الصلبة مرحلة تجميع Submonomer من البوليمرات Peptoid واحترامهن الجمعية ، في الارتحال التي تأمر Nanosheets

Summary

ويرد بسيطة وعامة التوليف peptoid الطريقة اليدوية التي تنطوي على المعدات والكواشف الأساسية المتاحة تجاريا ، مما يمكن توليفها peptoids بسهولة في معظم المختبرات. يوصف التوليف ، وتنقية وتوصيف ل36mer peptoid amphiphilic ، وكذلك التجميع الذاتي حيز العالية أمر nanosheets.

Abstract

Peptoids هي فئة جديدة من بيوميمتيك ، غير الطبيعية تسلسل الخاصة التي تقاوم التحلل البروتيني heteropolymers ، المعرض نشاط بيولوجي محتمل ، وأضعاف النانو في أعلى الترتيب. يشبه في بنيته الببتيدات ، وبولي peptoids N - استبداله glycines ، حيث تعلق على الجانب سلاسل النيتروجين بدلا من الكربون ألفا. تخفيف بهم من التوليف والتنوع الهيكلي يسمح اختبار مبادئ التصميم الأساسية لمحرك دي نوفو تصميم وهندسة المواد الجديدة النشطة بيولوجيا وذات البنية النانومترية.

هنا ، هو تقديم دليل بسيط peptoid بروتوكول التوليف التي تسمح للتوليف polypeptoids سلسلة طويلة (تصل إلى 50mers) في غلة ممتازة. مطلوبة المعدات الأساسية فقط ، وتقنيات بسيطة (مثل نقل السائل ، والترشيح) ، والكواشف المتاحة تجاريا ، مما يجعل peptoids إضافة إلى مجموعة أدوات للوصول العديد من الباحثين. ويزرع في العمود الفقري peptoid one مونومر في وقت تIA submonomer الأسلوب الذي يتكون من مرحلتين مونومر دورة بالإضافة إلى ذلك : أسيلة والتشريد. أولا ، وحامض bromoacetic تفعيلها في الموقع مع N ، N' - diisopropylcarbodiimide acylates راتنج متجهة الأمينات الثانوية. الثانية ، والتشريد محب النواة من بروميد من الأمينات الأولية التالي لتقديم سلسلة من الجانبين. وكرر دورة على مرحلتين حتى يتم الوصول إلى طول السلسلة المطلوب. كفاءة اقتران هذه الدورة على مرحلتين يتجاوز عادة 98 ٪ ويمكن تجميع peptoids طالما 50 البقايا. سلاسل متنوعة الانضباطي للغاية ودقيقة وقابلة للتحقيق كيميائيا مع أسلوب submonomer كما يمكن أن المئات من الأمينات الأولية متوفرة بسهولة إدراجها مباشرة.

Peptoids آخذة في الظهور كمادة بيوميمتيك تنوعا للبحوث nanobioscience لما لها من قوة الاصطناعية ، والمرونة ، ويأمر على المستوى الذري. للطي من سلسلة واحدة ، انفورما ، amphiphilicوقد تجلى مؤخرا نشوئها الغنية polypeptoid الى nanosheet العالية المطلوبة. هذا هو peptoid 36 مير التي تتكون من المونومرات ثلاثة فقط متاحة تجاريا : مسعور ، وأنيوني الموجبة. ودفن مسعور سلاسل الجانب الفنيل في حين أن جوهر nanosheet أمين الأيونية وسلاسل محاذاة الجانب الكربوكسيل على وجوه ماء. وnanosheets peptoid بمثابة منصة المحتملة لmimetics الغشاء ، mimetics البروتين ، وتصنيع الجهاز ، وأجهزة الاستشعار. ووصف الطرق لتخليق peptoid ، وتشكيل ورقة ، والتصوير المجهري وتوفر طريقة بسيطة لتمكين التصاميم nanosheet peptoid المستقبل.

