מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

Summary

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

Abstract

הלב העכבר הוא מודל פופולרי ללימודי לב וכלי דם בשל קיומה של הטכנולוגיה בעלות נמוכה עבור הנדסה גנטית של מין זה. Phenotyping פיזיולוגיים לב וכלי דם של הלב העכבר ניתן לעשות זאת בקלות באמצעות דימות פלואורסצנטי העסקת בדיקות שונות פוטנציאל הטרנסממברני (V _{מ '),} הארעיים סידן (CAT), ופרמטרים נוספים. עירור-התכווצות צימוד מאופיין הדינמיקה פעולה פוטנציאליים תאיים סידן, ולכן חשוב למפות באופן ביקורתי הן _מ V ו-CAT בו זמנית באותו מקום על הלב ^1-4. מיפוי אופטי סימולטני מן Langendorff perfused לבבות העכבר יש את הפוטנציאל להבהיר המנגנונים אי ספיקת לב, הפרעות קצב, מחלות מטבוליות, מחלות לב אחרות. ויזואליזציה של הפעלה, מהירות ההולכה, משך פעולה פוטנציאליים, ופרמטרים נוספים על מספר עצום של אתרים לא ניתן להשיג מחקירה ברמה התאית אבל גם נפתרת על ידי מיפוי אופטי ^1,5,6. במאמר זה אנו מציגים את תוכנית ההתקנה מכשור תנאי הניסוי למיפוי אופטי סימולטני של V _{מ 'חתול} ועכבר לבבות עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה באמצעות המדינה-of-the-art טכנולוגיית CMOS הדמיה. הקלטות אופטי עקבי להשיג בשיטה זו להמחיש כי מיפוי אופטי סימולטני של לבבות Langendorff עכבר perfused הוא גם ריאלי ואמין.

Protocol

1. הכנה מתקדמים של פתרונות מניות

1. הכן שני פתרונות המניות של הפתרון של Tyrode (16x) מראש במים deionized ולאחסן אותם ב 4 ° C:
   1. במלאי אני (119.872 g / L NaCl, 3.056 גרם / L CaCl ₂ (2H ₂ O), 5.6 גרם / L KCl, 2.6274 גרם / L לאא ₂ PO _4, 3.408 גרם / L MgCl ₂ (6 שעות ₂ O), (פישר מדעי הדשא, היריד, NJ));
   2. במלאי II (26.88 g / L NaHCO3 (פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי)).
2. הכינו פתרונות המניות של צבעי ניאון. כדי למנוע קפיאה חוזרות הפשרה, אנו מאחסנים aliquots 30 μl של שני צבעים ב -20 ° C, שהיא די בניסוי אחד:
   1. מתח רגיש לצבוע RH237 (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) פתרון מניות, 1.25 מ"ג / מ"ל ​​פתרון sulfoxide דימתיל (DMSO, Sigma, סנט לואיס, מיזורי);
   2. אינדיקטור סידן Rhod-02:00 (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) פתרון המניות, 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון DMSO.
3. הכן עירור-התכווצות blebbistatin uncoupler פתרון מניות (Tocris Bioscience, סנט לואיס, מיזורי, 2 מ"ג / מ"ל ​​פתרון DMSO) מראש ולאחסן את blebbistatin מומס ב 4 ° C.

