و 80 مم زئبق (محول الضغط والدقة الصكوك العالمية المؤتمر الوطني العراقي (WPI) ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ جسر TBM4M مكبر للصوت ، WPI ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية).
13. بعد مقنى القلب ، ثم يتم تشريح الرئة ، والغدة الصعترية ، والأنسجة الدهنية وإزالتها.
14. ويعلق قلب معزولة (أدوات العلوم الجميلة) في قمة لقاع الغرفة التروية (Sylgard مغلفة) لمنع تدفق بفعل الحركة. وامتدت أيضا لواحق اليمين واليسار الأذيني ودبس (أدوات العلوم الجميلة ، المؤتمر الوطني العراقي ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) في الجزء السفلي من الغرفة ، والتي توفر أقصى قدر من المساحة السطحية للالقياسات البصرية من الأذينين.
    مهم جدا! يتم إدخال أنبوب السيليكون الصغيرة في البطين الأيسر عن طريق الأوردة الرئوية والثابتة التي لخياطة الحرير النسيج الضام في مكان قريب. هذا يمنع الازدحام الحل وتحمض سائل الإرواء المحاصرين في البطين الأيسر ، وهو أمر مهم خصوصا بعد قمع انقباضات البطين مع uncoupler الإثارة - انكماش (انظر الجزء 4 الخطوة 19).
15. يوضع القطب الكهربائي العرف على سطح القلب لإجراء عمليات تحفيز سرعة ، والتي تم إنشاؤها بواسطة ماجستير - 8 (AMP صكوك المحدودة ، القدس ، إسرائيل) أو PowerLab 26T (AD الآلات ، سيدني ، أستراليا).
16. تم إصلاح زجاج غطاء صغير على السطح من الحل على القلب لخفض قطعة أثرية الحركة من حل تهتز.
17. تسليط الضوء على إثارة القلب. بالإضافة إلى ذلك ، ضبط المسافة بين جهاز كاميرا مزدوجة والقلب بحيث يمكن الحصول على أقصى قدر من القرار.
18. إيقاف جميع الأضواء في الغرفة وتبدأ التسجيلات الكهربائية باستخدام PowerLab 26T.

4. تحميل الجهد والأصباغ الكالسيوم الحساسة والإثارة uncoupler - الانكماش

19. الاحماء 0.6 مل من blebbistatin. مزيج من 0.5 مل blebbistatin مع سائل الإرواء في الخزان القابضة. تمييع ما تبقى من 0.1 مل من blebbistatin في 1 مل من محلول Tyrode وحقن ببطء (خلال فترة 20 دقيقة) من خلال منفذ المخدرات يقع بالقرب من قنية. كما نلاحظ blebbistatin يقلل تدريجيا من القطع الأثرية الحركة.
20. تمييع 30 ميكرولتر من الجهد محلول الصبغة الحساسة الأسهم RH237 في حل 1 مل Tyrode وحقن ببطء على مدى 5-7 دقائق بمنفذ حقن نفس blebbistatin.
21. المؤشر 30 ميكرولتر Rhod الكالسيوم ، هو 02:00 01:01 مختلطة مع F127 Pluronic (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، 20 ٪ في حل DMSO) ثم في محلول مخفف من 1 مل Tyrode وتطبق ببطء على مدى 5-10 دقيقة عن طريق ميناء حقن نفسه .
22. الانتظار لمدة 5-10 دقائق لblebbistatin والأصباغ لتصل إلى غشاء الخلية والعصارة الخلوية. تواصل مع البروتوكول عندما يتم قمعها تماما الاقتراح.
23. رصد مستمر التسجيلات ECG خلال الإجراء بأكمله لضمان وظيفة الكهربائية العادية للقلب.
24. تبدأ التسجيلات إشارة الفلورسنت باستخدام البرمجيات المخصصة SciMedia (SciMedia ، وكوستا ميسا ، كاليفورنيا).