Protocol

1. المرحلة الصلبة التجميعي Submonomer من Polypeptoids

الصلبة مرحلة التوليف (SPS) هو أسلوب شائع يستخدم لتجميع تسلسل محدد البوليمرات الحيوية خطوة حكيمة ، بشكل مباشر على دعم الصلبة الخاملة مثل حبة راتنجات البوليمر. ارتفاع غلة اقتران وسهولة ازالة الزائدة المتفاعلة من المزايا الرئيسية لSPS. بعد رد فعل اقتران لالراتنج ، ويتم صرفها ببساطة الكواشف الزائدة وتغسل حبات ليكون جاهزا لاتخاذ الخطوة رد فعل المقبل. بعد رد فعل التجميع النهائي ، والمشقوق على كامل طول oligomers من الراتنج ويمكن دراسة المواد الحلول مرحلة أخرى. هنا ، علينا أن نكيف الداخلي الصحة والصحة النباتية لتوليد بوليمرات تسلسل محدد peptoid.

1. ويمكن تنفيذ كل الخطوات من التوليف peptoid دليل أصل في البولي بروبيلين ، والقابل للتصرف (PP) خرطوشة fritted أو رد فعل الزجاج fritted السفينة مجهزة محبس 3 الطريقة : الإعداد. تنفيذ كافة العمليات في غطاء الدخان. لحضانات في زسفينة معشوقة أو خرطوشة من البلاستيك ، وربط ذراع واحدة لتوريد النيتروجين إلى فقاعة بلطف الحل السليم للخلط. بدلا من ذلك ، على سبيل رد الفعل في حضانات خرطوشة القابل للتصرف ، وختم كلا طرفي خرطوشة مع القبعات ومكان على شاكر الدوارة. لاستنزاف مخاليط رد فعل أو يغسل ، وصل الى منزل عن طريق فخ الفراغ النفايات. وينبغي fritted السفينة مع فريت الخشنة. Siliconize وعاء التفاعل لتفادي الزجاج حبات من الالتصاق على جدران الوعاء الزجاجي. يعد حل dichlorodimethylsilane 5 ٪ في ثنائي كلورو إيثان (V / V). ملء وعاء التفاعل نظيفة وجافة إلى أعلى مع الحل siliconizing ، اسمحوا الجلوس لمدة 30 دقائق ، ثم تصفى. غسل الإناء مرة واحدة مع DCE ومن ثم مرة واحدة مع الميثانول. يمكن إعادة استخدامها في حل siliconizing ، لذا يجب أن يتم حفظها. اما الهواء الجاف أو التخلص من أي حل الزائدة وأخبز الأواني الزجاجية حتى يجف بعد إزالة محبس. عاء التفاعل بارد قبل إضافة الراتنج.
2. إضافة 100 ملغ (0.06 ملمول) من إعادة أميد التزلجالخطيئة لfritted عاء التفاعل. تنتفخ الراتنج بإضافة 2 مل من ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF). تستنهض الهمم عن طريق هز أو محتدما لمدة 10 دقيقة. حل عن طريق استنزاف فراغ لعزل راتنج تضخم.
3. إضافة 1 مل من 20 ٪ في 4 methylpiperidine DMF (V / V) لdeprotect المجموعة Fmoc. تستنهض الهمم لمدة 2 دقيقة ويصفى. كرر مع احتضان 12 دقيقة.
4. شطف راتنج بإضافة 2 مل من DMF ، تهييج لمدة 15 ثانية ، واستنزاف. كرر 3X.
5. Bromoacetylation : إضافة 1 مل من حمض bromoacetic 0.6 م (0.6 ملمول) في DMF و 86 ميكرولتر من N ، N' - diisopropylcarbodiimide (0.93 مكافئ ، 0.56 ملمول). احتضان محتدما مع لطيفة لمدة 30 دقائق ، ثم تصفى وشطف مع 2 مل من DMF (اكرر 4X).
6. الإزاحة : أضف 1 مل من الأمينات M 1-2 في N - methylpyrrolidinone. احتضان محتدما مع ل30-120 دقائق ، ثم تصفى وشطف مع DMF (4X 2 مل).
7. تستمر في النمو سلسلة peptoid بتكرار دورة submonomer خطوات 1.5 (bromoacetylation) و 1.6 (displacemenر).