2. הכינו פתרונות זלוף וההתקנה ניסיוני ⁷

4. טרי להכין פתרון Tyrode של 2L (128.2mM NaCl, 1.3mM CaCl ₂ (2H ₂ O), 4.7mM KCl, 1.05mM MgCl ₂ (6 שעות ₂ O), 1.19mM לאא ₂ PO _4, NaHCO ₃ 20mm, 11.1mM D-גלוקוז ב-pH deionized מים = 7.35 ± 0.05). אם הפתרון המניות נמצא בשימוש כדי להפוך 2L של הפתרון של Tyrode (די בניסוי אחד) לקחת 1750 מ"ל מים ומערבבים deionized ו 125 מ"ל של צילומים אני, 125 מ"ל של מלאי השנייה, 4 גרם של גלוקוז.
5. הפעל את שתי משאבות של מערכות טפטוף. הגדר את המשאבה peristaltic (Peri-Star, WPI, Sarasota, ארה"ב) המשמש זלוף מדרדר עד 40 mL / min. הגדר את המשאבה peristaltic אחרים (קול, בן הזוג Masterflex Peristalic L / S, משאבת קול, בן הזוג Instrument החברה, ורנון הילס, אילינוי) המשמש superfusion וכדי להחזיר את perfusate חזרה המאגר מחזיק עד 80 mL / min.
6. לשטוף את מערכת זלוף עם אתנול 70% למשך 30 דקות ולאחר מכן עם מים deionized 2L.
7. ברגע שכל המים deionized הוא פונה מהאולם, להפיץ פתרון של Tyrode ולהעביר אותו דרך פילטר של 5 מיקרומטר (Millipore, Billerica, מסצ'וסטס, ארה"ב). חם perfusate כדי 37 מעלות צלזיוס עם ז'קט מים circulator (ThermoNESLAB EX7, ניוטאון, ארה"ב) perfusate חמצן על ידי מבעבע O ₂ / CO ₂ (95% / 5%) גז לתוך התמיסה. צג ה-pH של התמיסה עם מד pH (Oakton מכשירים, ורנון הילס, IL) ולהתאים את שיעור O ₂ / CO ₂ מבעבע כדי לשמור על pH על 7.35 ± 0.05. המשך ניטור pH וטמפרטורה במהלך הניסוי.
8. מנגנון כפול מיפוי אופטי מורכב משני MiCAM Ultima-L-CMOS מצלמות (SciMedia, בקוסטה מסה, קליפורניה), כי יש מרחבית גבוהה (100x100 פיקסלים, 230 ± 20 מיקרומטר לפיקסל) ואת הפתרון הזמני (1,000-3,000 מסגרות / sec). תקן להקת עוברים סינון (590 ± 15 ננומטר, Thorlabs, ניוטון, NJ) מול המצלמה מיועדת הדמיה סידן, בעוד, ארוך לעבור סינון (> 700 ננומטר, Thorlabs, ניוטון, NJ) צריך להיות ממוקם מול המצלמה מיועדת הדמיה מתח. מצלמות מסודרים בניצב אחד לשני על ידי בעל, אשר מכיל מראה dichroic (635 הפסקת ננומטר, אומגה אופטי, Brattleboro, VT). מיד מתחת מחזיק את המצלמה כפול יש עדשה (ניקון עדשת 55 מ"מ 1:1.4 235,052), אשר מתמקדת את האור פליטה מגיע מלב אל המראה dichroic. המרחק העבודה היא 3 ס"מ בערך.
   האור מופק על ידי עירור מנורת הלוגן (Newport אוריאל מכשירים, סטרטפורד, CT, SciMedia, בקוסטה מסה, קליפורניה), והוא עבר דרך פילטר חום, תריס, ואת הלהקה לעבור סינון (520 ± 45 ננומטר). מדריך אור גמיש שמכוון את האור הלהקה לעבור סינון על הכנה, ואת תריס משמש כדי להבטיח הכנה הוא נחשף לאור רק במהלך רכישת התמונה להימנע photobleaching של צבעים.
9. הכן Ag / AgCl ₂ אלקטרודות עבור לצעוד חישה מראש ולהתקין אותם בחדר לפני הצבת לב. ודא מגברים ומסננים מותאמים לרמות המתאימות.