5. ممثل النتائج :

الشكل 1. الإعداد التجريبي لنضح والتسجيلات الكهربائية ورسم الخرائط البصرية.
EM = الانبعاثات ؛ ليرة لبنانية = longpass

الشكل 2. إعداد التجارب والأمثلة إشارة سجلت خلال سرعة البطين. اليسار : يتم جمع إشارات تخطيط القلب من حج / AgCl أقطاب القرص ₂ (الأعلى) ، ومثال على بروتوكول التحفيز S1S1 هو مبين (القاع). المركز : Langendorff إعداد قلب فأر. الحق : وتظهر امكانات الممثل عمل الاشارات الضوئية والكالسيوم عابرة من الأذينين (الأعلى) والبطينين (القاع). السهم الأصفر (الأعلى) يشير إلى تشتت الإشارات القادمة من الفلورسنت البطينين ، الذي ينظر إليه في التسجيلات الأذيني.
LV = البطين الأيسر ؛ RV = البطين الأيمن ؛ LA = الأذين الأيسر ؛ RA = الأذين الأيمن

الشكل 3. التسجيلات البصرية ممثل _م الخامس والقط من البطينين في القلب من نوع الماوس البرية. A. إعداد تجريبية مع مجموعة من مواقع متباعدة بشكل متساو تميزت النقط السوداء التي التسجيلات البصرية يمكن أن ينظر في (C). باء مثال تتبع _م الخامس واتفاقية مناهضة التعذيب من موقع مركزي على مجموعة (انظر المربع الأولن (C)). C. V _م (الأزرق) ، واتفاقية مناهضة التعذيب (الحمراء) من مجموعة من مواقع متباعدة بشكل متساو. واهمال اشارات 3X3.

الشكل 4. خريطة التنشيط والتوصيل. ألف التنشيط مثالا من قلب الخريطة نوع الماوس البرية مع المستعرض (T) والطولية (L) الاتجاهات المشار إليها السهام البيضاء. B. V إشارات _م (الأعلى) و DV / دينارا (القاع) المقابلة لثلاث نقاط المشاهدة في A (T1 ، T2 ، T3 ، L1 ، L2 ، L3).

الشكل 5. إمكانات العمل وتحليل الكالسيوم مدة عابر. A. مدة العمل المحتملة في عودة الاستقطاب ٪ 80 (APD80) ومدتها الكالسيوم عابرة في استرخاء ٪ 80 (CaD80) تظهر الخرائط من القلب تحت ظروف التحكم (يسار) وبعد 30 نانومتر تطبيق isoproterenol (يمين). اللون الأصفر / الأخضر في البطينين (الأيمن) يشير إلى تقصير isoproterenol APD80 وCaD80. باء مثال لاقتفاء أثر وAPD80 CaD80 من البطينين نوع الماوس البرية (الأعلى) ، والأذينين (القاع).

Discussion

في هذه التجربة أننا تعديل طريقة الارواء Langendorff بإضافة أنبوب السيليكون الصغيرة ، وهو أمر حاسم خصوصا بعد قمع انقباضات البطين مع uncoupler الإثارة - الانكماش. يستخدم أنبوب السيليكون لمنع الازدحام الحل ، الحل تحمض التروية ، وتطوير الإسكيمية في البطين الأيسر. قلب الفأر حساس جدا لانخفاض حرارة الجسم ، وبالتالي ، تغيرات درجة الحرارة في جميع أنحاء القلب الاصطناعي سوف يسبب الخلافات المحتملة في فترات العمل. وبالتالي ، تم تطبيق نظام التدفئة في غرفة نضح من أجل الحفاظ على درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية خلال مجمل التجربة ^8. منذ نموذجا Langendorff لا تحتفظ تعصيب من القلب ، ويحتاج المرء للنظر إضافة إلى العصبية سائل الإرواء من أجل التحقيق في الفسيولوجية نغمة المتجانسة وغير المتجانسة ^9. إلى جانب نضح الوراء ، إضافة superfusion القلب يساعد على الحفاظ على المعايير البيئية المناسبة مثل درجة الحموضة ودرجة الحرارة. في هذا الأسلوب ، وضعت أفقيا في قلب Langendorff perfused. ويمكن لنضح Langendorff العمودي الإعداد أن تستخدم أيضا ¹⁰ ، ولكن قد يؤدي في الميكانيكا القلب مختلفة قليلا ^11. بالإضافة إلى الكاميرات المكمل ، وكاشفات بديلة تتوفر أيضا ويمكن تطبيقها على الخريطة V _م واتفاقية مناهضة التعذيب في وقت واحد ^12.