8. بعد الانتهاء من النزوح النهائي ، شطف مع 2 مل من DMF (اكرر 4X) ، ثم 2 مل من ثنائي كلورو ميثان (اكرر 3X). قبعة وتخزينها في وعاء التفاعل حتى الانقسام.
9. وقفة في التوليف (اختياري) : لإيقاف خلال توليفة peptoid ، والانتهاء من رد الفعل التشرد ومتابعة الخطوة 1.8. لمواصلة النمو في سلسلة peptoid ، أعد تشغيل التجميعي راتنج إعادة تورم المجففة (الخطوة 1.2) وتكرار دورة submonomer (الخطوة 1.5 و 1.6). يمكن أن تجفف الراتنج وتخزينها بعد أي النزوح والتشريد باستثناء 2 لأن المتقارن الراتنج peptoid قد تشكل الجانب ثنائي كيتوبيرازين دوري المنتج.
10. لتوليفات متعددة في وقت واحد ، فمن المستحسن فراغ استخراج الصلبة المرحلة المتعددة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة. ويمكن أيضا أن يكون توليف Peptoid الآلي عن طريق البرمجة بشكل صحيح الأساليب في تخليق الببتيد المتاحة تجاريا ، مثل أبيكس Aapptec 396 ، CEM المزج الميكروويف الحرية وتكنو البروتينlogies المزج تمهيدا شركة.

2. الانقسام وDeprotection الجانبية سلسلة

1. نقل كل من راتنج المجفف إلى قارورة من الزجاج 20 مل التلألؤ.
2. العمل داخل غطاء محرك السيارة ، واستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، إضافة 4 مل من حمض trifluoroacetic (TFA) كوكتيل تشطر ¹ (على سبيل المثال 95 ٪ عبد القدير. TFA ، انظر المناقشة) إلى قارورة زجاجية التلألؤ وغطاء بإحكام. يهز لمدة 10 دقيقة الى 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (انظر المناقشة).
3. جمع حل الانقسام TFA من خلال تصفية الراتنج خلال خرطوشة القابل للتصرف ، PP fritted في عالم جديد ، قبل وزنه 20 مل قنينة زجاجية التلألؤ. ويمكن التخلص منها ، PP ماصة غير مريحة لنقل الحلول كوكتيل الانقسام.
4. إضافة 1 مل من الكوكتيل الطازجة الانقسام لشطف الراتنج وجمع أي peptoid المتبقية. كرر 2X.
5. تتبخر TFA التي تهب تيار لطيف من النيتروجين أو باستخدام V10 Biotage المبخر.
6. Redissolve النفط الخام في 6 ملمن أسيتونتريل / الماء 1:1 (V / V) لهبلك. تجميد وlyophilize. تكرار.
7. سجل الوزن من الناتج الخام. مخزن على شكل مسحوق جاف في -20 درجة مئوية
8. يمكن إجراء الاختبار على الانقسام 0.5 ٪ من الراتنج لتحديد سرعة ونقاء كتلة peptoid توليفها وعما إذا كانت ظروف الانقسام اختيار الصحيح : تشطر اختبار (اختياري). اختبار الانشقاقات هي مفيدة بشكل خاص لرصد التقدم المحرز في عملية التجميع.

3. توصيف وتنقية Polypeptoid

1. من خلال مزيج من HPLC التحليلية ، MS - LC electrospray ، و / أو TOF MALDI ، تحديد نقاء المنتج الخام وعما إذا كان الوزن الجزيئي هو المطلوب حاليا.
2. تعد ~ 50-10 ملغ / مل حل مسحوق جاف peptoid في المياه مع الحد الأدنى من أسيتونتريل حسب الحاجة للذوبان. الحل واضح تصفية من الناتج الخام peptoid مع 0.45 ميكرون تصفية حقنة لإزالة الغبار والجسيمات.
3. التحليلية Hالمجلس التشريعي الفلسطيني وelectrospray LC - MS : إعداد _~ 20 ميكروغرام / مل حل peptoid الخام. تصفية 200 ميكرولتر مع 0.45 ميكرون تصفية وضخ 20 ميكرولتر.
4. MALDI : اخلطي 1 ميكرولتر من peptoid _~ ملغ / مل 20 مع 1 ميكرولتر المصفوفة. البقعة 1 ميكرولتر على لوحة MALDI والسماح للهواء الجاف. ووضع مصفوفة الاستحواذ يعتمد على العينة (الشكل 5).
5. تنقية مزيج النفط الخام peptoid مع HPLC الإعدادية عكس المرحلة. اختيار الانحدار والعمود (C4 أو C18) على أساس من hydrophobicity polypeptoid. الجمع بين تنقية الكسور ، وتجميد ، وlyophilize ، مما أسفر عن مسحوق أبيض رقيق. سجل وزن المنتج النهائي.
6. تشكيل ملح حمض الهيدروكلوريك (اختياري) : Redissolve مسحوق مجفف بالتجميد في حمض الهيدروكلوريك 100 ملم (aq.) مع الحد الأدنى من الأسيتونيتريل. نقل إلى ما قبل وزنه قنينة زجاجية. تجميد وإعادة lyophilize. كرر 2X. Reweigh لتحديد كتلة من مسحوق peptoid.