3. קציר הלב העכבר, cannulate, ולהקים זלוף Langendorff

10. להרדים את העכבר עם קטמין / xylazine (ketamin, 80mg/kg משקל גוף; xylazine, 10 מ"ג / ק"ג משקל גוף) וכן הפרין (100 יחידות) על ידי הזרקת intraperitoneal. להבטיח רמה נאותה של הרדמה על ידי היעדר רפלקס הכאב.
11. לאחר חתך באמצע sternal, להסיר במהירות את הלב לשטוף אותו מחומצן (95% O _2, 5% CO _2), טמפרטורה קבועה, (37 ± 1 ° C) הפתרון של Tyrode.
12. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לזהות במהירות את אבי העורקים, לגרום חתך נקי לאורך האאורטה עולה מתחת העורק subclavian הנכון. קטע קצר של האאורטה מחוברת אז מנהג עשה 21-מד צינורית עם טיפ מתרחבים. תפר 4-0 שחור קלוע משי (תאגיד Specialties כירורגי, קריאה, הרשות הפלסטינית) משמש כדי לתקן את הלב על הצינורית. לאחר cannulation, הלב perfused retrogradely ו superfused עם הפתרון של Tyrode. שיעור זלוף מדרדר מותאם בטווח של 2-5 mL / min כדי לשמור על הלחץ אאורטלי בין 60 ל 80 מ"מ כספית (מתמר לחץ, העולם דיוק מכשירים Inc (WPI), Sarasota, ארה"ב; גשר מגבר TBM4M, WPI, סרסוטה, ארה"ב).
13. לאחר cannulated הלב, הריאות, בלוטת התימוס, ורקמת השומן גזור אז הוסרו.
14. הלב מבודד הוא ניצח (כלים המדע פיין) בפסגת לחלק התחתון של החדר זלוף (מצופה Sylgard) כדי למנוע הזרם המושרה התנועה. הנספחים פרוזדורים ימין ועל שמאל נמתחים גם והצמיד (כלים המדע פיין, Inc, פוסטר סיטי, קליפורניה) לחלק התחתון של החדר, אשר מספק שטח מקסימלי עבור מדידות אופטיות של אטריה.
    חשוב מאוד! צינורית סיליקון קטנה מוכנס לתוך החדר השמאלי דרך הוורידים ריאתי קבוע על ידי תפר משי ורקמות החיבור הסמוך. זה מונע גודש פתרון החמצה של perfusate לכודים החדר השמאלי, אשר חשוב במיוחד לאחר דיכוי של התכווצויות חדרית עם uncoupler עירור, התכווצות (ראה שלב 4 חלק 19).
15. אלקטרודה בהתאמה אישית ממוקם על פני השטח של הלב לנהל את הגירויים צעדה, אשר מופק על ידי Master-8 (AMP מכשירים בע"מ, ירושלים) או PowerLab 26T (AD מכשירים, סידני, אוסטרליה).
16. זכוכית לכסות קטן הוא קבוע על פני השטח של הפתרון על הלב כדי להפחית חפץ תנועה מפתרון רוטט.
17. פוקוס אור עירור על הלב. בנוסף, להתאים את המרחק בין מנגנון המצלמה כפול ואת הלב, כך הרזולוציה המקסימלית יושג.
18. כבו כל האורות בחדר להתחיל הקלטות חשמל באמצעות PowerLab 26T.