تطبيق الكاميرات المكمل للقرار المكانية والزمانية ليؤكد دقة عالية من التسجيلات ، ولكن الإشارات الضوئية رسم الخرائط ليست من خلية واحدة. بدلا من ذلك ، كل إشارة الفلورسنت يأتي من مئات أو آلاف من الخلايا ، اعتمادا على التكبير الضوئي. يمكن للمضان البطين أكبر بكثير تشويه الإشارات الضوئية الأذيني بواسطة نثر ، وبالتالي ، مطلوب تفسير دقيق للإشارات سجلت بصريا. آخر الحد من إعداد الماوس هو تشويه الإشارات والضوضاء الناجمة عن انحناء السطح نتيجة لصغر حجم القلب ^13. ويمكن تغيير قياسات سرعة التوصيل ليس فقط من انحناء قلب فأر ولكن أيضا من الأقطاب الكهربائية وأقطاب الظاهري. لتحقيق الدقة في سرعة التوصيل ، تباين التنشيط ، والخرائط عودة الاستقطاب ، وتصحيح تركيز الكاميرا على سطح القلب هو ضروري.

في هذه الطريقة ، لا يمكن في الوقت الحقيقي التسجيلات ECG استكمال التحقيق الكهربية الضوئية من القلب. وتستخدم صبغة حساسة الجهد (RH237) ومؤشر الكالسيوم (Rhod ، 02:00) في البروتوكول بسبب استجابتها السريعة ، الإثارة مماثلة ، ومتميزة الأطياف انبعاث ^3،7. هناك مجموعات من الأصباغ البديلة التي يمكن استخدامها لقياس V _م واتفاقية مناهضة التعذيب وغيره من RH237 ³ - Rhod 02:00. وعثر على رواية الجهد الحساسة صباغة ، PGHI ، مع تحول كبير في ستوك (> 200nm) للسماح أفضل V _م وإشارات لجنة مناهضة التعذيب بسبب زيادة فصل بين انبعاث موجات PGHI و ¹⁴ - Rhod 02:00. تحسينات في المستقبل قد تركز على استكشاف تحقيقات الفلورسنت الرواية ، ووضع أجهزة الكشف عن التصوير الجديدة ، وتحسين برامج معالجة الصور. ارتفاع القرار ، ورواية طرائق التصوير الضوئي لرسم الخرائط 3D البصرية هي أيضا التوجهات المستقبلية الهامة لرسم الخرائط البصرية ^5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
كيميائي	شركة	رقم كتالوج
كلوريد الصوديوم	فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، NJ	S271 - 1
CaCl 2 (2H 2 O)	فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، NJ	C79 - 500
بوكل	فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، NJ	S217 - 500
MgCl 2 (6H 2 O)	فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، NJ	M33 - 500
ناه 2 ص 4 (H 2 O)	فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، NJ	S369 - 500
NaHCO 3	فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، NJ	S233 - 3
D - غلوكوز	فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، NJ	D16 - 1
Blebbistatin	Tocris العلوم البيولوجية ، Ellisville ، MO	1760
RH237	Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا	S1109
Rhod ، 02:00	Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا	R1244
Pluronic F127	Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا	P3000MP
ثنائي ميثيل sulphoxide (DMSO)	سيغما ، وسانت لويس ، MO	D2650