4. Peptoid تشكيل Nanosheet

قصر هذا المقطعcribes بروتوكول لتشكيل ورقة من سلسلة واحدة ، وتسلسل ، amphiphilic محددة مير peptoid 36 (الشكل 1). بعد توليفها حبلا peptoid ، منقى ، ومجفف بالتجميد على النحو الموصوف أعلاه ، هو حل مسحوق أبيض في الناتج DMSO لجعل مخزون مم 2 الحل.

1. إعداد 500 ميكروليتر من محلول 20 ميكرومتر في peptoid العازلة تشكيل ورقة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0 في الماء) في قنينة زجاجية الدرام 1. الأولى ، إضافة 445 ميكرولتر من الملة - Q المياه ، و 50 ميكرولتر من 10X ورقة تشكيل العازلة ، ودوامة لالمزيج. ثم ، إضافة 5 ميكرولتر من 2 ملم peptoid حل الأسهم وحل دوامة بلطف. غطاء القارورة الزجاجية.
2. تتكون من صفائح رقيقة من الهياج الحل peptoid مائي مخفف. تميل ببطء القارورة الزجاجية من الوضع الأفقي إلى الوضع العمودي في النتائج ورقة. لطيفة تهز الغلة أيضا ورقة ، ولكن الأوراق تميل إلى أن تكون أصغر حجما وأقل مع حواف مستقيمة. تحليل أكثر دقة ورقة وآلية تشكيل reporteد بشكل منفصل. ²
3. لأوراق عالية الجودة كثيرة ، تدوير القوارير الزجاجية حول محور أفقي ببطء (<1 دورة في الدقيقة) لمدة ثلاثة أيام. RKVSD والموارد التقنية الملائمة Rotamix المدورة أنبوب أو الروك مخصصة يمكن أن تؤدي هذه بشكل مستمر.
4. غسيل الكلى من Nanosheets (اختياري) : في بعض التطبيقات ، قد يكون من الضروري إزالة أي سلاسل حرة أو مخازن peptoid / الأملاح. بلل تعويم - A - Lyzer 100 دينار كويتي في الأغشية العازلة المطلوب لمدة 15 دقيقة. تحميل 500 ورقة peptoid ميكرولتر حل في غرفة العينة. نقع في 500 مل من المخزن المطلوب ، التحريك بقضيب تحريك مغناطيسي في 60 دورة في الدقيقة. تسمح غسيل الكلى من أوراق والمضي قدما لمدة 4 ساعات. كل ساعة ، وتبادل مع الأسهم الجديدة من حل العازلة.

5. مضان المجهر من Nanosheets

1. وقد التقط صورا مضان من nanosheets مع الأحمر النيل ، وهي الصبغة الحساسة بيئيا التي تزيد كثافة مضان عندما يكون موضعيا في اللمفophobic البيئات (الشكل 2).
2. إضافة 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر النيل الأحمر إلى 100 ميكروليتر من محلول nanosheet للحصول على تركيز النهائي من 1 ميكرومتر الأحمر النيل.
3. جعل الحل agarose 1 ٪ من الماء الساخن ويسكب في طبق بتري بلاستيكية. ضمان حل agarose ما يقرب من 1 / 8 بوصة سميكة ويسمح الحل لتهدئة دون عائق على سطح مستو. بعد غروب agarose ، واستخدام ملعقة لخفض ونقل المربعات 1 سم x 1 سم إلى شريحة زجاجية.
4. لجمع الأوراق في نفس الطائرة ، بقعة 1 ميكروليتر من محلول الورقة على قطعة من agarose. السماح لاستيعاب agarose العازلة لمدة 2 دقيقة ، وترك ورقة على السطح. صورة في غضون 15 دقيقة ، وإلا سوف تبدأ agarose لتشويه بسبب الجفاف.
5. إلى أوراق الصور في الحل ، تحميل 15 ميكرولتر داخل طوقا قطره 20 ملم ملم 0.12 على شريحة زجاجية. تغطية مع ساترة. إذا كنت تقع ببساطة الأوراق بين شريحة زجاجية وساترة دون حشية ، العديد من أوراق وايوسوف القص وتبخر طفيفة على ما يبدو سبب لنقل الأوراق باستمرار.
6. صورة ورقة تحت الإضاءة epifluorescence (مثلا IX81 أوليمبوس المجهر المقلوب مزودة iXonEM Andor + الأطياف EMCCD مع فلتر الحمراء ولاية تكساس).