4. טען מתח צבעים סידן רגיש עירור-התכווצות uncoupler

19. התחממות של 0.6 מ"ל blebbistatin. מערבבים 0.5 מ"ל של blebbistatin עם perfusate במאגר מחזיק. לדלל את הנותרים 0.1 מ"ל של blebbistatin ב 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode לאט להזריק אותו (במשך 20 דקות) דרך יציאת תרופה ממוקם ליד הצינורית. שימו לב כמו blebbistatin בהדרגה מפחיתה את חפץ בתנועה.
20. מדולל 30 μL של מתח פתרון המניות רגיש RH237 צבע בתמיסה של 1 מ"ל Tyrode לאט להזריק מעל 5-7 דקות ליציאת זריקה כמו blebbistatin.
21. 30 μL אינדיקטור סידן Rhod-02:00 היא 01:01 מעורבב עם Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, פתרון של 20% DMSO) ולאחר מכן בתמיסה מדוללת 1 מ"ל של Tyrode ויישומי לאט דרך נמל הזרקה אותו במשך 5-10 דקות .
22. המתן 5-10 דקות עבור blebbistatin וצבעים להגיע קרום התא cytosol. המשך הפרוטוקול כאשר תנועה מדוכאת לחלוטין.
23. לפקח באופן רציף הקלטות א.ק.ג. על ההליך כולו כדי להבטיח תפקוד תקין חשמלית של הלב.
24. להתחיל הקלטות אות ניאון באמצעות אישית SciMedia תוכנה (SciMedia, בקוסטה מסה, קליפורניה).

5. נציג התוצאות:

באיור 1. התקנה ניסיונית עבור זלוף, הקלטות חשמל מיפוי אופטי.
EM = פליטת; Lp = longpass

איור 2. הכנה ניסויית דוגמאות אות שנרשמו במהלך צעדה חדרית. משמאל: אותות א.ק.ג. נאספים Ag / AgCl ₂ אלקטרודות דיסק (למעלה) ו דוגמה פרוטוקול S1S1 גירוי מוצג (התחתונה). במרכז: לב Langendorff הכנה העכבר. מימין: נציגת פוטנציאל פעולה אותות אופטיים סידן חולפת מן הפרוזדורים (למעלה) ואת החדרים (התחתון) מוצגים. חץ צהוב (למעלה) מצביע על פיזור האות ניאון בא החדרים, אשר ראו את הקלטות פרוזדורים.
LV = החדר השמאלי, RV = החדר הימני; LA = שמאל אטריום; RA = ימין אטריום

איור 3. הקלטות אופטי נציג V _{מ 'החתול} החדרים של הלב סוג בר העכבר. א הכנה ניסיוני עם מערך של מיקומים מחולקת באופן שווה מסומן על ידי נקודות שחורות אשר הקלטות אופטי ניתן לראות (C). דוגמה ב 'מעקב של V _מ' חתול ממיקום מרכזי במערך (ראו מסגרת in (ג)). ג V _{מ '(כחול)} CAT (אדום) של מערך של מיקומים מחולקת באופן שווה. איתותי היו זרקת לפח 3x3.

איור 4. המפה הפעלה הולכה. א ההפעלה למשל מפה לב פראי סוג עכבר עם רוחבי (T) ו אורכית (L) הכיוונים מסומנים על ידי חצים לבנים. ב V אותות _{מ '(למעלה)} ו DV / dt (התחתון) המתאים שלוש נקודות לראות (T1, T2, T3, L1, L2, L3).

איור 5. פוטנציאל פעולה וניתוח חולף משך סידן. א משך פעולה פוטנציאליים repolarization 80% (APD80) ומשך סידן חולפת על רגיעה 80% (CaD80) המפות מוצגות מלב בתנאים השליטה (משמאל) לאחר יישום 30 nM isoproterenol (מימין). צבע צהוב / ירוק החדרים (ימין) מציין isoproterenol מקוצר APD80 ו CaD80. דוגמה ב 'העתקים של APD80 ו CaD80 מהעכבר החדרים בר סוג (למעלה) ו - אטריה (התחתונה).