6. المجهر الإلكتروني (SEM) من Nanosheets

1. البلازما من حفر الركيزة السيليكون (اختياري) : إن رقائق السيليكون وحفرت البلازما للمساعدة في امتصاص الأوراق. وضع رقائق السيليكون في غرفة فراغ نظافة البلازما (مثل Harrick البلازما الأنظف / معقم PDC - 32G). مضخة أسفل إلى 200 mTorr وتعيين لفائف RF 18W (الإعداد عالية لPDC - 32G). حفر لمدة 2 دقيقة.
2. بنسبة 20 ميكرولتر من محلول رقة peptoid على ركيزة السيليكون البلازما المعاملة. السماح للجلوس لمدة 3 دقائق. الحل إزالة الزائدة مع غيض من كيم مسح. ماصة 20 ميكروليتر من الماء على سطح وإزالة الزائد الحل مرة أخرى لإزالة العازلة والأملاح. كرر 4X.
3. بدلا من ذلك ، اطلبyze الحلول رقة peptoid ضد الماء لإزالة العازلة والملح. بنسبة 20 ميكرولتر من محلول رقة مدال على ركائز السيليكون البلازما المعاملة. الهواء الجاف العينة.
4. صورة ورقة مع SEM (مثل زايس الجوزاء الترا - 55 الكترون مجهر المسح التحليلي) مع كاشف في عدسة والحزم في الطاقات بين 1 كيلو فولت و 5 كيلو فولت (الشكل 3).

7. سلامة ملاحظات :

1. ويشتبه بشكل معقول وثنائي ميثيل ثنائي كلورو ميثان المسرطنة.
2. N ، N' Diisopropylcarbodiimide ، 4 methylpiperdine وحمض bromoacetic تشكل خطرا على الجلد والعينين والجهاز التنفسي. وينبغي استخدامها في غطاء محرك السيارة بعناية. قد تكون سامة إذا تم استنشاقها أو امتصاصها عن طريق الجلد ، والتعرض قد يؤدي في التوعية. الحاويات الفارغة تحتفظ بقايا المنتج (السائل / بخار) ، وينبغي أن تشطف جيدا قبل إزالتها من غطاء محرك السيارة.
3. TFA هو حمض قوي ومدمر للغاية على الجهاز التنفسي العلوي والعينين ، والجلد. TFA أيضا المتطايرة إبقاء حلول مركزة من TFA في غطاء المحرك في جميع الأوقات لتجنب الضرر التنفسي. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، والحذر عند التعامل مع حلول TFA. تغيير القفازات على الفور إذا كانت تأتي في اتصال مع TFA ، وتنظيف أي انسكابات فورا.

8. ممثل النتائج :

هذا المقطع يصف التوليف ، وتوصيف ، وتنقية تسلسل محدد سلسلة peptoid 36 مير أن تطوي إلى nanosheet أمر غاية ³ (الشكل 1).

كتلة المسؤول peptoid H - [ناي - NPE] ₉ -- تم تصنيعه [NCE - NPE] ₉ - NH ₂ على 100 ​​ملغ من راتنج أميد حلبة التزلج. واستخدمت حل الأمينات 2 M لجميع ردود الفعل التشرد ، والتي نفذت لمدة 60 دقيقة بحثا عن بقايا 1-18 و 120 دقيقة لبقايا 19-36. تم تحويل ر بوتيل بيتا ألانين حمض الهيدروكلوريك إلى قاعدة الحرة (انظر المناقشة) في حين الفينيثيلامين والإيثيلنديامين BOC - كانا directl المستخدمةY. وكان المشقوق الراتنج مع TFA 95 ٪ ، triispropylsilane 2.5 ٪ ، 2.5 ٪ ماء لمدة 2 ساعة. وقد تبخرت TFA وكان النفط اللزج الناتجة (~ 180 ملغ) إعادة حله في أسيتونتريل مل 6 : الماء 1:1 (V / V). وتم تأكيد نقاء المنتج (الشكل 4) وجود كتلة من المنتج بواسطة RP - HPLC التحليلية (30-80 ٪ في الانحدار أسيتونتريل المياه ، سواء التي تحتوي على 0.1 ٪ (V / V) TFA ، في 1 مل / دقيقة أكثر من 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية مع ميكرومتر C18 5 ، و 50 مم X العمود 2) وMALDI (الشكل 5).

وشرع مع تنقية HPLC المرحلة العكسي على عمود C18 Vydac (10 ميكرون و 22 ملم x 250 ملم) ، وذلك باستخدام الانحدار 30-60 ٪ من أسيتونتريل في الماء مع TFA 0.1 ٪ على مدى 60 دقيقة في 10 مل / دقيقة. تم تحميل العمود مع 60 ملغ من الناتج الخام لتشغيل كل الكروماتوغرافي. تم الجمع بين الكسور تنقيتها على أساس من النقاء RP - HPLC التحليلية (الشكل 4) ، ومجفف بالتجميد لانتاج _~ 80 ملغ من مسحوق أبيض رقيق.

تنقية كتلة المسؤول peptoid الجزيئيةوأكد الوزن عن طريق MALDI. كانت مختلطة الماء 1:1 (V / V) مع 1 ميكرولتر من مصفوفة (5 ملغ / مل α - cyano - 4 - hydroxycinnamic الحمضية في أسيتونتريل : : 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر تنقية المياه peptoid في أسيتونتريل 01:01 V / V و وقد رصدت 0.1 ٪ TFA) وميكرولتر 1 على لوحة MALDI. بعد العينة المجفف في الهواء ، وضعه في Biosystem التطبيقية / MDS 4800 SCIEX محلل TOF / TOF MALDI. وكانت وسائل اقتناء وتجهيز انخفاض الكتلة الخطية. تم إدخال الوزن محسوب في الكتلة المستهدفة لضبط تلقائيا للمرة تأخير. تم تعيين كثافة الليزر إلى 3400. الكتلة المرصودة ، 4981.2 ، المباريات عن كثب لكتلة المحسوب 4981.74.

حلت مسحوق مجفف بالتجميد المنقى في DMSO لجعل مخزون مم 2 الحل ، والتي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية. وأعدت ورقة عن طريق البروتوكول المشار إليها ، والتقط مع المجهر الضوئي ومضان SEM (الشكل رقم 2 و 3). ويلاحظ ومجموعة متنوعة من الأشكال مع أحجام ميزة تتراوح ما يصل إلى 300 ميكرون ، وnotabلاي والحواف المستقيمة بارزة.

الشكل 1 تسلسل كتلة المسؤول peptoid H - [ناي - NPE] ₉ -- [NCE - NPE] NH - _{9 2.} سلسلة واحدة ، تهمة عرقلة ، polypeptoid amphiphilic 36 ميه الذاتي في تجمع عالي أمر nanosheets ثنائي الأبعاد ، ^3. الوزن الجزيئي هو محسوب 4981.74.

الشكل 2. الصور المجهري الإسفار من nanosheets peptoid. وقد تشكلت من أوراق الحل peptoid 20 ميكرون في تريس 10 مم ، 100 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0. تم تصوير الأوراق على agarose مع 1μM النيل الأحمر. أشرطة النطاق هي 100 ميكرون.

الشكل 3. مسح الصور الإلكترون المجهريمن nanosheets peptoid. وقد تشكلت من أوراق الحل peptoid 20 ميكرون في تريس 10 مم ، 100 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.0. أشرطة النطاق هي 5 ميكرون.

الشكل 4 التحليلية عكس المرحلة HPLC اثر H - [ناي - NPE] ₉ -- [NCE - NPE] NH - _{9 2.} النفط الخام وتنقيته HPLC التحليلية التتبع (30-80 ٪ التدرج في 1 مل / دقيقة أكثر من 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية مع ميكرومتر C18 5 ، 50 × العمود مم 2) من النفط الخام وتنقيته كتلة المسؤول peptoid H - [ يظهر [NCE - NPE] ₉ - NH ₂ -- دار الوثائق NPE - _9].