Discussion

בניסוי זה שינינו את שיטת זלוף Langendorff ידי הוספת צינורית סיליקון קטנה, אשר הוא חיוני במיוחד לאחר דיכוי התכווצויות חדרית עם uncoupler עירור-התכווצות. צינורית סיליקון משמש כדי למנוע גודש פתרון, החמצה של הפתרון זלוף, ופיתוח של איסכמיה של החדר השמאלי. הלב העכבר רגיש מאוד היפותרמיה, ולכן וריאציות הטמפרטורה על פני הלב תגרום הבדלים מלאכותיים משך פוטנציאל פעולה. כתוצאה מכך, מערכת חימום בוצע בתא זלוף על מנת לשמור על טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במהלך מכלול הניסוי ^8. מאז מודל Langendorff אינו שומר העצבוב של הלב, צריך לשקול להוסיף עצביים אל perfusate על מנת לחקור את הטון אוהד הפאראסימפתטית פיזיולוגיים ^9. מלבד זלוף מדרדר, תוספת של superfusion הלב עוזר לשמור על פרמטרים סביבתיים מתאימים כגון pH וטמפרטורה. בשיטה זו, בלב Langendorff perfused הונח אופקית. התקנה אנכית זלוף Langendorff יכול לשמש גם ^10, אך עלולה לגרום מכניקה לב שונה במקצת ^11. בנוסף CMOS מצלמות, גלאים חלופיים זמינים גם יכול להיות מיושם על המפה V _{מ 'חתול} בו זמנית ^12.

יישום של מצלמות CMOS ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן מבטיח את הדיוק של הקלטות, אולם אותות מיפוי אופטי אינם מתא בודד. במקום זאת, כל אות ניאון נובע מאות או אלפי תאים, בהתאם הגדלה אופטית. הקרינה חדרית הרבה יותר גדול יכול לעוות אותות פרוזדורים על ידי פיזור אופטי, ולכן פרשנות זהירה של אותות רשמה אופטית נדרש. מגבלה נוספת של הכנה העכבר הוא עיוות האות לרעש הנגרם על ידי העקמומיות של פני השטח בשל גודלו הקטן של הלב ^13. מדידות מהירות הולכה ניתן לשנות לא רק עקמומיות הלב העכבר אלא גם קוטביות אלקטרודה אלקטרודות וירטואלי. כדי להשיג דיוק עבור מהירות ההולכה, אנאיזוטרופיה ההפעלה, ומפות repolarization, נכון התמקדות של המצלמה על פני השטח של הלב היא חיונית.

בשיטה זו, בזמן אמת הקלטות א.ק.ג. ניתן להשלים את החקירה אופטי של electrophysiology לב. מתח רגיש צבען (RH237) ו אינדיקטור סידן (Rhod, 02:00) משמשים בפרוטוקול בגלל תגובה מהירה שלהם, עירור דומה, ספקטרום פליטה ברורים ^3,7. קיימים שילובים של צבעים חלופיים שניתן להשתמש בהם כדי למדוד V _{מ 'חתול} אחר מאשר RH237 ו-Rhod 02:00 ^3. לצבוע רומן מתח רגיש, PGHI, עם שינוי גדול של סטוק (> 200nm) נמצא כדי לאפשר יותר _מ V אותות חתול בגלל הפרדה גדולה יותר של אורכי גל הפליטה בין PGHI ו-Rhod 02:00 ^14. שיפורים עתידיים עשויים להתמקד בחקר בדיקות ניאון רומן, פיתוח של גלאי הדמיה חדש, תוכנת עיבוד תמונה משופרת. רזולוציה גבוהה הרומן שיטות הדמיה אופטית למיפוי אופטי 3D הם גם הכיוונים העתידיים החשובים של מיפוי אופטי ^5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
כימי	חברה	מספר קטלוגי
NaCl	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	S271-1
CaCl 2 (2H 2 O)	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	C79-500
KCl	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	S217-500
MgCl 2 (6 שעות 2 O)	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	M33-500
לאא 2 PO 4 (H 2 O)	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	S369-500
NaHCO 3	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	S233-3
D-גלוקוז	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	D16-1
Blebbistatin	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	1760
RH237	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	S1109
Rhod, 02:00	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	R1244
Pluronic F127	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	P3000MP
Sulphoxide דימתיל (DMSO)	סיגמא, סנט לואיס, מיזורי	D2650