الشكل 5 - TOF MALDI مطياف الكتلة اثر H - [ناي - NPE] ₉ -- [NCE - NPE] NH - _{9 2.} الكتلة المرصودة ، 4981.2 ، في الاتفاق على مقربة من الكتلة المحسوبة ، 4981،74.

Discussion

وأهمية التطبيقات

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لتجميع وpeptoid مائي التجميع الذاتي للpeptoids في nanosheets. معظم المختبرات قادرة بسهولة من تجميع peptoids لأن المواد الرخيصة ، والخبرات والتقنيات الأساسية واضحة وتستخدم ^4. وبالمثل ، فإن التجميع الذاتي للرقيقة جدا nanosheets العالية أمر يتطلب مجرد تكرار إمالة قارورة حل peptoid مائي مخفف ^2. Peptoids هي مادة واعدة للبحوث الطبية البيولوجية وعلم النانو لأنها قوية ومرنة صناعيا بعد تسلسل محدد والانضباطي للغاية ^5. وقد أثبتت Peptoids النشاط البيولوجي ^(6،7 المداواة ، والتشخيص ⁸ ، والتسليم بين الخلايا ^9-10) وقابلة للطي في النانو الهرمية ^{3 ، 11-14.} بسبب التركيب على وحدات ، واندماجي peptoid librويمكن تصنيعه بسهولة ^15-19 الحمل وفرزهم لسلسلة واسعة من الأنشطة أو الممتلكات. على وجه الخصوص ، nanosheets بمثابة منصة المحتملة لعرض السقالات ثنائي الأبعاد ، mimetics الغشاء ، وأجهزة الاستشعار البيولوجية ، وتصنيع البروتين mimetics الجهاز. مع تسلسل مختلف ممكن عمليا لا ينضب ، عالم الأبحاث peptoid تتوسع بسرعة.

المتغيرات في التوليف submonomer الصلبة مرحلة polypeptoids

لأن القدرة على اختيار من لا يصدق أبجدية كبيرة ومتنوعة من مونومرات ²⁰ ، الأسلوب submonomer يحتاج تعديلات في بعض الأحيان عن الحالات التي تكون فيها زيادة كفاءة اقتران كل خطوة من شأنها تحسين العائد الناتج الكلي. ادراج محمية سلاسل الجانب متجانسة يتطلب استخدام حمض الكلوروأسيتيك بدلا من حمض bromoacetic ^21. تمديد أوقات التشرد والتعليم العاليوتستخدم عادة تركيزات الأمينات بعد حوالي 20 جوانات لمتواليات peptoid طويلة أو الأمينات أقل أليف النواة. تسخين وعاء التفاعل إلى 35 درجة مئوية ، وذلك باستخدام سفينة رد فعل المياه تغلف ، ويساعد على دفع التفاعل. لدرجة عالية من الأمينات المتقلبة مثل isopropylamine ، لا بد من توخي الحذر لتجنب التبخر.

الأمينات في شكل ملح حمض الهيدروكلوريك ، مثل حمض الهيدروكلوريك بيتا ألانين تي بوتيل ، والحاجة ليكون حرا مقرها قبل أن يتم عرضه في رد فعل التشرد. ويمكن تحقيق هذا عن طريق إذابة أو تعليق أمين في DCM (~ 5G amine/25 مل DCM) ، وتحييد بمحلول متساوي المولية من هيدروكسيد الصوديوم المائي في قمع separatory. ويتم جمع طبقة DCM ويغسل طبقة مائية مع DCM إضافية. تجفف طبقات DCM مجتمعة أكثر من كبريتات الصوديوم وتصفيتها في أسفل القارورة الجولة ما قبل وزنه. إزالة المذيب عن طريق التبخر دوارة لتسفر عن النفط ، وتسجيل وزن المنتج.

الزيتوز الخطوة الانقسام ، TFA كوكتيل الانقسام والانقسام الوقت يعتمد على عدد ومتنوعة لحماية الفئات المستخدمة. المبادئ التوجيهية للكوكتيلات تشطر تتشابه الانقسامات التقليدية deprotection الببتيد ^1. عموما ، هناك حاجة الدقيقة 10 حضانات لمتواليات من دون حماية أو الجماعات أو متواليات مع عدد قليل من الجماعات عطوب حمض حماية عالية (مثل BOC ، trityl). وأوصى اثنين من حضانات ساعة لمتواليات أكثر صعوبة مع جماعات حماية (على سبيل المثال تي بوتيل استر ، MTR ، PBF) أو متواليات مع العديد من الجماعات لضمان حماية كاملة من كل deprotection السلسلة. والمنتجات الخام peptoid حل عموما في أسيتونتريل : 1:1 المياه (V / V) ، ولكن بنسب أعلى أسيتونتريل هي مشتركة مع سلاسل جنب مع hydrophobicity شامل عالية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
ثنائي ميثيل الفورماميد	EMD	EM - DX1726P - 1	99 + ٪
N - methylpyrrolidinone	BDH	BDH1141 - 4LP	99 ٪
Bromoacetic حمض	العضوية Acros	200000-106	99 ٪
4 - Methylpiperidine	سيغما الدريتش	M73206	96 ٪
N ، N' - diisopropylcarbodiimide	الكيميائي امبكس	001100	99.5 ٪
ثنائي كلورو ميثان	EMD	EMD - DX0835	ACS الصف
أسيتونتريل	EMD	EM - AX0145P - 1	99.8 ٪
Trifluoroacetic حمض	سيغما الدريتش	T6508	99 ٪
Triisopropylsilane	سيغما الدريتش	233781 --10G	لTFA تشطر
1،2 - ثنائي كلورو إيثان	JT بيكر	JTH076 - 33	لsiliconization من أوعية التفاعل الزجاج
الفينيثيلامين	سيغما الدريتش	407267 - 100ML	> 99.5 ٪ مسعور الجانب سلسلة الأمينات
BOC - الإيثيلنديامين	CNH تكنولوجيز	C - 1112	الموجبة الجانب سلسلة الأمينات
تي بوتيل بيتا ألانين حمض الهيدروكلوريك	الكيميائي امبكس الدولية	04407	أنيوني الجانب سلسلة الأمينات
α - Cyano - 4 - hydroxycinnamic حمض	سيغما الدريتش	C8982 - 10X10MG	لمصفوفة MALDI
النيل الأحمر	سيغما الدريتش	19123 - 10MG	لمضان التصوير
Dichlorodimethylsilane	سيغما الدريتش	80430 - F - 500G	لsiliconization من أوعية التفاعل الزجاج
PP المحتوى المتاح frittedالتلال	تطبيق فصل	2416	6 مل البولي بروبلين مع خرطوشة عيار 20 ملم PE فريت
3 الطريق المتاح luer محول	كول Parmer	31200-80	محبس لتجميع المتاح دليل عاء التفاعل
Luer قفل حلقة	كول Parmer	45503-19	¼ "يليق المتاح دليل التوليف عاء التفاعل
Luer التجهيزات	كول Parmer	45500-20	¼ "يليق المتاح دليل التوليف عاء التفاعل
PP المتاح pipets	VWR	16001-194	لنقل TFA
Luer المحاقن البلاستيكية قفل	العلم الوطني	S7515 - 5	6 مل المحاقن
1 قنينة زجاجية الدرام	VWR	66011-041	مع الفينول مصبوب سقف المسمار مع البولي فينيل التي تواجهها الخطوط الملاحية المنتظمة اللب
20 مل scintillation فيال	VWR	66022-060	مع غطاء PP المرفقة واللب احباط بطانة
آمن لاصقة هل ختم	Invitrogen	S - 24736	لمضان التصوير
الشرائح الزجاجية	الإلكترون المجهري العلوم	63411	لمضان التصوير
تغطية زلة	VWR	48366-067	لمضان التصوير
4 رقاقة سيليكون "	تيد بيلا	16007	قبل الزهر في رقائق ملم 5x7
0.45 فلتر	VWR ، Acrodisc	28143-924	لهبلك. السليكوون الغشاء
Agarose	دينار بحريني	212272	لمضان التصوير
SPE فراغ المنوع	سيغما الدريتش	57044	مثال متعددة فراغ SPE
Fritted الزجاج السفينة	الآس الزجاج	6402-12	المسامية Cفريت
البلازما الأنظف / معقم	Harrick البلازما	PDC - 32G	مثال على نظافة البلازما لإعداد رقائق السيليكون لوزارة شؤون المرأة